ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượ ng nghiên c ứ u
2.1.1 Tiêu chu ẩ n l ự a ch ọ n ngườ i b ệ nh
Tại Bệnh viện Tim Hà Nội, 100 bệnh nhân mắc bệnh van tim đã được chỉ định thay van tim cơ học và tham gia cung cấp mẫu Việc lựa chọn bệnh nhân được thực hiện theo các tiêu chuẩn khuyến cáo của Hội Tim mạch học Việt Nam.
2.1.2 Các tiêu chu ẩ n lo ạ i tr ừ Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng; Huyết động không ổn định;
Người bệnh tai biến mạch não trong vòng 3 tháng, vừa trải qua phẫu thuật dưới 1 tuần, và có chống chỉ định sử dụng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu cần được đặc biệt lưu ý Họ có nguy cơ cao gặp phải tình trạng chảy máu, đồng thời có thể đang ở giai đoạn suy thận hoặc suy gan cuối Ngoài ra, việc không đồng ý tham gia nghiên cứu cũng là một yếu tố quan trọng cần xem xét.
2.1.3 Th ời gian và địa điể m nghiên c ứ u
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2018 Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học
Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega – Biotek); Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck); Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate (hãng Affymetrix); Nước khử ion (hãng Omega Bio-tek); 6X DNA loading dye (Thermo Scientific); Cặp mồi được đặt tổng hợp tại công ty Phusa Biochem (Việt Nam); dNTPMix 2mM mỗi loại (hãng Thermo Scientific); Phusion DNA Polymerase (hãng Thermo Scientific);
DNA marker 100bp-4kb (Lonza); Lamda/HindIII DNA Ladder (hãng Thermo Scientific)
The EBA 21 centrifuge by Hettich Zentrifugen from Germany, the VELP Scientifica shaker from Europe, and the Panasonic deep freezer from Japan are essential laboratory instruments Additionally, the NP 80 Nanophotometer from Implen, Germany, the Cole-Parmer electrophoresis system and gel imager from the USA, along with the Prime Thermal Cycler PCR machine from the UK, contribute significantly to advanced research and analysis in scientific settings.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thể hiện trong Hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu
2.3.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm
Đối với lượng mẫu, 2 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chia đều vào 3 ống chuyên dụng có chứa EDTA để chống đông, với mỗi ống cần tối thiểu 300 µL mẫu Mỗi ống mẫu sẽ cung cấp đủ lượng cần thiết cho các xét nghiệm.
Quá trình tách DNA tổng số được thực hiện một lần, đảm bảo luôn có mẫu lưu trữ để có thể lặp lại nếu cần thiết, cho đến khi xác định được kiểu gen của người bệnh.
Để bảo quản mẫu máu, cần giữ lạnh ở nhiệt độ từ -20 đến -30 độ C cho đến khi sử dụng Nếu không có tủ lạnh đạt -20 độ C, mẫu máu có thể được lưu trữ trong ngăn đá tủ lạnh thông thường hoặc trong đá không quá 1 ngày Lưu ý rằng mẫu không được phép rã đông trước khi tách DNA hoặc chuyển đến nơi có tủ lạnh -20 độ C để bảo quản.
Ống chứa máu cần có đầy đủ thông tin, bao gồm mã người bệnh, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được ghi chép cẩn thận trong sổ lưu trữ.
Tại Trường Đại học Y Dược và Dược phẩm, VNU, thông tin cần thiết bao gồm tên, tuổi, mã người bệnh, ngày lấy mẫu, cùng với tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
2.3.2 Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit
Các bước thao tác được tiến hành như sau:
Bước 1 Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng
Bước đầu tiên là lắc đều ống mẫu, sau đó chuyển 250 µL mẫu vào ống ly tâm Tiếp theo, thêm 25 µL dung dịch OB Protease và 250 µL BL Buffer, sau đó vortex trong 10 giây Để ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 65 độ C trong 10 phút, và sau 5 phút ủ, cần vortex thêm 15 giây Cuối cùng, thêm 260 µL ethanol 100% và vortex trong 20 giây.
Để đảm bảo mẫu không dính trên thành và nắp ống, hãy ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 15 giây Sau đó, chèn cột HiBind DNA Mini vào ống thu 2 mL và chuyển toàn bộ mẫu vào cột, sử dụng pipet ở mức 790 µL.
Bước 9 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 10 Bỏ dịch lọc và Collection Tube
Bước 11 Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2mL mới Bước 12 Thờm 500 àL HBC Buffer
Bước 13 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 14 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube Bước 15 Thờm 700 àL DNA Wash Buffer
Centrifuge for one minute at 14,000 RPM, then discard the supernatant while retaining the collection tube Repeat steps 14 to 16 for a second wash using the DNA Wash Buffer.
Để hoàn tất quy trình, bước 19 yêu cầu ly tâm HiBind DNA Mini Column ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 2 phút nhằm làm khô cột Tiếp theo, ở bước 20, chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2mL mới Cuối cùng, ở bước 21, thêm 100 µL Elution Buffer đã được làm ấm đến 65°C và ủ ở nhiệt độ này trong 5 phút.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Bước 22 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 23 Thờm 50 àL Elution Buffer trong 5 phỳt ở nhiệt độ phũng Bước 24 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
Bước 25 Thu và bảo quản DNA ở -20 o C
2.3.3 Khu ếch đại đoạ n gen đích ch ứ a CYP2C9*3 Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tôi tiến hành xác định nhiệt độ gắn mồi, nồng độ hoạt động tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng Phusion polymerase (Thermo Scientific) Đoạn mồi tự thiết kế được đặt tổng hợp tại Công ty Phusa Biochem (Việt Nam) có trình tự lần lượt là: mồi xuôi 5’
Trình tự DNA được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm GCA TCT GTA ACC ATC CTC TC 3’ và mồi ngược 5’ GTG TCA AGA TTC AGT TCT TTC C 3’ Thông tin này được tham khảo từ cơ sở dữ liệu của Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Mỹ (NCBI).
- NCBI), đoạn DNA nhân dòng có độ dài lý thuyết được xác định là 719 bp
2.3.4 Kiểm tra chất lượng DNA
Để đánh giá chất lượng DNA tổng số và sản phẩm PCR, chúng tôi sẽ sử dụng hai phương pháp như đã mô tả Một trong những phương pháp này là đo quang, giúp xác định độ tinh khiết và nồng độ của DNA.
Bước 1 Khởi động máy, chọn chế độ đo nồng độ DNA
Bước 2 Đo mẫu trắng: lấy 2 àL Elution buffer dựng để pha loóng DNA làm dung dịch đo mẫu trắng
Bước 3: Đo mẫu DNA bằng cách lấy 2 µL cho mỗi mẫu Máy sẽ tự động tính toán nồng độ và độ tinh khiết của DNA dựa trên giá trị OD 260 và OD 280 Để đánh giá chất lượng DNA, tiến hành điện di trên gel agarose.
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Cho 1,5 g agarose pha trong 100 ml đệm
Đun nóng TAE 1X trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội đến 50 – 60 độ C và đổ vào khay điện di đã cài sẵn răng lược để tạo giếng tra mẫu Sau khoảng 30 phút, khi gel đông lại, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di với giếng gần phía cực âm của máy Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di sao cho ngập cách mặt gel 1 – 2 mm.
Bước 2: Tra mẫu DNA: 5 àL mẫu DNA được trộn với 1 àL 6X DNA loading dye
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
DNA được tra vào mỗi giếng: Lamda/HindIII DNa Ladder với DNA tổng số và DNA marker 100bp-4kb (Lonza) với sản phẩm PCR
Bước 3: Chạy điện di với hiệu điện thế 100 V trong 40 phút
Sau khi kết thúc quá trình điện di, bước tiếp theo là quan sát kết quả Bản gel sẽ được lấy ra khỏi khuôn và được soi dưới ánh sáng tử ngoại trong hệ thống phân tích Gel-DocIt Các mẫu có chất lượng tốt sẽ hiển thị băng điện di sáng và rõ nét.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA
Tại Bệnh viện Tim Hà Nội, 100 mẫu máu toàn phần được thu thập từ tĩnh mạch của bệnh nhân sau phẫu thuật thay van tim có điều trị chống đông bằng acenocoumarol đã được tách chiết DNA tổng số thành công Kết quả điện di DNA tổng số từ 10 bệnh nhân đầu tiên cho thấy các băng DNA đều sáng rõ, như thể hiện ở Hình 3.1.
Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm nghiên cứu Làn 1-10: DNA tổng số của 10 người bệnh
Làn M: Thang DNA Lamda/HindIII được sử dụng để đánh giá chất lượng của 100 mẫu DNA Kết quả đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm được trình bày trong Bảng 3.1, với mỗi mẫu được đo hai lần để lấy giá trị trung bình Nồng độ DNA thu hồi dao động từ 41,15 đến
Mẫu DNA có độ tinh sạch cao với nồng độ trung bình là 111,0 ± 47,7 ng/µL, trong đó 90/100 mẫu có chỉ số OD nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,2 Tỉ số OD 260/280 trung bình đạt 2,02 ± 0,01, cho thấy các mẫu này tương đối sạch Điều này chứng tỏ rằng DNA được tách chiết đạt yêu cầu cho phản ứng khuếch đại DNA bằng PCR tiếp theo.
Bảng 3.1 Kết quả nồng độvà độ tinh sạch của DNA tổng số
Chỉ số Giá trị trung bình ± sai số SE
Nồng độ DNA (ng/àL) 111,0 ± 47,7
Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3
Để đạt được quy trình nhân dòng CYP2C9 hiệu quả và ổn định, cần tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA và nồng độ hoạt động của mồi.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
3.2.1 T ối ưu nhiệt độ g ắ n m ồ i v ớ i enzym Phusion Polymerase
Kết quả thử nghiệm 10 nhiệt độ dao động quanh nhiệt độ gắn mồi được hãng khuyến cáo cho thấy rằng ở dải nhiệt độ từ 50,8-56,6 o C xuất hiện các băng điện di không đặc hiệu, trong khi ở nhiệt độ 67,2 - 69,0 o C, băng điện di giảm độ sáng hoặc không xuất hiện Ngược lại, dải nhiệt độ từ 58,8 - 65,5 o C cho băng điện di đặc hiệu và sáng rõ nhất Do đó, nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dòng đoạn gen chứa CYP2C9*3 được chọn trong khoảng 58,8 - 65,5 o C, cho phép thực hiện nhiều phản ứng nhân dòng các gen khác nhau với chu trình nhiệt trùng nhau.
Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dòng alen CYP2C9*3 Làn M: DNA marker 100bp-4kb
Làn (-): đối chứng âm Làn (+): đối chứng dương.
3.2.2 T ối ưu nồng độ m ồ i và n ồng độ DNA
Kết quả điện di trên gel agarose 1,5% cho thấy sự tối ưu trong thí nghiệm PCR với nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) để nhân dòng alen CYP2C9*3 Làn M biểu thị DNA marker 100bp-4kb, trong khi làn ĐC (-) là đối chứng âm.
Thực hiện PCR ở các nồng độ DNA lần lượt là: 5, 10, 50, 100 và 200 ng/μl cho kết quả điện di như ở Hình 3.3 Nồng độ DNA cho lên băng kích thước rõ
Tại Trường Đại học Y Dược, VNU, nghiên cứu cho thấy phương pháp PCR có độ nhạy cao, có khả năng nhân dòng đoạn gen với nồng độ DNA rất thấp, từ 5-200 ng/μl Kết quả từ hình 3.3 chỉ ra rằng với nồng độ mồi 0,5 μM, băng điện di xuất hiện rõ ràng ở kích thước 719 bp như lý thuyết mà không có băng phụ Do đó, nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng nhân dòng CYP2C9*3 nằm trong khoảng 5-200 ng/μl, trong khi nồng độ mồi tối ưu là 0,5 μM Các thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen CYP2C9*3 đã được tối ưu hóa và được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen CYP2C9*3
Thành phần Nồng độ hoạt động
Thể tích phản ứng (30 àl) Điều kiện phản ứng
DNA khuụn 100 ng/àl 1,5 - Biến tớnh:
72 0 C – 2 phút dNTP mix 2 mM 0,2 mM 3,0
Hình 3.4 trình bày kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel agarose 1,5%, với làn M là DNA marker 100bp-4kb, và các làn 1-3 là sản phẩm PCR từ 3 mẫu người bệnh, trong khi làn 4 là đối chứng âm Qua quy trình nghiên cứu, 100 người bệnh tham gia đều có kết quả nhân dòng thành công đoạn gen chứa đa hình CYP2C9*3, với sản phẩm thu được ổn định và đặc hiệu, thể hiện bằng một băng sáng rõ như minh họa trong Hình 3.4 Tất cả các thí nghiệm đều đạt kết quả tốt.
Tại Trường Y Dược, ĐHQGHN, kết quả đối chứng âm cho thấy phản ứng PCR không bị nhiễm trong quá trình thao tác.
Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3
Kết quả giải trình tự trong nghiên cứu cho thấy không có bệnh nhân nào mang kiểu gen đồng hợp đột biến CC Tần số alen và tần số kiểu gen được trình bày chi tiết trong bảng.
AA (đồng hợp tử kiểu dại)
(đồng hợp tử đột biến)
Hình 3.5 Kiểu gen CYP2C9*3 xác định thông qua giải trình tự
Bảng 3.3 Kết quả tần số alenvà tần số kiểu gen CYP2C9*3
SNP Tần sốkiểu gen (%) Tần số alen
CC AC AA A C Giá trị p
Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C9*3 trên 100 mẫu cho thấy 96% là kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA, trong khi chỉ có 4% người bệnh mang kiểu gen dị hợp tử AC Từ đó, tần số xuất hiện của alen C được xác định là 0,02.
Kết quả nghiên cứu cho thấy tần số các alen thu được là 0,98, với kiểm định X² = 0,0416 và giá trị p = 0,84 Điều này chứng tỏ rằng tần số alen phù hợp với định luật Hardy-Weinberg, cho thấy cấu trúc di truyền của các alen này có thể đã ổn định trong nhóm mẫu nghiên cứu.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
BÀN LUẬN
So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau
Theo kết quả của dự án 1000 genome giai đoạn 3 đã được công bố [49], tần số alen C tại các quần thể được báo cáo và thể hiện trong Hình 4.1
Hình 4.1 Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người Tần số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số 48
Biểu đồ phân bố alen C cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các quần thể người Tần số alen C ở người Châu Phi rất thấp, chỉ khoảng 0,2%, trong khi ở Châu Âu, con số này tăng lên hơn 7% Đặc biệt, khu vực Nam Á ghi nhận tần số alen C cao nhất, vượt quá 10% Đông Á có tần số alen C gần giống nhất với nghiên cứu của tôi, điều này có thể được lý giải bởi sự gần gũi về mặt địa lý.
Nghiên cứu của tôi cho thấy tần số alen C ở nhóm bệnh là 2%, trong khi ở quần thể người bình thường tại Tp Hồ Chí Minh là 3,5% [49] Tuy nhiên, sự khác biệt giữa hai nhóm này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Điều này cho thấy đột biến CYP2C9*3 không phải là đột biến gây bệnh, mà là đột biến liên quan đến chuyển hóa thuốc, dẫn đến việc không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhóm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy alen A chiếm tỉ lệ rất lớn trong quần thể với 98
Kiểu gen chuyển hóa bình thường AA chiếm 96%, trong khi kiểu gen chuyển hóa chậm AC chỉ có 4%, và không có kiểu gen CC, cho thấy khả năng đáp ứng thuốc chống đông kháng vitamin K ở người Việt Nam là tương đối tốt.
Châu Mỹ Châu Phi Châu Âu Nam Á Đông Á
Tp Hồ Chí Minh Nghiên cứu này
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay
Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định kiểu gen của đa hình di truyền như giải trình tự gen, kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) và PCR định lượng (Realtim PCR) Trong số đó, giải trình tự gen vẫn là phương pháp phổ biến nhất, đặc biệt cho các gen mới và các thông tin di truyền liên quan đến đột biến Phương pháp này ngày càng được ưa chuộng nhờ vào sự phát triển kỹ thuật và chi phí ngày càng giảm.
Có thể nói hiện nay giải trình tự vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm tại Việt Nam
Hình 4.2 Nguyên lý của phương pháp PCR-CTPP a: độ dài của alen X; b: độ dài của alen Y; c = a + b - (d - 1): độ dài giữa mồi 1F và 2R; d: tổng chiều dài của 2 mồi 2F và 1R [41]
Ngoài giải trình tự, nhiều phương pháp phân tích CYP2C9*3 đã được thực hiện bởi các nhóm nghiên cứu toàn cầu Nghiên cứu của Tamura và cộng sự (2014) tại Nhật Bản đã áp dụng phương pháp phản ứng chuỗi polymerase với các cặp mồi kép (PCR-CPTT) để phân tích đa hình CYP2C9*3 Phương pháp này dựa trên việc nhân dòng gen với 4 đoạn mồi (2 cặp mồi) F1, R1 cho alen X và F2, R2 cho alen Y, tạo ra 3 đoạn DNA có kích thước khác nhau Chu trình nhiệt được sử dụng bao gồm các bước biến tính và khuếch đại với nhiệt độ và thời gian cụ thể Kết quả điện di đã xác định được 3 kiểu gen khác nhau.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Kỹ thuật phân tích gen bằng phương pháp PCR cho kết quả với ba băng kích thước 125, 200 và 287 bp, trong đó kiểu gen *3/*3 (hay CC) hiển thị hai băng 200 và 287 bp Tuy nhiên, để đạt được kết quả chính xác, kỹ thuật viên cần có trình độ thao tác cao, vì nếu phản ứng PCR không ổn định, kết quả sẽ bị ảnh hưởng.
Realtime PCR, hay còn gọi là PCR định lượng (qPCR), là một kỹ thuật tiên tiến dựa trên phản ứng PCR, ngày càng được áp dụng rộng rãi Kỹ thuật này cho phép người thực hiện theo dõi sự khuếch đại của phân tử DNA đích sau mỗi chu kỳ nhiệt, thay vì chỉ ở cuối phản ứng như phương pháp PCR truyền thống Realtime PCR sử dụng chất phát huỳnh quang để cung cấp dữ liệu chính xác hơn về quá trình khuếch đại DNA.
Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện trong quá trình bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi DNA Nhiều nghiên cứu đã áp dụng qPCR để xác định kiểu gen CYP2C9*3, như nghiên cứu của Sangviroon tại Đại học Chulalongkorn, Thái Lan, sử dụng đầu dò phát huỳnh quang fluorogen Một nghiên cứu khác ở Mỹ đã phân tích 75 bệnh nhân trẻ tuổi để phát hiện kiểu gen này, trong khi nghiên cứu của Chen Jiyang trên 257 bệnh nhân Trung Quốc cũng sử dụng qPCR Tuy nhiên, chi phí đầu tư ban đầu cho hệ thống Realtime PCR và hóa chất tiêu hao tương đối cao, đồng thời phương pháp này yêu cầu kỹ thuật viên có kiến thức và kỹ năng phân tích phức tạp.
Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol
Nghiên cứu của nhóm dược lý thuộc Hiệp hội dược sĩ Hoàng gia Hà Lan đã đưa ra khuyến cáo về liều thuốc chống đông kháng vitamin K dựa trên kiểu gen CYP2C9 Cụ thể, nếu bệnh nhân có alen CYP2C9*3, cần giảm 20% liều acenocoumarol ban đầu, trong khi alen *2 chỉ cần giảm 1% Sự khác biệt này cho thấy alen *3 có ảnh hưởng lớn hơn *2 trong việc chỉ định liều dùng Nghiên cứu của Visser cũng xác nhận rằng bệnh nhân mang 1 alen *3 nên giảm 20% liều, trong khi với 1 alen *2, liều nên giảm 13%.
Nghiên cứu cho thấy rằng khi có sự hiện diện của cả hai alen *2 và *3, mức độ giảm liều có thể lên tới 40% Đồng thời, một nghiên cứu khác của Visser chỉ ra rằng người bệnh mang hai alen này có nguy cơ chảy máu cao gấp 1,83 lần so với những người không mang alen *2 và *3.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Bảng 4.1 Mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 *3 tới chỉ định liều Acenocoumarol và nguy cơ chảy máu của một số nhóm nghiên cứu Hà Lan
Tài liệu tham khảo Sốngười tham gia Mối liên quan
Schalekamp, 2004 [39] 231 Giảm liều khi mang 1 alen: *2: 1 %, *3: 20 %
Visser, 2004 [47] 996 Nguy cơ chảy máu tăng 1,83 khi mang alen
Bảng 4.2 Các biến trong thuật toán tính liều acenocoumarol ở nhóm nghiên cứu người Tây Ban Nha [13]
Sử dụng thuốc cảm ứng hoạt hoá enzym CYP2C9 0,119
Một nghiên cứu về thuật toán định lượng liều acenocoumarol đã được thực hiện trên 147 bệnh nhân người Tây Ban Nha Dựa vào các biến và ảnh hưởng được mô tả trong Bảng 4.2, bác sĩ sẽ xác định liều khởi đầu phù hợp cho từng bệnh nhân dựa trên các khuyến nghị.
Nghiên cứu tại Trường Đại học Y Dược, VNU cho thấy biến thể CYP2C9*3 ảnh hưởng đến việc định liều acenocoumarol Ngoài ra, các yếu tố như tuổi tác, cân nặng, chiều cao (chỉ số BMI), tình trạng sử dụng thuốc cảm ứng enzym CYP2C9, amiodarone, sự hiện diện của alen CYP2C9*1 và *2, kiểu gen VKORC1, CYP4F2 và APOE cũng cần được nghiên cứu Trong nhóm bệnh nhân có các đặc điểm lâm sàng tương đồng, thuật toán dự đoán liều ổn định chính xác 59,8% trường hợp, cao hơn so với 37,6% nếu chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng.
Một thuật toán chi tiết đã được xây dựng cho nhóm 100 bệnh nhân Bắc Ấn Độ, dựa trên các yếu tố ảnh hưởng đến liều thuốc và mức độ của chúng Thuật toán này cung cấp cách tính liều một cách cụ thể và chính xác.
Liều lượng thuốc được tính toán bằng công thức: 3,082 - 0,013 x (tình trạng hút thuốc) - 0,433 x (giới tính) - 0,004 x (tuổi) + chỉ định x (0,327 cho người bệnh thay van đôi và - 0,092 cho người bệnh thay van động mạch chủ) + 0,026 x (chiều cao) + 0,151 x (trọng lượng) - 7,660 x (diện tích bề mặt cơ thể) - 0,862 x (VKORC1 AG) - 2,257 x (VKORC1 AA) - 0,049 x (CYP2C9 * 1 / *) Công thức này giúp xác định liều lượng thuốc phù hợp dựa trên các yếu tố cá nhân như tình trạng hút thuốc, giới tính, tuổi tác, chiều cao, trọng lượng và các gen di truyền liên quan.
2 ) – 0,456 x (CYP2C9 * 1 / * 3) + 0,449 x (CYP4F2 AG) + 0,230 x (CYP4F2 AA)
Bảng 4.3 So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật toán của các nhóm nghiên cứu khác nhau THUẬT TOÁN LIỀU TRUNG BÌNH (mg/tuần)
Liều điều trị khuyến cáo 21,31 ± 8,35 Nghiên cứu Bắc Ấn Độ [35] 21,16 ± 4,82 Nhóm nghiên cứu Thổ Nhĩ Kỳ [33] 27,16 ± 1,19 Nhóm nghiên cứu Trung Quốc [48] 27,87 ± 4,94
Thuật toán dược động học của Ấn Độ cho thấy có 41,4% bệnh nhân cần điều chỉnh liều (p < 0,001) Khi so sánh liều dự đoán với liều điều trị thực tế tại bệnh viện, kết quả cho thấy khả năng dự đoán của thuật toán này vượt trội hơn so với các thuật toán trước đó được phát triển vào năm 2008 dựa trên các biến tương tự.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Bảng 4.3 cho thấy rằng số lượng biến lớn hơn và mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố được xem xét một cách kỹ lưỡng, cùng với việc phân loại cẩn thận, là những yếu tố giải thích cho kết quả này.
Trong việc so sánh các thuật toán dự đoán liều acenocoumarol, nhiều yếu tố như chiều cao, cân nặng và kiểu gen có ảnh hưởng đáng kể đến liều điều trị Kết quả từ các thuật toán dược động học cho thấy khả năng dự đoán liều nhanh chóng và chính xác hơn so với việc chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng hay chỉ số cận lâm sàng Nghiên cứu này là nền tảng cho y học cá thể hóa, nhằm nâng cao chất lượng điều trị cho từng bệnh nhân Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến liều điều trị có sự khác biệt giữa các nhóm bệnh nhân Do đó, tôi đề xuất nghiên cứu để xác lập thuật toán phù hợp cho bệnh nhân Việt Nam, hướng tới việc định liều thuốc cá nhân hóa trong tương lai.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
KẾT LUẬNVÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Dựa vào những kết quả đạt được, tôi đưa ra một số kết luận như sau:
- Quy trình phân tích kiểu gen CYP2C9*3 sử dụng mẫu máu toàn phần đã được xây dựng thành công
Quy trình phân tích gen CYP2C9*3 đã được áp dụng thành công trên 100 bệnh nhân sử dụng thuốc chống đông acenocoumarol sau khi thay van tim tại Bệnh viện Tim Hà Nội Kết quả cho thấy tỷ lệ kiểu gen AA chiếm 96% và kiểu gen AC chiếm 4%, trong khi tần số đột biến C là 0,02.
Hướng tới y học cá thể hóa trong điều trị, nhằm nâng cao chất lượng chăm sóc cho người bệnh và giảm thiểu nguy cơ biến chứng, tôi xin đưa ra một số kiến nghị quan trọng.
Nghiên cứu mở rộng về kiểu gen CYP2C9*3 với cỡ mẫu lớn hơn là cần thiết để xác định mức độ ảnh hưởng của gen này đối với quá trình chuyển hóa acenocoumarol.
Phân tích tác động của các yếu tố như chiều cao, cân nặng, độ tuổi và các gen mới là cần thiết để xây dựng thuật toán định lượng liều acenocoumarol phù hợp cho bệnh nhân Việt Nam.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), "Phân tích gen và sản phẩm của gen", Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội
2 Hội Tim mạch (2008), Khuyến cáo 2008 của Hội tim mạch Việt Nam về chẩn đoán điều trị các bệnh van tim
3 Lê Thị Nhiên (2016), “ Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 ở người bệnh đặt Stent động mạch vành qua da”, Luận văn Thạc sĩ Dược học Đại học Dược Hà Nội
4 Nguyễn Lân Việt (2003), Thực hành bệnh tim mạch, Nhà xuất bản Y học
5 Phạm Hùng Vân (2009), "Real-time PCR Các vấn đề cơ bản", PCR và realtime PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học,
6 Phạm Thị Minh Đức (2011), “ Sinh lý máu”, Sinh lý học, NXB Y học
7 Tạ Thành Văn (2010), "Realtime PCR và PCR định lượng", PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, NXB Y học, 33-66
8 Võ Thị Thương Lan (2007), "Phản ứng PCR", Một số vấn đề của sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 86-88
9 Abhijit Trailokya, JS Hiremath, JPS Sawhney và các cộng sự (2016),
“Acenocoumarol; A Review of Anticoagulant Efficacy and Safety”, Journal of The Association of Physiccian of India, 64
10 Alec Vahanican, Ottavio Alfrieri, Felicita Andreotti và các cộng sự (2012),
“Guideline onthe management of valvular heart disease”, European Heart
11 Ansell J, Hirsh J, Hylek E và các cộng sự (2008), “ Pharmacology and management of the vitamin K antagonists: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition)”,
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
