ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện với 100 bệnh nhân từ Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện 74 Trung Ương và Bệnh viện Phổi Hà Nội, tất cả đều có AFB dương tính với lao phổi (bao gồm cả lao mới và tái trị) Những bệnh nhân này được điều trị bằng các thuốc chống lao hàng 1 theo phác đồ của Chương trình Chống lao Quốc gia Việt Nam năm 2017 và đã tự nguyện tham gia nghiên cứu.
Tiêu chuẩn loại trừ bao gồm phụ nữ đang mang thai và cho con bú, cùng với những bệnh nhân không có sự phát triển của khuẩn lạc trong quá trình nuôi cấy nhằm xác định các thông số dược động học.
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 6 năm 2017 đến tháng 9 năm 2018 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Hóa chất dùng cho tách DNA tổng số: E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega-Biotek)
Hóa chất dùng cho điện di: Ethylene Diamine Tetra Acetic Axit (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix), TAE 1X, 5X DNA loading dye (hãng
ThermoScientific), Oˈ GeneRuler 50 bp DNA Ladder (hãng Thermo Scientific) ,
Oˈ GeneRuler 1kb DNA Ladder (hãng ThermoScientific), Lambda DNA/HindIII
Marker (hãng ThermoScientific), Tris base (hãng Bio basic), axit acetic (hãng Merck)
Hóa chất sử dụng cho PCR bao gồm cặp mồi được tổng hợp từ hãng Phusa-biochem (Việt Nam) Trình tự mồi này đã được áp dụng trong một số nghiên cứu trước đây với mã 5'-GGA ACA.
AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3' [18, 34], nước khử ion (hãng Omega Biotek), Kapa2G T M Robust HotStart ReadyMix (2X) (hãng
Hóa chất dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR: E.Z.N.A.® CyclePure Kit (hãng Omega-biotek)
Hóa chất dùng cho PCR-RFLP: nước khử ion (hãng Omega Biotek), enzym cắt FastDigest KpnI, FastDigest BamHI, FastDigest TaqI (hãng ThermoScientific)
Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It - Mỹ), hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd
- Mỹ), máy PCR (Prime Thermal Cycler - Anh), tủ an toàn sinh học (ESCO - Đức),
The School of Medicine and Pharmacy at VNU utilizes advanced laboratory equipment, including the EBA 21 centrifuge from Hettich Zentrifugen in Europe, the VELP shaker from Scientifica, the NP80 spectrophotometer from Nanophotometer in Germany, and Fiocchetti flake ice machines.
- Anh), tủ ấm (Panasonic - Nhật bản), tủ lạnh sâu -30 o C (Panasonic - Nhật Bản), tủ mát
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện qua 6 bước chính: (1) thu thập mẫu sinh phẩm; (2) tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số; (3) nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng phương pháp PCR; (4) tinh sạch sản phẩm PCR; (5) xác định kiểu gen thông qua PCR-RFLP hoặc giải trình tự; và (6) phân tích kết quả.
Hình 2 1 Các bước tiến hành nghiên cứu
Tách chiết DNA tổng số
PCR nhân dòng đoạn gen NAT2
Xác định kiểu gen thông qua RFLP và giải trình tự tự
Thu thập100 mẫu máu BN lao
Tinh sạch sản phẩm PCR
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Mỗi người bệnh cung cấp 2mL mẫu máu toàn phần lưu trong ống có chứa EDTA, bảo quản ở - 20 o C cho đến khi sử dụng
Thông tin mẫu máu của bệnh nhân được ghi chép trong sổ thí nghiệm, bao gồm các dữ liệu quan trọng như tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
2.2.2 Tách chiết DNA tổng số
Tách DNA tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng
Phương pháp tách chiết axit nucleic dựa vào sự hấp thụ chọn lọc vào màng silica-gel, bao gồm bốn bước chính: ly giải mẫu, gắn DNA vào màng silica, rửa sạch tạp chất và cuối cùng là giải phóng cũng như thu hồi DNA.
Quá trình ly giải là bước quan trọng để phá vỡ tế bào và giải phóng DNA Trong dung dịch chất ly giải, các muối hoạt động bề mặt có nồng độ cao giúp làm mất ổn định các liên kết hydro và tương tác kị nước, tạo điều kiện cho DNA gắn vào màng silica Sự gắn kết này diễn ra nhờ sự có mặt của cồn như ethanol hoặc isopropanol Tiếp theo, quá trình rửa loại bỏ tạp chất trên màng silica gel thông qua dung dịch chứa muối hoạt động bề mặt cao, sau đó sử dụng ethanol để loại bỏ muối Cuối cùng, DNA được giải phóng và thu hồi, đảm bảo trên màng silica chỉ còn DNA đã được làm khô qua ly tâm.
Bằng cách sử dụng dung dịch muối phù hợp, thường là Tris 10 mM ở pH 8 hoặc 9,
DNA sẽ hòa tan vào muối Cuối cùng sau khi chắc chắn DNA đã hòa tan, các cột sẽ được li tâm để thu DNA [27]
Hình 2 2 Nguyên lý tách DNA tổng số bằng kit [33]
(1) Ly giải (2) Gắn DNA vào màng
(4) Giải phóng và thu DNA
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA tổng số thu được được điện di trên gel agarose 1,2%, đệm TAE 1X Trộn
Trong quy trình điện di DNA, 4 µL DNA được trộn với 1 µL 5X DNA loading Dye có chứa Ethidium bromide (50 µg/mL) trước khi đưa vào mẫu Điện di được thực hiện ở hiệu điện thế 84 volt trong 40 phút, sử dụng thang chuẩn DNA λ/HindIII ladder, và các băng DNA được quan sát dưới ánh sáng UV Để xác định nồng độ và độ tinh khiết của DNA tách chiết, mật độ hấp thụ quang được đo ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) DNA được coi là có độ tinh khiết cao khi giá trị OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
Phương pháp đo mật độ quang dựa trên việc axit nucleic có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm, nhờ vào sự hiện diện của base purin và base pyrimidin Để xác định nồng độ DNA, cần đo giá trị mật độ quang tại OD260, với một đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ 50 ng/ml cho dung dịch DNA sợi đôi Bên cạnh đó, đo ở bước sóng OD280 (mức hấp thụ cực đại của protein) và tính tỉ lệ OD260/OD280 giúp đánh giá độ tinh khiết của DNA Các mẫu cần được đo ít nhất hai lần ở bước sóng 260 và 280 nm để lấy giá trị trung bình xác định nồng độ DNA.
2.2.3 Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
Dựa trên dữ liệu từ NCBI, gen NAT2 kiểu dại dài 1093 bp đã được khuếch đại thông qua phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với trình tự lý thuyết như được trình bày trong Hình 2.3 [62].
1 GGAACAAATT GGACTTGGAA ACATTAACTG ACATTCTTGA GCACCAGATC CGGGCTGTTC CCTTTGAGAA CCTTAACATG
81 CATTGTGGGC AAGCCATGGA GTTGGGCTTA GAGGCTATTT TTGATCACAT TGTAAGAAGA AACCGGGGTG GGTGGTGTCT
161 CCAGGTCAAT CAACTTCTGT ACTGGGCTCT GACCACAATC GGTTTTCAGA CCACAATGTT AGGAGGGTAT TTTTACATCC
241 CTCCAGTTAA CAAATACAGC ACTGGCATGG TTCACCTTCT CCTGCAGGTG ACCATTGACG GCAGGAATTA CATTG TCGAT
321 GCTGGGTCTG GAAGCTCCTC CCAGATGTGG CAGCCTCTAG AATTAATTTC TGGGAAGGAT CAGCCTCAGG TGCCTTGCAT
401 TTTCTGCTTG ACAGAAGAGA GAGGAATCTG GTACCTGGAC CAAATCAGGA GAGAGCAGTA TATTACAAAC AAAGAATTTC
481 TTAATTCTCA TCTCCTGCCA AAGAAGAAAC ACCAAAAAAT ATACTTATTT ACGCTTGAAC CTCGAACAAT TGAAGATTTT
561 GAGTCTATGA ATACATACCT GCAGACGTCT CCAACATCTT CATTTATAAC CACATCATTT TGTTCCTTGC AGACCCCAGA
641 AGGGGTTTAC TGTTTGGTGG GCTTCATCCT CACCTATAGA AAATTCAATT ATAAAGACAA TACAGATCTG GTCGAGTTTA
721 AAACTCTCAC TGAGGAAGAG GTTGAAGAAG TGCTGAGAAA TATATTTAAG ATTTCCTTGG GGAGAAATCT CGTGCCCAAA
801 CCTGGTGATG GATCCCTTAC TATTTAGAAT AAGGAACAAA ATAAACCCTT GTGTATGTAT CACCCAACTC ACTAATTATC
881 AACTTATGTG CTATCAGATA TCCTCTCTAC CCTCACGTTA TTTTGAAGAA AATCCTAAAC ATCAAATACT TTCATCCATA
961 AAAATGTCAG CATTTATTAA AAAACAATAA CTTTTTAAAG AAACATAAGG ACACATTTTC AAATTAATAA AAATAAAGGC
1041 ATTTTAAGGA TGGCCTGTGA TTATCTTGGG AAGCAGAGTG ATTCATGCTA GA
Để xác định kiểu alen của đoạn gen NAT2, chúng tôi đã thực hiện quy trình nhân dòng với các thí nghiệm tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Sản phẩm PCR sau đó được đánh giá chất lượng trên gel agarose 1,5%, sử dụng thang chuẩn O’ GeneRuler DNA.
Ladder để xác định kích thước sản phẩm Tất cả các phản ứng đều sử dụng đối chứng âm để đảm bảo mẫu không bị ngoại nhiễm
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng E.Z.N.A.® CyclePure Kit theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất, với nguyên lý loại bỏ mồi, muối và tạp chất từ mẫu DNA thông qua cột silica gel, tương tự như phương pháp tách chiết DNA đã được đề cập.
2.2.5 Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được pha loãng đến nồng độ 100 ng/µL để sử dụng cho phản ứng cắt Để thực hiện phản ứng cắt, chúng tôi đã sử dụng enzym FastDigest KpnI.
FastDigest TaqI và FastDigest BamI được sử dụng để cắt ba alen NAT2*5, *6, *7 Dựa vào vị trí cắt của enzym trên gen NAT2, kích thước các băng điện di dự kiến cho từng kiểu gen sẽ được thể hiện trong hình.
2.4 mô tả Alen NAT2*5 (c.341T > C) không có vị trí nhận biết của enzym cắt, tuy nhiên lại liên kết chặt chẽ với c.481C > T có vị trí nhận biết của KpnI Chính vì vậy, kiểu gen NAT2*5 được xác định thông qua kiểu gen của c.481C > T Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt được trình bày trong Bảng 2.1
Bảng 2 1 Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt Thành phần
Thể tích 1 phản ứng (10 àL) Điều kiện cắt Đệm 10X 1 àL Ủ 5 phút ở 37 ˚C, bất hoạt
DNA khuụn 100 ng/àL 3,5 àL
Hình 2.4 trình bày kết quả dự kiến về việc cắt alen NAT2*5, NAT2*6 và NAT2*7 Các ký hiệu trong hình bao gồm: TT đại diện cho đồng hợp tử kiểu dại, CT cho dị hợp tử, CC cho đồng hợp tử đột biến, GG cho đồng hợp tử kiểu dại, AG cho dị hợp tử, và AA cho đồng hợp tử đột biến.
Chiều dài đoạn gen ước tính sau khi cắt alen NAT2*5 và NAT2*7 lớn hơn
200bp và các đoạn gen có chiều dài khác biệt trên 200 bp, vì vậy tiến sản phẩm cắt 2
Bài viết mô tả quy trình điện di sản phẩm cắt NAT2*6 trên gel agarose 2% với thang chuẩn O’ GeneRuler 1kb DNA ladder (ThermoScientific) và quan sát dưới ánh sáng UV Chiều dài ước tính của sản phẩm nhỏ hơn 400 bp, với các đoạn gen cách nhau ít nhất 15 bp Do đó, chúng tôi đã tiến hành điện di trên gel acrylamide 10%, sử dụng thang chuẩn O’ GeneRuler 50bp DNA ladder để thu được hình ảnh rõ nét hơn, sau đó áp dụng phương pháp nhuộm bạc để hiện hình sản phẩm.
2.2.6 Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp giải trình tự
20 sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose và tinh sạch bằng kit sẽ được gửi đến hãng First Base (Malaysia) để thực hiện giải trình tự với cùng một mồi cho đoạn gen NAT2 Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.1.9 để xác định kiểu gen của từng bệnh nhân.
Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu lâm sàng phải tuân thủ các quy định đạo đức của Bộ Y tế, đảm bảo người bệnh được thông báo đầy đủ về mục đích, lợi ích và những tác động bất lợi có thể xảy ra Người tham gia sẽ ký vào bản đồng thuận và có quyền rút lui bất cứ lúc nào Thông tin cá nhân của người bệnh được bảo mật tuyệt đối và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu.
Nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội phê duyệt trước khi tiến hành Tất cả mẫu bệnh án và phiếu xác nhận tự nguyện tham gia nghiên cứu của bệnh nhân đã được thu thập đầy đủ.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tách chiết DNA tổng số
Mẫu máu từ 100 bệnh nhân đã được tách DNA bằng bộ kit của Omega, sử dụng phương pháp tách chiết điện di trên gel agarose 1,2% Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách chiết đạt chất lượng tốt.
Các sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của bệnh nhân đều thể hiện một băng DNA rõ nét và có chất lượng tốt, như thể hiện trong Hình 3.1.
DNA từ các mẫu khác nhau cho thấy tính đồng đều và ổn định, điều này được thể hiện qua các băng điện di có độ sáng cao, tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn.
Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở 260 nm cho thấy nồng độ DNA tổng số dao động từ 20 - 230 ng/µL, với chỉ số OD260/OD280 chủ yếu nằm trong khoảng 1,6 đến 2,2 Thông tin chi tiết về từng mẫu có thể được tham khảo trong Phụ lục 2.
DNA tổng số thu được có độ bền cao, ít bị đứt gãy, với một băng duy nhất, đảm bảo tính tinh sạch và đủ điều kiện cho các phản ứng nhân dòng tiếp theo.
Hình 3 1 Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2% Làn M1: thang chuẩn
DNA λ/HindIII; Làn 1 – 12: sản phẩm DNA tổng số của 12 mẫu nghiên cứu.
Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
3.2.1 Tối ưu quy trình PCR
Khi thực hiện PCR, tối ưu nhiệt độ gắn mồi là yếu tố then chốt để đạt hiệu suất cao nhất Chúng tôi đã thử nghiệm PCR ở 10 nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 51,1 °C đến 59,9 °C Đồng thời, nồng độ DNA nhân dòng tối ưu được xác định từ các mức nồng độ 25, 50, 84, 150, 200 và 250 ng/µL.
Kết quả điện di trong Hình 3.2A cho thấy rằng ở nhiệt độ gắn mồi từ 57,8 o C đến 58,9 o C, sản phẩm PCR tạo ra băng đặc hiệu, rõ nét với kích thước phù hợp theo lý thuyết.
(1093 bp).Tuy nhiên, tại nhiệt độ gắn mồi 52,6 o C đến 55,8 o C có xuất hiện băng phụ, còn tại nhiệt độ 52,6 o C; 53,6 o C; 59,5 o C và 59,9 o C các băng xuất hiện mờ, không rõ nét
Nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 58 o C, cho phép tạo ra băng sáng nhất, rõ nét và không có băng phụ, do đó được lựa chọn cho các phản ứng tiếp theo Kết quả cho thấy nồng độ đạt tối ưu.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA trên Hình 3.2B cho thấy rằng PCR đạt hiệu quả tốt nhất với nồng độ từ 150-250 ng/µL Tuy nhiên, ở nồng độ 150 ng/µL và 250 ng/µL, băng sỏng mờ xuất hiện, trong khi nồng độ 200 ng/µL cho băng sáng rõ nét và không có băng phụ Do đó, nồng độ 200 ng/µL được chọn là nồng độ tối ưu.
Hình 3.2 trình bày kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 trên gel agarose 1,5% Phần (A) cho thấy kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi, trong khi phần (B) thể hiện kết quả tối ưu nồng độ DNA Làn M là thang chuẩn kích thước DNA 1kb và làn (-) là đối chứng âm.
3.3.2 Nhân dòng gen NAT2 của 100 mẫu nghiên cứu
Nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc nhân dòng 100 sản phẩm gen NAT2, sử dụng điều kiện tối ưu với thành phần và chu trình nhiệt như đã nêu trong Bảng 3.1 Hình 3.3 minh chứng cho kết quả điện di của 10 mẫu đầu tiên, cho thấy băng sáng rõ nét, phản ánh hiệu suất và độ đặc hiệu cao của phản ứng PCR, đảm bảo cho các thí nghiệm tiếp theo Đối chứng âm luôn cho kết quả âm tính, khẳng định quy trình thao tác không bị nhiễm DNA ngoại lai Kích thước băng so với thang chuẩn đạt khoảng 1093 bp, phù hợp với kích thước lý thuyết.
Bảng 3 1 Thành phần và điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA khuụn 200 ng/àL 1 -Kộo dài cuối:
Hình 3 3 Kết quả nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu Làn M: thang chuẩn kích thước DNA 1kb; Làn (-): đối chứng âm.
Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP
Xác định kiểu gen NAT2*5 có thể thực hiện bằng phương pháp FastDigest KpnI Kiểu gen đồng hợp tử dại CC sẽ tạo ra hai băng với kích thước 659 bp và 434 bp Đối với kiểu gen dị hợp tử CT, sẽ xuất hiện ba băng có kích thước lần lượt là 1093 bp, 659 bp và 434 bp Kiểu gen đồng hợp tử đột biến cũng được phân tích trong quá trình này.
TT không bị cắt cho một băng với kích thước 1093 bp (Hình 3.4A)
Phân tích kiểu gen NAT2 bằng phương pháp PCR-RFLP cho thấy các kiểu gen NAT2*5 và NAT2*7 được điện di trên gel agarose 2%, với M1 là thang chuẩn kích thước DNA 1kb Ngoài ra, kiểu gen NAT2*6 được điện di trên gel acrylamide 10%, với M2 là thang chuẩn kích thước.
DNA 50bp; Làn (-): đối chứng âm
Xác định kiểu gen NAT2*6 có thể thực hiện bằng phương pháp FastDigest TaqI Khi cắt bằng enzym giới hạn, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG sẽ tạo ra 4 băng điện di với kích thước 316 bp.
226, 170 và 381 bp Kiểu gen dị hợp tử GA cho 5 băng điện di với kích thước 396,
381, 316, 226 và 170 bp Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA sẽ cho 3 băng điện di với kích thước 396, 381 và 316 bp (Hình 3.4B)
Xác định kiểu gen NAT2*7 bằng phương pháp FastDigest BamHI cho thấy kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG sẽ tạo ra hai băng có kích thước lần lượt là 810 bp và 283 bp, trong khi kiểu gen dị hợp GA sẽ cho ba băng.
Bằng chứng từ nghiên cứu tại Trường Y Dược, VNU cho thấy kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA tạo ra một băng duy nhất có kích thước 1093 bp, không bị cắt, như minh họa trong Hình 3.4A.
Xác định kiểu gen NAT2 bằng giải trình tự
SNP Đồng hợp tử kiểu dại Dị hợp Đồng hợp tử đột biến
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 3 5 Kết quả xác định các kiểu gen NAT2 trên BioEdit version 7.1.9
Hình 3.5 hiển thị các kiểu gen của 6 alen được phân tích từ kết quả giải trình tự bằng phần mềm BioEdit 7.1.9, trong đó bao gồm các kiểu gen của alen NAT2*5.
*6, *7, *11, *12, *13 đều xuất hiện trong mẫu nghiên cứu của chúng tôi.
Kết quả phân bố tần số alen và tỷ lệ kiểu gen, kiểu hình NAT2
Kết quả phân tích trên 100 mẫu nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ 6 alen NAT2*5, *6,
Tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa dựa trên 3 SNP và 6 SNP cho kết quả hoàn toàn giống nhau, với tỷ lệ acetyl hóa nhanh, trung bình và chậm lần lượt là 25%, 38% và 37% (Bảng 3.3) Các số liệu cụ thể cho các SNP 7, 11, 12, 13 là 6%, 32%, 12%, 6%, 7% và 49% (Bảng 3.2).
Bảng 3 2 Kết quả phân tích kiểu gen và tần số của đa hình NAT2
Tần số alen p - value χ 2 Đồng hợp tử kiểu dại
Dị hợp tử Đồng hợp tử đột biến
Bảng 3 3 Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trên 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam
Kiểu hình Nhanh Trung bình Chậm Tổng
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
BÀN LUẬN
Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyền NAT2
Nhóm nghiên cứu đã lựa chọn hai phương pháp là PCR-RFLP và giải trình tự để tiến hành nghiên cứu, nhờ vào những ưu điểm bổ sung của cả hai phương pháp Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả của từng phương pháp trong việc phân tích các kiểu gen NAT2.
Khó khăn trong việc khuếch đại gen NAT2 chủ yếu do chiều dài đoạn gen lớn hơn 1 kb và sự tồn lưu của thuốc trong mẫu DNA có thể ức chế phản ứng PCR Do đó, chúng tôi đã quyết định sử dụng Kapa2G T M để giải quyết vấn đề này.
Robust Hotstart Ready Mix đã có sẵn tất cả các chất cần thiết cho PCR, trừ mồi và
Enzym Kapa2G giúp đơn giản hóa quy trình thao tác và giảm 20% - 50% thời gian thực hiện so với các enzym khác Một trong những ưu điểm nổi bật của enzym này là khả năng thực hiện PCR ngay cả khi có sự hiện diện của các chất ức chế hoặc trong các mẫu DNA có độ tinh sạch chưa cao.
Mặt khác, ngoài hoạt tính 5’-3’ DNA polymerase, Kapa2G còn có hoạt tính 5’-3’ exonuclease cho phép tăng độ chính xác trong quá trình khuếch đại gen [63]
Ngoài enzym Kapa2G, HotStartTaq DNA polymerase của hãng QIAGEN cũng cho kết quả nhân dòng với hiệu suất và độ đặc hiệu cao Ưu điểm của HotStartTaq
DNA polymerase QIAGEN cho phép nhân dòng dễ dàng ngay cả với các mẫu DNA có nồng độ thấp và các mẫu DNA phức tạp khó nhân dòng Sản phẩm này đi kèm với buffer chuyên dụng cho PCR, đảm bảo hiệu quả tối ưu trong quá trình nhân dòng.
QIAGEN được tối ưu hóa với điều kiện ủ mồi nghiêm ngặt và nồng độ Mg2+ cao hơn so với các buffer PCR thông thường, giúp nâng cao hiệu suất và độ đặc hiệu của phản ứng.
Enzym của QIAGEN nổi bật với dung dịch Q, một chất không độc hại thay thế cho DMSO, giúp điều chỉnh độ tan chảy của DNA Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc khuếch đại các mẫu khó khăn mà các enzym thông thường không thể thực hiện được.
4.1.2 Phương pháp giải trình tự
Phương pháp giải trình tự gen được xem là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định đột biến, được áp dụng rộng rãi toàn cầu, đặc biệt trong di truyền y học Nhờ sự phát triển của công nghệ y sinh, chi phí giải trình tự tại Việt Nam ngày càng giảm, và số lượng cơ sở giải trình tự trong nước ngày càng tăng Điều này cho phép các cơ sở y tế nghiên cứu không có hệ thống giải trình tự có thể gửi mẫu đến các cơ sở khác để phân tích Giải trình tự gen mang lại thông tin chi tiết về loại và vị trí của đột biến, đồng thời giúp xác định chính xác các điểm đột biến trên toàn bộ hệ gen.
Giải trình tự gen là phương pháp hiệu quả để xác định đồng thời tất cả các đa hình trong một đoạn gen, đặc biệt hữu ích cho các nghiên cứu bệnh lý chưa xác định được đa hình liên quan Một gen có thể chứa nhiều đột biến liên quan đến nhiều bệnh khác nhau, vì vậy việc giải trình tự cho phép thu thập dữ liệu kiểu gen đầy đủ nhất từ các đối tượng nghiên cứu Trong nghiên cứu này, cặp mồi được sử dụng để nhân dòng toàn bộ vùng gen mã hóa enzym NAT2, cung cấp thông tin di truyền phong phú về gen này, bao gồm cả các alen khác Việc xác định tất cả các đa hình trên gen NAT2 lần đầu tiên đã tạo ra bộ dữ liệu đa hình di truyền cho gen NAT2 ở bệnh nhân lao.
Hiện nay phương pháp giải trình tự đang được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
Các đột biến DNA đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá nguy cơ ung thư và xác định hiệu quả của các thuốc điều trị đích sinh học Chúng giúp chẩn đoán nguy cơ và tình trạng mắc các bệnh lý thần kinh, cũng như các bệnh lý di truyền như bệnh Parkinson.
Huntington, teo cơ Lateral Sclerosis và các loại bệnh mất trí nhớ như bệnh Alzheimer
Giải trình tự không chỉ giúp chẩn đoán chính xác các loại virus, vi khuẩn và nấm, mà còn đánh giá mối liên quan giữa đột biến và khả năng đáp ứng hoặc kháng thuốc Ngày nay, ứng dụng của giải trình tự ngày càng phong phú, khẳng định tầm quan trọng của phương pháp này trong lĩnh vực y sinh học, dược học và các ngành liên quan.
Phương pháp PCR-RFLP nổi bật với ưu điểm về thời gian thao tác nhanh, chi phí thấp và dễ thực hiện, do đó được nhiều nhà nghiên cứu ưa chuộng Phương pháp này thường được sử dụng để phân tích kiểu hình acetyl hóa thông qua ba alen NAT2*5, *6.
Phương pháp RFLP là một lựa chọn hiệu quả cho việc gửi kết quả sớm trong thực hành lâm sàng đối với các bệnh nhân.
Phân tích RFLP ba alen NAT2*5, *6, *7 cho thấy kết quả kiểu gen hoàn toàn tương đồng với giải trình tự Các kiểu hình xác định dựa trên 3 SNP và 6 SNP trong nghiên cứu không có sự khác biệt, cho thấy sự giống nhau hoàn toàn Do đó, chúng tôi khuyến cáo sử dụng kỹ thuật RFLP để dự đoán kiểu hình acetyl hóa thông qua ba alen NAT2*5, *6, *7.
Về đa hình di truyền NAT2
4.2.1 Tần số alen và tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa
Các biến thể di truyền của gen NAT2 ảnh hưởng đến khả năng acetyl hóa tại gan, từ đó tác động đến chuyển hóa thuốc và độ nhạy cảm với một số bệnh Nhiều nghiên cứu thường bỏ qua các đa hình không làm thay đổi chức năng của enzym, chỉ tập trung vào một số đột biến “chỉ thị” như NAT2*5, *6, *7, *11, *12, và *13, điều này có thể hạn chế hiểu biết về vai trò toàn diện của NAT2 trong sức khỏe con người.
Our research at the School of Medicine and Pharmacy, VNU, involved over 100 Vietnamese patients with tuberculosis The findings revealed the allele frequencies of NAT2 variants: *5 at 6%, *6 at 32%, *7 at 12%, *11 at 49%, *12 at 6%, and *13 at 7%.
Kết hợp dữ liệu tần số alen NAT2 đã được công bố, tôi tiến hành so sánh kết quả nghiên cứu với các vùng và lãnh thổ khác nhau.
Alen NAT2*5 có tần số nhỏ hơn 10% ở quần thể Đông Á, nhưng ở các quần thể khác, tần số của alen này dao động từ 29% đến 45% Alen NAT2*7 có tần số dưới 3% ở quần thể Châu Âu và Châu Phi, trong khi tại Đông Á, tần số cao nhất ghi nhận là 19%, và trong nghiên cứu của chúng tôi là 12% (p 0,256) Alen NAT2*6 lại chiếm tỷ lệ cao, từ 23% đến 36% ở các vùng khác nhau.
Tỷ lệ phân bố các alen NAT2*11 không có sự chênh lệch lớn giữa các vùng địa lý, trong khi NAT2*12 và NAT2*13 lại thể hiện sự khác biệt rõ rệt, với mức độ khác nhau dưới 10% ở người Việt Nam và Đông Á, nhưng trên 35% ở các khu vực khác Điều này cho thấy sự khác biệt trong tỷ lệ phân bố alen giữa các vùng và dân tộc, mặc dù các khu vực gần gũi như dân tộc Kinh tại thành phố Hồ Chí Minh và người Đông Á lại có sự tương đồng Sự tương đồng này chỉ ra rằng gần gũi địa lý có ảnh hưởng đến cấu trúc di truyền của quần thể.
Hình 4.1 trình bày tần số phân bố của các alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12 và *13 tại nhiều vùng và khu vực khác nhau trên thế giới Các mẫu được sắp xếp theo vị trí địa lý để dễ dàng so sánh.
Châu Phi (n = 661), Châu Mỹ (n = 347), Châu Âu (n = 503) , Hồ Chí Minh ( Dân tộc Kinh ở thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam, n = 198), nghiên cứu (nhóm người Việt
Nam mắcl lao, n = 100), Đông Á (n = 504), Nam Á (n = 489) [61]
Các nghiên cứu về tần số alen gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm và tỷ lệ kiểu hình này, cùng với nồng độ INH sau khi uống và liều điều trị thích hợp, đang được thực hiện trên toàn thế giới Năm 2012, Geetha Ramachandran và S Swaminathan đã kết luận rằng tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm ở người Mông Cổ, giống như người Eskimos, là 10%.
Nhật Bản và Trung Quốc, 90% ở Trung Đông, 60% ở Negroid, da trắng và Nam Ấn
Châu Phi Châu Mỹ Châu Âu Nghiên cứu Hồ Chí
NAT2*5 NAT2*6 NAT2*7 NAT2*11 NAT2*12 NAT2*13
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Độ và 72% ở Mỹ [49] Kiểu hình acetyl hóa chậm trong nghiên cứu của chúng tôi là
37%, thấp hơn so với Ấn Độ, Mỹ và Negroid; cao hơn ở người Mông Cổ, Nhật bản và
Nghiên cứu của Audrey Sabbagh và cộng sự năm 2011 trên 99 quần thể khác nhau toàn cầu đã chỉ ra sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm có liên quan đến nghề nghiệp ở từng quốc gia hoặc vùng lãnh thổ Sự phân bố này có thể do sự thích ứng với điều kiện môi trường, ảnh hưởng đến bộ gen con người và dẫn đến thay đổi tần số alen để phù hợp với môi trường.
Hình 4 2 Sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm trên 99 quần thể trên thế giới
Biểu đồ hình tròn trong báo cáo cho thấy tỷ lệ phần trăm các kiểu hình acetyl hóa, trong đó màu cam đại diện cho tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm, còn màu vàng thể hiện tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa nhanh và trung bình.
Nghiên cứu của Toure A và cộng sự trên 96 bệnh nhân lao đã sử dụng hai phương pháp chính để đo nồng độ INH trong huyết tương sau khi uống: một lần sau 3 giờ và một lần sau 6 giờ, nhằm xác định chỉ số và kiểu hình acetyl hóa Phương pháp PCR - RFLP hoặc giải trình tự được sử dụng để xác định kiểu gen NAT2 Kết quả cho thấy các alen NAT2*4, *5A, *6A, *13A là quan trọng nhất, và kiểu hình acetyl hóa giữa hai phương pháp này tương đồng Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nồng độ INH huyết tương sau 3 giờ và 6 giờ ở nhóm acetyl chậm cao hơn so với nhóm acetyl nhanh.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Donald và cộng sự đã nghiên cứu tác động của liều isoniazid và kiểu gen
Nghiên cứu về NAT2 cho thấy rằng, ở bệnh nhân lao phổi người lớn, sự acetyl hóa nhanh của INH với liều 6 mg/kg/ngày mang lại hiệu quả tương đương với liều 3 mg/kg/ngày của kiểu hình acetyl hóa chậm Nhóm nghiên cứu khuyến cáo rằng việc giảm liều INH xuống dưới 6 mg/kg có thể gây bất lợi cho những người có kiểu hình acetyl hóa nhanh, trong khi liều 3 mg/kg/ngày là đủ để đạt được nồng độ INH điều trị hiệu quả cho những người có kiểu hình acetyl hóa chậm.
326 người bệnh ở Ấn Độ cho thấy tỷ lệ acetyl hóa chậm, trung bình, nhanh lần lượt là
Sau 2 giờ sử dụng INH đơn độc (6 mg/kg), nồng độ INH trong máu của người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm, trung bình và nhanh lần lượt là 10,2 àg/mL, 8,1 àg/mL và 4,1 àg/mL Điều này cho thấy người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm sẽ có nồng độ INH cao hơn so với các kiểu hình khác.
Nồng độ INH trong máu cao hơn ở hai kiểu hình còn lại, dẫn đến sự gia tăng các chất trung gian độc hại cho cơ thể Một nghiên cứu trên 201 bệnh nhân tại Ấn Độ đã khảo sát tần số các đa hình NAT2 và mối liên quan giữa kiểu hình acetyl hóa và nồng độ INH, sử dụng phương pháp PCR-RFLP và HPLC, cho thấy tần số tương đương với các nghiên cứu trước đó ở Ấn Độ là 55%, 32%, 13% Tuy nhiên, nồng độ INH trong huyết tương của kiểu hình acetyl hóa chậm lại cao hơn so với các nghiên cứu trước.
Hình 4 3 Nồng độ INH sau 2 giờ của mỗi kiểu hình acetyl hóa[26]
Nghiên cứu về mối quan hệ giữa hiệu quả liều INH và kiểu hình acetyl hóa cho thấy bệnh nhân có kiểu hình acetyl hóa chậm cần sử dụng liều thấp hơn mức khuyến cáo Một nghiên cứu đối chứng ngẫu nhiên trên 172 bệnh nhân tại Nhật Bản vào năm 2013 đã xác nhận rằng điều trị liều INH nên dựa vào kiểu gen của từng bệnh nhân.
NAT2 có vai trò quan trọng trong việc cải thiện khả năng dung nạp thuốc và nâng cao hiệu quả của phác đồ điều trị 6 tháng cho bệnh nhân lao phổi mới Nghiên cứu này nhằm xác định tỷ lệ tổn thương liên quan đến việc sử dụng NAT2 trong điều trị.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU gan do INH (INH-DILI) trong 8 tuần điều trị và tỷ lệ thất bại điều trị sớm ở tuần thứ 8