ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh
Tại Bệnh viện Tim Hà Nội, 100 bệnh nhân mắc bệnh van tim đã được chỉ định thay van tim cơ học tham gia cung cấp mẫu Việc lựa chọn bệnh nhân được thực hiện theo tiêu chuẩn khuyến cáo của Hội Tim mạch học Việt Nam.
2.1.2 Các tiêu chuẩn loại trừ Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng; Huyết động không ổn định;
Người bệnh có nguy cơ cao không nên sử dụng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu trong các trường hợp như tai biến mạch não dưới 3 tháng, mới phẫu thuật dưới 1 tuần, hoặc khi có suy thận, suy gan giai đoạn cuối Ngoài ra, những người không đồng ý tham gia nghiên cứu cũng cần được lưu ý.
2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2018 Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega – Biotek); Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck); Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate (hãng Affymetrix); Nước khử ion (hãng Omega Bio-tek); 6X DNA loading dye (Thermo Scientific); Cặp mồi được đặt tổng hợp tại công ty Phusa Biochem (Việt Nam); dNTPMix 2mM mỗi loại (hãng Thermo Scientific); Phusion DNA Polymerase (hãng Thermo Scientific);
DNA marker 100bp-4kb (Lonza); Lamda/HindIII DNA Ladder (hãng Thermo Scientific)
The EBA 21 centrifuge from Hettich Zentrifugen (Germany) and the VELP Scientifica shaker (Europe) are essential laboratory tools, alongside the Panasonic deep freezer (Japan) and the NP 80 Nanophotometer (Implen, Germany) Additionally, the Cole-Parmer electrophoresis system and gel imager (USA), along with the Prime Thermal Cycler PCR machine (UK), further enhance research capabilities in various scientific fields.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thể hiện trong Hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu
2.3.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm
Để thu thập mẫu, cần lấy 2 ml máu từ tĩnh mạch và chia đều vào 3 ống chuyên dụng đã chứa sẵn EDTA để chống đông, mỗi ống cần tối thiểu 300 µL mẫu Mỗi ống mẫu này sẽ đủ cho các xét nghiệm cần thiết.
Việc tách DNA tổng số được thực hiện một lần, đảm bảo giữ lại mẫu lưu để có thể lặp lại quá trình tách DNA cho đến khi xác định được kiểu gen của người bệnh.
Mẫu máu cần được bảo quản lạnh ở nhiệt độ -20 đến -30 độ C cho đến khi sử dụng Nếu không có tủ lạnh đạt nhiệt độ này, mẫu máu nên được giữ trong ngăn đá tủ lạnh dân dụng hoặc trong đá, nhưng không quá 1 ngày và không được phép giã đông trước khi tách DNA hoặc chuyển đến nơi có tủ lạnh -20 độ C để bảo quản.
Ống chứa máu cần có đầy đủ thông tin bao gồm mã người bệnh, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Tất cả thông tin liên quan đến mẫu máu của người bệnh phải được ghi chép cẩn thận trong sổ.
Bản quyền @ Trường Đại học Y Dược, ĐHQG Hà Nội, bao gồm các thông tin quan trọng như tên, tuổi, mã bệnh nhân, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
2.3.2 Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit
Các bước thao tác được tiến hành như sau:
Bước 1 Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng
Bước 2: Lắc đều ống mỏu và chuyển 250 µL mẫu vào ống ly tâm dự trữ Bước 3: Thêm 25 µL OB Protease Solution và 250 µL BL Buffer, sau đó vortex trong 10 giây Bước 4: Ủ ở 65 độ C trong 10 phút; sau 5 phút, vortex trong 15 giây Bước 5: Thêm 260 µL Ethanol 100% và vortex trong 20 giây.
Để thực hiện quy trình, đầu tiên, ly tâm mẫu ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 15 giây nhằm đảm bảo mẫu không dính vào thành và nắp ống Tiếp theo, chèn cột HiBind DNA Mini vào ống thu 2 mL và sau đó chuyển toàn bộ mẫu vào cột, sử dụng pipet với mức thể tích 790 µL.
Bước 9 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 10 Bỏ dịch lọc và Collection Tube
Bước 11 Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2mL mới Bước 12 Thờm 500 àL HBC Buffer
Bước 13 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 14 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube Bước 15 Thờm 700 àL DNA Wash Buffer
Centrifuge for one minute at 14,000 RPM, then discard the filtrate and reuse the collection tube Repeat steps 14 to 16 for the second wash using DNA Wash Buffer.
Bước 19: Ly tâm HiBind DNA Mini Column ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 2 phút để làm khô cột Bước 20: Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2mL mới Bước 21: Thêm 100 µL Elution Buffer (được làm ấm đến 65°C) và ủ ở 65°C trong 5 phút.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bước 22 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 23 Thờm 50 àL Elution Buffer trong 5 phỳt ở nhiệt độ phũng Bước 24 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
Bước 25 Thu và bảo quản DNA ở -20 o C
2.3.3 Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3 Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tôi tiến hành xác định nhiệt độ gắn mồi, nồng độ hoạt động tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng Phusion polymerase (Thermo Scientific) Đoạn mồi tự thiết kế được đặt tổng hợp tại Công ty Phusa Biochem (Việt Nam) có trình tự lần lượt là: mồi xuôi 5’
Trình tự DNA GCA TCT GTA ACC ATC CTC TC 3’ và mồi ngược 5’ GTG TCA AGA TTC AGT TCT TTC C 3’ được xác định dựa trên dữ liệu từ Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Mỹ (NCBI).
- NCBI), đoạn DNA nhân dòng có độ dài lý thuyết được xác định là 719 bp
2.3.4 Kiểm tra chất lượng DNA
Đánh giá chất lượng DNA tổng số và sản phẩm PCR sẽ được thực hiện thông qua hai phương pháp, trong đó có phương pháp đo quang.
Bước 1 Khởi động máy, chọn chế độ đo nồng độ DNA
Bước 2 Đo mẫu trắng: lấy 2 àL Elution buffer dựng để pha loóng DNA làm dung dịch đo mẫu trắng
Đo mẫu DNA là bước quan trọng trong quy trình phân tích, trong đó lấy 2 µL mỗi mẫu để đo Máy sẽ tự động tính toán nồng độ DNA và độ tinh sạch dựa trên giá trị OD260 và OD280 Chất lượng DNA được đánh giá thông qua điện di trên gel agarose.
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Cho 1,5 g agarose pha trong 100 ml đệm
Để chuẩn bị gel agarose, đầu tiên đun nóng TAE 1X trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn Sau đó, để dung dịch nguội xuống 50 – 60 độ C trước khi đổ vào khay điện di đã được cài sẵn răng lược để tạo các giếng tra mẫu Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông lại, gỡ răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di với các giếng hướng về phía cực âm của máy Cuối cùng, đổ đệm TAE 1X vào bể điện di cho ngập cách mặt gel từ 1 – 2 mm.
Bước 2: Tra mẫu DNA: 5 àL mẫu DNA được trộn với 1 àL 6X DNA loading dye đó nhuộm Ethidim Bromua trước khi tra vào giếng 5 àL thang chuẩn
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA được tra vào mỗi giếng: Lamda/HindIII DNa Ladder với DNA tổng số và DNA marker 100bp-4kb (Lonza) với sản phẩm PCR
Bước 3: Chạy điện di với hiệu điện thế 100 V trong 40 phút
Bước 4: Quan sát kết quả điện di bằng cách lấy bản gel ra khỏi khuôn và chiếu sáng dưới hệ thống Gel-DocIt Các mẫu đạt chất lượng tốt sẽ hiển thị băng điện di sáng và rõ ràng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA
Tại Bệnh viện Tim Hà Nội, 100 mẫu máu toàn phần được lấy từ tĩnh mạch của bệnh nhân sau phẫu thuật thay van tim và điều trị bằng thuốc acenocoumarol đã được tách chiết DNA tổng số thành công Kết quả điện di DNA của 10 bệnh nhân đầu tiên cho thấy các băng DNA đều sáng rõ, như minh họa trong Hình 3.1.
Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm nghiên cứu Làn 1-10: DNA tổng số của 10 người bệnh
Kết quả đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm cho 100 mẫu DNA thu được cho thấy nồng độ DNA dao động từ 41,15 đến 133,90 ng/µL, với giá trị trung bình là 111,0 ± 47,7 ng/µL Đặc biệt, 90/100 mẫu có chỉ số OD nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,2, cho thấy độ tinh sạch cao Tỉ số OD260/280 trung bình đạt 2,02 ± 0,01, chứng tỏ các mẫu DNA tương đối sạch và đáp ứng yêu cầu cho phản ứng khuếch đại DNA bằng PCR tiếp theo.
Bảng 3.1 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số
Chỉ số Giá trị trung bình ± sai số SE
Nồng độ DNA (ng/àL) 111,0 ± 47,7
Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3
Để đạt được quy trình nhân dòng CYP2C9 hiệu quả và ổn định, cần tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA và nồng độ hoạt động của mồi.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi với enzym Phusion Polymerase
Kết quả thử nghiệm cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dòng đoạn gen chứa CYP2C9*3 nằm trong khoảng 58,8 - 65,5 o C, nơi băng điện di xuất hiện rõ nét và đặc hiệu Trong khi đó, ở dải nhiệt độ từ 50,8-56,6 o C, các băng điện di không đặc hiệu xuất hiện, và ở 67,2 - 69,0 o C, băng điện di giảm độ sáng hoặc không lên băng Dải nhiệt độ gắn mồi rộng này cho phép thực hiện nhiều phản ứng nhân dòng các gen khác nhau trong cùng một chu trình nhiệt.
Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dòng alen CYP2C9*3 Làn M: DNA marker 100bp-4kb
Làn (-): đối chứng âm Làn (+): đối chứng dương
3.2.2 Tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA
Hình 3.3 trình bày kết quả điện di trên gel agarose 1,5% từ thí nghiệm tối ưu hóa nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) trong quá trình nhân dòng alen CYP2C9*3 Làn M thể hiện DNA marker 100bp-4kb, trong khi làn ĐC (-) là đối chứng âm.
Thực hiện PCR ở các nồng độ DNA lần lượt là: 5, 10, 50, 100 và 200 ng/μl cho kết quả điện di như ở Hình 3.3 Nồng độ DNA cho lên băng kích thước rõ
Phản ứng PCR cho thấy có độ nhạy cao, có khả năng nhân dòng đoạn gen với nồng độ DNA rất thấp, trong khoảng 5-200 ng/μl Nghiên cứu cho thấy nồng độ mồi tối ưu là 0,5 μM, với kết quả điện di không có băng phụ và băng chính xuất hiện ở kích thước 719 bp như lý thuyết Các điều kiện và thành phần phản ứng khuếch đại gen CYP2C9*3 đã được tối ưu và được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen CYP2C9*3
Thành phần Nồng độ hoạt động
Thể tích phản ứng (30 àl) Điều kiện phản ứng
DNA khuụn 100 ng/àl 1,5 - Biến tớnh:
72 0 C – 2 phút dNTP mix 2 mM 0,2 mM 3,0
Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel agarose 1,5% cho thấy các mẫu bệnh nhân (Làn 1-3) cho sản phẩm ổn định và đặc hiệu với một băng sáng rõ, trong khi Làn 4 là đối chứng âm Quy trình nghiên cứu đã thành công trong việc nhân dòng đoạn gen chứa đa hình CYP2C9*3 từ 100 người bệnh tham gia.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU đều có đối chứng âm không lên, chứng tỏ phản ứng PCR không bị nhiễm trong quá trình thao tác.
Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3
Kết quả giải trình tự trong nghiên cứu được thể hiện trong Hình 3.5, cho thấy không có bệnh nhân nào mang kiểu gen đồng hợp đột biến CC trong nhóm người bệnh tham gia Tần số alen và tần số kiểu gen được trình bày chi tiết trong Bảng.
AA (đồng hợp tử kiểu dại)
(đồng hợp tử đột biến)
Gen CYP2C9*3 được xác định thông qua giải trình tự, với kết quả tần số alen và tần số kiểu gen được trình bày trong bảng 3.3 Tần số kiểu gen của SNP này đạt một tỷ lệ nhất định, phản ánh sự phân bố di truyền trong quần thể.
CC AC AA A C Giá trị p
Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C9*3 trên 100 bệnh nhân cho thấy 96% có kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA, trong khi chỉ 4% mang kiểu gen dị hợp tử AC Tần số alen C được xác định là 0,02.
Tần số các alen trong nghiên cứu này phù hợp với định luật Hardy-Weinberg, với giá trị X² = 0,0416 và giá trị p = 0,84 Điều này cho thấy cấu trúc di truyền của các alen đã trở nên ổn định trong nhóm mẫu nghiên cứu.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
BÀN LUẬN
So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau
Theo kết quả của dự án 1000 genome giai đoạn 3 đã được công bố [49], tần số alen C tại các quần thể được báo cáo và thể hiện trong Hình 4.1
Hình 4.1 Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người Tần số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số 48
Biểu đồ phân bố alen C cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các quần thể người Tần số alen C rất thấp ở quần thể người Châu Phi, chỉ chiếm 0,2%, trong khi ở Châu Âu, con số này tăng lên hơn 7%, và ở Nam Á, tần số còn cao hơn, đạt trên 10% Khu vực Đông Á có tần số alen C gần giống với kết quả nghiên cứu của tôi, điều này có thể được giải thích bởi sự gần gũi về mặt địa lý.
Nghiên cứu của tôi cho thấy tần số alen C ở nhóm bệnh nhân là 2%, trong khi ở quần thể người bình thường tại Tp Hồ Chí Minh là 3,5% Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05), cho thấy đột biến CYP2C9*3 không phải là đột biến gây bệnh mà chỉ liên quan đến chuyển hóa thuốc, do đó không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhóm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy alen A chiếm tỉ lệ rất lớn trong quần thể với 98
Kiểu gen chuyển hóa thuốc chống đông kháng vitamin K ở người Việt Nam cho thấy khả năng đáp ứng tương đối tốt, với 96% có kiểu gen chuyển hóa bình thường AA, 4% có kiểu gen chuyển hóa chậm AC, và không có kiểu gen CC.
Châu Mỹ Châu Phi Châu Âu Nam Á Đông Á
Tp Hồ Chí Minh Nghiên cứu này
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay
Hiện nay, nhiều phương pháp xác định kiểu gen của đa hình di truyền đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả, bao gồm giải trình tự gen, kỹ thuật RFLP và PCR định lượng Trong số đó, giải trình tự gen vẫn là phương pháp phổ biến nhất, đặc biệt đối với các gen mới, giúp hiểu rõ hơn về thông tin di truyền và các đột biến Ưu điểm của giải trình tự gen là tính phổ biến ngày càng tăng và chi phí ngày càng giảm.
Có thể nói hiện nay giải trình tự vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm tại Việt Nam
Hình 4.2 Nguyên lý của phương pháp PCR-CTPP a: độ dài của alen X; b: độ dài của alen Y; c = a + b - (d - 1): độ dài giữa mồi 1F và 2R; d: tổng chiều dài của 2 mồi 2F và 1R [41]
Nghiên cứu của Tamura và cộng sự tại Nhật Bản (2014) đã áp dụng phương pháp phản ứng chuỗi polymerase với các cặp mồi kép (PCR-CPTT) để phân tích đa hình CYP2C9*3 Phương pháp này dựa trên việc nhân dòng gen với 4 đoạn mồi (2 cặp mồi) F1, R1 cho alen X và F2, R2 cho alen Y, tạo ra 3 đoạn DNA có kích thước khác nhau Chu trình nhiệt được thực hiện bao gồm 1 chu kỳ biến tính ở 95 ºC trong 10 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ với các bước nhiệt độ 95 ºC trong 1 phút, 62 ºC trong 10 giây, và 72 ºC trong 1 phút, kết thúc với 1 chu kỳ ở 72 độ C trong 5 phút Kết quả điện di cho thấy 3 kiểu gen khác nhau: kiểu gen *1/*1 (hay AA) với 2 băng 125 và 287 bp, kiểu gen *1/*3 (hay AC) cho
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Kỹ thuật phân tích gen với 3 băng có kích thước 125, 200 và 287 bp, trong đó kiểu gen *3/*3 (hay CC) cho 2 băng là 200 và 287 bp, đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ cao Nếu không đảm bảo quy trình PCR ổn định, kết quả thu được có thể không chính xác.
Realtime PCR, hay còn gọi là PCR định lượng (qPCR), là một kỹ thuật tiên tiến dựa trên phản ứng PCR, ngày càng được ưa chuộng Kỹ thuật này cho phép theo dõi sự khuếch đại của phân tử DNA mục tiêu sau mỗi chu kỳ nhiệt, thay vì chỉ ở cuối như phương pháp PCR truyền thống Realtime PCR sử dụng nguyên lý tương tự như PCR nhưng kết hợp với chất phát huỳnh quang để theo dõi quá trình.
Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện trong quá trình bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi DNA, với nhiều nghiên cứu sử dụng qPCR để xác định kiểu gen CYP2C9*3 Chẳng hạn, nghiên cứu của Sangviroon tại Đại học Chulalongkorn, Thái Lan, đã áp dụng qPCR với đầu dò phát huỳnh quang fluorogen Tương tự, một nhóm nghiên cứu ở Mỹ đã phân tích 75 bệnh nhân trẻ tuổi để phát hiện kiểu gen này, trong khi nghiên cứu của Chen Jiyang đã xác định kiểu gen trên 257 bệnh nhân Trung Quốc Mặc dù qPCR mang lại kết quả chính xác, nhưng chi phí đầu tư cho hệ thống máy Realtime PCR và hóa chất tiêu hao là khá cao, và phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật viên có kiến thức và kỹ năng phân tích phức tạp.
Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol
Nghiên cứu của nhóm nghiên cứu dược lý học thuộc Hiệp hội dược sĩ Hoàng gia Hà Lan đã đưa ra khuyến cáo về liều thuốc chống đông kháng vitamin K dựa trên kiểu gen CYP2C9 Cụ thể, nếu bệnh nhân có alen CYP2C9*3, cần giảm 20% liều acenocoumarol ban đầu, trong khi alen *2 chỉ cần giảm 1% Điều này cho thấy ảnh hưởng của alen *3 lớn hơn alen *2 trong việc xác định liều dùng thuốc Kết quả này cũng được xác nhận bởi nghiên cứu của Visser, trong đó bệnh nhân mang 1 alen *3 cần giảm 20% liều, còn bệnh nhân chỉ mang 1 alen *2 nên giảm 13%.
Nghiên cứu cho thấy rằng khi số lượng alen *3 tăng lên, mức độ giảm liều cũng tăng mạnh, có thể lên tới 40% khi bệnh nhân mang cả hai alen *2 và *3 Ngoài ra, một nghiên cứu của Visser chỉ ra rằng bệnh nhân mang alen *2 và *3 có nguy cơ chảy máu cao gấp 1,83 lần so với những người không mang hai alen này.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bảng 4.1 Mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 *3 tới chỉ định liều Acenocoumarol và nguy cơ chảy máu của một số nhóm nghiên cứu Hà Lan
Tài liệu tham khảo Số người tham gia Mối liên quan
Schalekamp, 2004 [39] 231 Giảm liều khi mang 1 alen: *2: 1 %, *3: 20 % Visser, 2004 [46] 1124
Visser, 2004 [47] 996 Nguy cơ chảy máu tăng 1,83 khi mang alen
Bảng 4.2 Các biến trong thuật toán tính liều acenocoumarol ở nhóm nghiên cứu người Tây Ban Nha [13]
Sử dụng thuốc cảm ứng hoạt hoá enzym CYP2C9 0,119
Một nghiên cứu đã công bố một thuật toán định lượng liều acenocoumarol trên 147 bệnh nhân người Tây Ban Nha Dựa vào các biến và ảnh hưởng được mô tả trong Bảng 4.2, bác sĩ sẽ quyết định liều khởi đầu theo khuyến cáo của đơn vị y tế và sau đó điều chỉnh liều cho từng bệnh nhân dựa trên tác động của thuốc.
Nghiên cứu tại Trường Đại học Y Dược, VNU cho thấy CYP2C9*3 ảnh hưởng đến liều acenocoumarol, bên cạnh đó, cần chú ý đến các yếu tố như tuổi tác, cân nặng, chiều cao (tính chỉ số BMI), tình trạng sử dụng thuốc cảm ứng CYP2C9, amiodarone, sự hiện diện của alen CYP2C9 *1 và *2, kiểu gen VKORC1, CYP4F2 và APOE Khi xem xét nhóm bệnh nhân có đặc điểm lâm sàng tương đồng, thuật toán dự đoán liều ổn định chính xác đạt 59,8%, cao hơn so với 37,6% nếu chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng.
Một thuật toán chi tiết đã được xây dựng cho nhóm 100 bệnh nhân Bắc Ấn Độ, dựa trên các yếu tố ảnh hưởng đến liều thuốc và mức độ của chúng Thuật toán này tính toán liều một cách cụ thể nhằm tối ưu hóa hiệu quả điều trị.
Liều lượng thuốc hàng ngày được tính theo công thức: 3,082 - 0,013 x (tình trạng hút thuốc) - 0,433 x (giới tính) - 0,004 x (tuổi) + chỉ định x (0,327 cho bệnh nhân thay van đôi hoặc - 0,092 cho bệnh nhân thay van động mạch chủ) + 0,026 x (chiều cao) + 0,151 x (trọng lượng) - 7,660 x (diện tích bề mặt cơ thể) - 0,862 x (VKORC1 AG) - 2,257 x (VKORC1 AA) - 0,049 x (CYP2C9).
2 ) – 0,456 x (CYP2C9 * 1 / * 3) + 0,449 x (CYP4F2 AG) + 0,230 x (CYP4F2 AA)
Bảng 4.3 So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật toán của các nhóm nghiên cứu khác nhau THUẬT TOÁN LIỀU TRUNG BÌNH (mg/tuần)
Liều điều trị khuyến cáo 21,31 ± 8,35 Nghiên cứu Bắc Ấn Độ [35] 21,16 ± 4,82 Nhóm nghiên cứu Thổ Nhĩ Kỳ [33] 27,16 ± 1,19 Nhóm nghiên cứu Trung Quốc [48] 27,87 ± 4,94
Thuật toán dược động học của Ấn Độ cho thấy lý do cần điều chỉnh liều ở bệnh nhân, với tỷ lệ 41,4% (p < 0,001) So sánh giữa liều dự đoán và liều điều trị thực tế tại bệnh viện khu vực cho thấy thuật toán này có khả năng dự đoán tốt hơn so với các thuật toán trước đây dựa trên các biến tương tự, như đã được nghiên cứu vào năm 2008.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bảng 4.3 chỉ ra rằng số lượng biến lớn hơn và mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố được xem xét kỹ lưỡng, dẫn đến việc phân loại cẩn thận hơn.
So sánh các thuật toán dược động học cho thấy nhiều yếu tố như chiều cao, cân nặng và kiểu gen ảnh hưởng đến liều điều trị acenocoumarol Kết quả từ các thuật toán này cho thấy khả năng dự đoán liều nhanh và chính xác hơn so với chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng hoặc chỉ số cận lâm sàng Nghiên cứu về các thuật toán này là nền tảng cho y học cá thể hóa, nhằm nâng cao chất lượng điều trị cho từng bệnh nhân Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố đến liều điều trị acenocoumarol có sự khác biệt giữa các nhóm bệnh nhân Vì vậy, tôi đề xuất nghiên cứu để xác lập thuật toán phù hợp cho bệnh nhân Việt Nam, hướng đến việc định liều thuốc cá nhân hóa trong tương lai.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Dựa vào những kết quả đạt được, tôi đưa ra một số kết luận như sau:
- Quy trình phân tích kiểu gen CYP2C9*3 sử dụng mẫu máu toàn phần đã được xây dựng thành công
Quy trình phân tích gen CYP2C9*3 đã được áp dụng thành công trên 100 bệnh nhân sử dụng thuốc chống đông acenocoumarol sau khi thay van tim tại Bệnh viện Tim Hà Nội Kết quả cho thấy tỷ lệ kiểu gen AA chiếm 96% và kiểu gen AC chiếm 4%, trong khi tần số đột biến C là 0,02.
Hướng tới y học cá thể hóa trong điều trị, mục tiêu là nâng cao chất lượng chăm sóc cho người bệnh và giảm thiểu các biến chứng có thể xảy ra Để đạt được điều này, tôi xin đưa ra một số kiến nghị quan trọng.
Nghiên cứu cần mở rộng để xác định kiểu gen CYP2C9*3 với cỡ mẫu lớn hơn, đồng thời tiến hành các nghiên cứu nhằm đánh giá mức độ ảnh hưởng của kiểu gen này đến quá trình chuyển hóa acenocoumarol.
Phân tích các yếu tố như chiều cao, cân nặng, độ tuổi và các gen mới là cần thiết để phát triển thuật toán định lượng liều acenocoumarol cho bệnh nhân Việt Nam.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), "Phân tích gen và sản phẩm của gen", Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội
2 Hội Tim mạch (2008), Khuyến cáo 2008 của Hội tim mạch Việt Nam về chẩn đoán điều trị các bệnh van tim
3 Lê Thị Nhiên (2016), “ Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 ở người bệnh đặt Stent động mạch vành qua da”, Luận văn Thạc sĩ Dược học Đại học Dược Hà Nội
4 Nguyễn Lân Việt (2003), Thực hành bệnh tim mạch, Nhà xuất bản Y học
5 Phạm Hùng Vân (2009), "Real-time PCR Các vấn đề cơ bản", PCR và realtime PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học,
6 Phạm Thị Minh Đức (2011), “ Sinh lý máu”, Sinh lý học, NXB Y học
7 Tạ Thành Văn (2010), "Realtime PCR và PCR định lượng", PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, NXB Y học, 33-66
8 Võ Thị Thương Lan (2007), "Phản ứng PCR", Một số vấn đề của sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 86-88
9 Abhijit Trailokya, JS Hiremath, JPS Sawhney và các cộng sự (2016),
“Acenocoumarol; A Review of Anticoagulant Efficacy and Safety”, Journal of The Association of Physiccian of India, 64
10 Alec Vahanican, Ottavio Alfrieri, Felicita Andreotti và các cộng sự (2012),
“Guideline onthe management of valvular heart disease”, European Heart
11 Ansell J, Hirsh J, Hylek E và các cộng sự (2008), “ Pharmacology and management of the vitamin K antagonists: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition)”,
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU