CHƢƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu
Nguyên liệu thô nên đƣợc kiểm tra trƣớc khi sử dụng vì trong sản phẩm rutin ln có tồn tại một lƣợng nhỏ quercetin. Phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đƣợc sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết của rutin thô so với rutin chuẩn. Tất cả các phân tích này đƣợc thực hiện bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC tại phịng thí nghiệm Kỹ thuật Hữu cơ, Đại học Bách Khoa Tp.HCM
Bảng 2.1:Bảng thông số vận hành trên hệ thống HPLC [18]
Cấu hình máy HPLC
Bộ phận khử khí, bơm cao áp, bình chứa dung mơi pha động, bộ phận tiêm mẫu, đầu dò mạng diod quang (DAD)
Pha tĩnh: Cột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm)
Pha động
Dung dịch acid phosphoric 0,3% khối lƣợng (kênh A), acetonitrile (kênh B) và methanol (kênh C)
Tốc độ dịng 1 ml/phút
Tỉ lệ dung mơi pha động (gradient elution) 0 – 12 phút: 95 – 80% A , 0 – 15 % B, 5 – 5% C 12 – 20 phút: 10% A , 75% B, 15% C 20 – 27 phút: 5% A , 80% B, 15% C 27 – 30 phút: 85% A, 15% B
19 Nhiệt độ hệ thống 40oC
Bƣớc sóng hấp thu Rutin: 254 nm, 360 nm Quercetin: 360 nm, 375 nm
Phƣơng trình đƣờng chuẩn của rutin đã đƣợc xây dựng để xác định hàm lƣợng rutin trong nguyên liệu. Do đó, bƣớc đầu tiên là xây dựng đƣờng chuẩn giữa nồng độ và diện tích peak của rutin chuẩn. Rutin chuẩn đƣợc pha trong methanol với các nồng độ chính xác. Bằng phân tích phổ HPLC, phƣơng trình đƣờng chuẩn miêu tả mối quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ rutin sẽ đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp bình phƣơng cực tiểu. Từ đó, độ tinh khiết của rutin nguyên liệu ban đầu sẽ đƣợc xác định.
Hàm lƣợng rutin trong ngun liệu sẽ đƣợc tính theo cơng thức sau: P % = Am x Cc
Ac x Cm x Pc (2.2) Trong đó, P: hàm lƣợng rutin trong nguyên liệu (%)
Pc: độ tinh khiết của rutin chuẩn (95%)
Cc: nồng độ của dung dịch rutin chuẩn trong methanol (mg/ml) Cm: nồng độ của dung dịch nguyên liệu trong methanol (mg/ml) Am: diện tích peak rutin của dung dịch nguyên liệu trong methanol.
Ac: diện tích peak rutin của dung dịch rutin chuẩn trong methanol, suy ra từ phƣơng trình đƣờng chuẩn (ứng với nồng độ của dung dịch nguyên liệu)
Ngồi ra, phƣơng trình đƣờng chuẩn của quercetin cũng đƣợc xây dựng bằng cách thức tƣơng tự để xác định lƣợng quercetin lẫn trong nguyên liệu.
20