Khóa luận tốt nghiệp ngành Y đa khoa: Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền gen CYP2C9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông Acenocoumarol ở người bệnh sau

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xây dựng được quy trình tối ưu để xác định đa hình di truyền CYP2C9*3 trên mẫu máu người bệnh sau thay van tim. Áp dụng được quy trình đã tối ưu để đánh giá mức độ đa hình di truyền CYP2C9*3 trên 100 người bệnh sau thay van tim tại Việt Nam.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh

Tại Bệnh viện Tim Hà Nội, 100 bệnh nhân mắc bệnh van tim đã được chỉ định thay van tim cơ học và tham gia cung cấp mẫu Việc lựa chọn bệnh nhân được thực hiện theo các tiêu chuẩn khuyến cáo của Hội Tim mạch học Việt Nam.

2.1.2 Các tiêu chuẩn loại trừ Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng; Huyết động không ổn định;

Bệnh nhân không nên sử dụng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nếu họ đã trải qua tai biến mạch não trong vòng 3 tháng qua, vừa mới phẫu thuật dưới 1 tuần, hoặc có nguy cơ cao chảy máu Ngoài ra, những người mắc suy thận hoặc suy gan giai đoạn cuối cũng cần thận trọng Việc tham gia nghiên cứu sẽ không được chấp nhận nếu bệnh nhân không đồng ý.

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2018 Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega – Biotek); Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck); Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate (hãng Affymetrix); Nước khử ion (hãng Omega Bio-tek); 6X DNA loading dye (Thermo Scientific); Cặp mồi được đặt tổng hợp tại công ty Phusa Biochem (Việt Nam); dNTPMix 2mM mỗi loại (hãng Thermo Scientific); Phusion DNA Polymerase (hãng Thermo Scientific);

DNA marker 100bp-4kb (Lonza); Lamda/HindIII DNA Ladder (hãng Thermo Scientific)

The EBA 21 centrifuge by Hettich Zentrifugen from Germany, the VELP Scientifica shaker from Europe, and the Panasonic deep freezer from Japan are essential laboratory equipment Additionally, the NP 80 Nanophotometer by Implen from Germany, the Cole-Parmer electrophoresis system and gel imager from the USA, along with the Prime Thermal Cycler PCR machine from the UK, are critical tools for scientific research and analysis.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thể hiện trong Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.3.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm

Đối với lượng mẫu, 2 ml máu được lấy từ tĩnh mạch và chia đều vào 3 ống chuyên dụng chứa EDTA chống đông, với tối thiểu 300 µL mẫu cho mỗi ống Mỗi ống mẫu này đủ để thực hiện các xét nghiệm cần thiết.

Quá trình tách DNA tổng số được thực hiện một lần, luôn đảm bảo có mẫu lưu để có thể lặp lại việc tách DNA cho đến khi xác định được kiểu gen của người bệnh.

Mẫu máu cần được bảo quản ở nhiệt độ -20 đến -30 độ C cho đến khi sử dụng Nếu không có tủ lạnh đạt nhiệt độ này, mẫu máu có thể được giữ ở ngăn đá tủ lạnh dân dụng hoặc trong đá nhưng không quá 1 ngày Lưu ý không được giã đông mẫu trước khi tách DNA hoặc chuyển đến nơi có tủ lạnh -20 độ C để bảo quản.

Ống chứa máu cần có đầy đủ thông tin như mã người bệnh, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Thông tin về mẫu máu của người bệnh phải được ghi chép cẩn thận trong sổ để đảm bảo tính chính xác và minh bạch trong quá trình xét nghiệm.

Bản quyền @ Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN, bao gồm các thông tin quan trọng như tên, tuổi, mã số bệnh nhân, ngày lấy mẫu, cũng như tình trạng của mẫu khi được bàn giao và trong quá trình tách DNA.

2.3.2 Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit

Các bước thao tác được tiến hành như sau:

Bước 1 Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng

Bước 2: Lắc đều ống mẫu và chuyển 250 µL mẫu vào ống ly tâm dự trữ Bước 3: Thêm 25 µL dung dịch OB Protease và 250 µL đệm BL, sau đó vortex trong 10 giây Bước 4: Ủ ở 65 độ C trong 10 phút, và sau 5 phút, vortex trong 15 giây Bước 5: Thêm 260 µL ethanol 100% và vortex trong 20 giây.

Để đảm bảo mẫu không dính trên thành và nắp ống, hãy ly tâm ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 15 giây Sau đó, chèn HiBind DNA Mini Column vào ống thu 2 mL và chuyển toàn bộ mẫu vào cột, sử dụng pipet ở mức 790 µL.

Bước 9 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 10 Bỏ dịch lọc và Collection Tube

Bước 11 Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2mL mới Bước 12 Thờm 500 àL HBC Buffer

Bước 13 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 14 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube Bước 15 Thờm 700 àL DNA Wash Buffer

Centrifuge for 1 minute at 14,000 RPM Discard the supernatant and reuse the Collection Tube Repeat steps 14-16 for the second wash using DNA Wash Buffer.

Để hoàn thành quy trình chiết xuất DNA, trước tiên, ly tâm HiBind DNA Mini Column ở 14.000 vòng/phút trong 2 phút để làm khô cột Sau đó, chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2mL mới Tiếp theo, thêm 100 µL Elution Buffer đã được làm ấm đến 65°C và ủ ở nhiệt độ này trong 5 phút.

Bước 22 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 23 Thờm 50 àL Elution Buffer trong 5 phỳt ở nhiệt độ phũng Bước 24 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 25 Thu và bảo quản DNA ở -20 o C

2.3.3 Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3 Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tôi tiến hành xác định nhiệt độ gắn mồi, nồng độ hoạt động tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng Phusion polymerase (Thermo Scientific) Đoạn mồi tự thiết kế được đặt tổng hợp tại Công ty Phusa Biochem (Việt Nam) có trình tự lần lượt là: mồi xuôi 5’

Trình tự DNA được đề cập là GCA TCT GTA ACC ATC CTC TC 3’ với mồi ngược 5’ GTG TCA AGA TTC AGT TCT TTC C 3’ Dữ liệu này được tham khảo từ Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Mỹ (NCBI).

- NCBI), đoạn DNA nhân dòng có độ dài lý thuyết được xác định là 719 bp

2.3.4 Kiểm tra chất lượng DNA

Chất lượng DNA tổng số và sản phẩm PCR sẽ được đánh giá bằng hai phương pháp dưới đây Một trong những phương pháp là đánh giá chất lượng DNA thông qua đo quang.

Bước 1 Khởi động máy, chọn chế độ đo nồng độ DNA

Bước 2 Đo mẫu trắng: lấy 2 àL Elution buffer dựng để pha loóng DNA làm dung dịch đo mẫu trắng

Đo mẫu DNA là bước quan trọng trong quy trình phân tích, trong đó lấy 2 µL mỗi mẫu để đo Máy sẽ tự động tính toán nồng độ và độ tinh sạch của DNA dựa trên giá trị OD260 và OD280 Chất lượng DNA được đánh giá thông qua phương pháp điện di trên gel agarose.

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Cho 1,5 g agarose pha trong 100 ml đệm

Để chuẩn bị gel agarose, đầu tiên đun TAE 1X trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội đến 50 – 60°C Tiếp theo, đổ dung dịch vào khay điện di đã cài sẵn răng lược để tạo các giếng tra mẫu Sau khoảng 30 phút, gel sẽ đông lại; khi đó, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di với phần giếng gần phía cực âm Cuối cùng, đổ đệm TAE 1X vào bể điện di sao cho ngập cách mặt gel từ 1 – 2 mm.

Bước 2: Tra mẫu DNA: 5 àL mẫu DNA được trộn với 1 àL 6X DNA loading dye đó nhuộm Ethidim Bromua trước khi tra vào giếng 5 àL thang chuẩn

DNA được tra vào mỗi giếng: Lamda/HindIII DNa Ladder với DNA tổng số và DNA marker 100bp-4kb (Lonza) với sản phẩm PCR

Bước 3: Chạy điện di với hiệu điện thế 100 V trong 40 phút

Sau khi hoàn tất quá trình điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bằng hệ thống phân tích Gel-DocIt Mẫu có chất lượng tốt sẽ hiển thị băng điện di sáng và rõ nét.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA

Tại Bệnh viện Tim Hà Nội, 100 mẫu máu toàn phần đã được lấy từ tĩnh mạch của bệnh nhân sau phẫu thuật thay van tim và điều trị bằng thuốc acenocoumarol Quá trình tách chiết DNA tổng số đã thành công, với kết quả điện di DNA của 10 bệnh nhân đầu tiên cho thấy các băng DNA đều nổi bật và rõ nét.

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm nghiên cứu Làn 1-10: DNA tổng số của 10 người bệnh

Kết quả đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm cho 100 mẫu DNA được trình bày trong Bảng 3.1, với mỗi mẫu được đo hai lần để lấy giá trị trung bình Nồng độ DNA thu hồi dao động từ 41,15 đến 133,90 ng/µL, trung bình là 111,0 ± 47,7 ng/µL Đặc biệt, 90/100 mẫu có chỉ số OD nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,2, với tỉ số OD260/280 trung bình là 2,02 ± 0,01, cho thấy độ tinh khiết cao của các mẫu Do đó, DNA được tách chiết đáp ứng yêu cầu cho phản ứng khuếch đại DNA bằng PCR tiếp theo.

Bảng 3.1 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số

Chỉ số Giá trị trung bình ± sai số SE

Nồng độ DNA (ng/àL) 111,0 ± 47,7

Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3

Để đảm bảo quy trình nhân dòng CYP2C9 đạt hiệu quả và ổn định, cần tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA sử dụng và nồng độ hoạt động của mồi.

3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi với enzym Phusion Polymerase

Kết quả thử nghiệm về nhiệt độ gắn mồi cho thấy ở dải nhiệt độ 50,8-56,6 o C xuất hiện các băng điện di không đặc hiệu, trong khi ở 67,2 - 69,0 o C, băng điện di giảm độ sáng hoặc không xuất hiện Dải nhiệt độ 58,8 - 65,5 o C cho băng điện di đặc hiệu và sáng rõ nhất, vì vậy tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dòng đoạn gen CYP2C9*3 trong khoảng này Dải nhiệt độ gắn mồi rộng cũng cho phép thực hiện nhiều phản ứng nhân dòng các gen khác nhau với chu trình nhiệt giống nhau.

Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dòng alen CYP2C9*3 Làn M: DNA marker 100bp-4kb

Làn (-): đối chứng âm Làn (+): đối chứng dương

3.2.2 Tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA

Hình 3.3 trình bày kết quả điện di trên gel agarose 1,5% từ thí nghiệm tối ưu hóa nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) trong quá trình nhân dòng alen CYP2C9*3 Làn M thể hiện DNA marker 100bp-4kb, trong khi làn ĐC (-) được sử dụng làm đối chứng âm.

Thực hiện PCR ở các nồng độ DNA lần lượt là: 5, 10, 50, 100 và 200 ng/μl cho kết quả điện di như ở Hình 3.3 Nồng độ DNA cho lên băng kích thước rõ

Phương pháp PCR cho thấy độ nhạy cao với khả năng nhân dòng đoạn gen ở nồng độ DNA rất thấp, trong khoảng 5-200 ng/μl Kết quả cho thấy nồng độ mồi tối ưu là 0,5 μM, với các băng điện di xuất hiện rõ ràng ở kích thước 719 bp mà không có băng phụ Điều này chứng tỏ rằng nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng nhân dòng CYP2C9*3 là 5-200 ng/μl và nồng độ mồi tối ưu là 0,5 μM Các thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đã được tối ưu hóa và được trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen CYP2C9*3

Thành phần Nồng độ hoạt động

Thể tích phản ứng (30 àl) Điều kiện phản ứng

DNA khuụn 100 ng/àl 1,5 - Biến tớnh:

72 0 C – 2 phút dNTP mix 2 mM 0,2 mM 3,0

Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel agarose 1,5% cho thấy sự thành công trong việc nhân dòng đoạn gen này từ 100 người bệnh tham gia nghiên cứu Hình 3.4 minh họa rõ ràng sự xuất hiện của sản phẩm PCR với một băng sáng rõ, cho thấy tính ổn định và đặc hiệu của kết quả Làn M là DNA marker 100bp-4kb, trong khi các làn 1-3 đại diện cho sản phẩm PCR của 3 mẫu người bệnh và làn 4 là đối chứng âm.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU đều có đối chứng âm không lên, chứng tỏ phản ứng PCR không bị nhiễm trong quá trình thao tác.

Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3

Kết quả giải trình tự trong nghiên cứu cho thấy không có bệnh nhân nào mang kiểu gen đồng hợp đột biến CC trong nhóm tham gia Tần số alen và tần số kiểu gen được trình bày rõ ràng trong bảng.

AA (đồng hợp tử kiểu dại)

(đồng hợp tử đột biến)

Kiểu gen CYP2C9*3 được xác định thông qua giải trình tự, với kết quả tần số alen và tần số kiểu gen được trình bày trong bảng 3.3 Tần số kiểu gen (%) và tần số alen cho SNP CYP2C9*3 cho thấy sự phân bố di truyền trong quần thể nghiên cứu.

CC AC AA A C Giá trị p

Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C9*3 trên 100 mẫu cho thấy 96% là kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA, trong khi chỉ 4% bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử AC Tần số xuất hiện của alen C được tính là 0,02.

Tần số các alen trong nghiên cứu này phù hợp với định luật Hardy-Weinberg, với giá trị X² = 0,0416 và giá trị p = 0,84 Điều này chứng tỏ rằng cấu trúc di truyền của các alen đã trở nên ổn định trong nhóm mẫu nghiên cứu.

BÀN LUẬN

So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau

Theo kết quả của dự án 1000 genome giai đoạn 3 đã được công bố [49], tần số alen C tại các quần thể được báo cáo và thể hiện trong Hình 4.1

Hình 4.1 Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người Tần số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số 48

Biểu đồ phân bố alen C cho thấy tần số alen này rất thấp ở quần thể người Châu Phi (0,2%), trong khi ở Châu Âu, tần số này tăng lên hơn 7% Đặc biệt, tại khu vực Nam Á, tần số alen C đạt hơn 10% Tần số ở Đông Á gần giống với kết quả nghiên cứu của tôi, điều này có thể được giải thích bởi sự gần gũi về mặt địa lý.

Nghiên cứu cho thấy tần số alen C ở nhóm bệnh là 2% và ở quần thể người bình thường tại Tp Hồ Chí Minh là 3,5% Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Điều này cho thấy rằng đột biến CYP2C9*3 không phải là đột biến gây bệnh mà chỉ liên quan đến chuyển hóa thuốc, dẫn đến việc không có sự khác biệt ý nghĩa giữa hai nhóm.

Kết quả nghiên cứu cho thấy alen A chiếm tỉ lệ rất lớn trong quần thể với 98

Kiểu gen chuyển hóa thuốc chống đông kháng vitamin K ở người Việt Nam cho thấy khả năng đáp ứng tương đối tốt, với 96% mang kiểu gen chuyển hóa bình thường AA, 4% chuyển hóa chậm AC, và không có kiểu gen CC.

Châu Mỹ Châu Phi Châu Âu Nam Á Đông Á

Tp Hồ Chí Minh Nghiên cứu này

Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay

Hiện nay, nhiều phương pháp xác định kiểu gen của đa hình di truyền đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả, bao gồm giải trình tự gen, kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) và PCR định lượng (Realtim PCR) Trong số đó, giải trình tự gen vẫn là phương pháp phổ biến nhất, đặc biệt đối với các gen mới, giúp cung cấp thông tin di truyền về các đột biến Ưu điểm của giải trình tự gen là kỹ thuật ngày càng phổ biến và chi phí ngày càng giảm.

Có thể nói hiện nay giải trình tự vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm tại Việt Nam

Hình 4.2 Nguyên lý của phương pháp PCR-CTPP a: độ dài của alen X; b: độ dài của alen Y; c = a + b - (d - 1): độ dài giữa mồi 1F và 2R; d: tổng chiều dài của 2 mồi 2F và 1R [41]

Nghiên cứu của Tamura và cộng sự (2014) tại Nhật Bản đã áp dụng phương pháp phản ứng chuỗi polymerase với các cặp mồi kép (PCR-CPTT) để phân tích đa hình CYP2C9*3 Phương pháp này dựa trên việc nhân dòng gen với 4 đoạn mồi, tạo ra 3 đoạn DNA có kích thước khác nhau giữa các cặp mồi Quy trình nhiệt độ của PCR bao gồm 1 chu kỳ biến tính ở 95 ºC trong 10 phút, 30 chu kỳ với các bước nhiệt độ khác nhau, và kết thúc ở 72 ºC trong 5 phút Kết quả điện di cho thấy 3 kiểu gen khác nhau: kiểu gen *1/*1 (AA) với 2 băng là 125 và 287 bp, và kiểu gen *1/*3 (AC).

Kỹ thuật phân tích gen với ba băng 125, 200 và 287 bp, kiểu gen *3/*3 (hay CC) chỉ cho hai băng là 200 và 287 bp Tuy nhiên, để đạt được kết quả chính xác, kỹ thuật viên cần có trình độ thao tác cao, vì nếu phản ứng PCR không ổn định, kết quả sẽ bị ảnh hưởng.

Realtime PCR, hay còn gọi là PCR định lượng (qPCR), là một kỹ thuật mới dựa trên phản ứng PCR, ngày càng được ứng dụng rộng rãi Kỹ thuật này cho phép theo dõi sự khuếch đại của phân tử DNA đích sau mỗi chu kỳ nhiệt, thay vì chỉ ở cuối phản ứng như phương pháp PCR thông thường Realtime PCR sử dụng nguyên lý tương tự như PCR nhưng có thêm chất phát huỳnh quang.

Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện trong quá trình bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi DNA Nhiều nghiên cứu, như của Sangviroon tại Đại học Chulalongkorn, Thái Lan, đã sử dụng qPCR với đầu dò huỳnh quang để xác định kiểu gen CYP2C9*3 Tại Mỹ, một nhóm nghiên cứu cũng áp dụng qPCR để phân tích kiểu gen CYP2C9*3 ở 75 bệnh nhân trẻ tuổi Nghiên cứu của Chen Jiyang trên 257 bệnh nhân Trung Quốc cũng sử dụng phương pháp này Tuy nhiên, chi phí đầu tư ban đầu cho hệ thống máy Realtime PCR và hóa chất tiêu hao khá cao, đồng thời yêu cầu kỹ thuật viên có kiến thức và kỹ năng phân tích phức tạp.

Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol

Nghiên cứu của nhóm dược lý thuộc Hiệp hội dược sĩ Hoàng gia Hà Lan đã đưa ra khuyến cáo về liều thuốc chống đông kháng vitamin K dựa trên kiểu gen CYP2C9 Cụ thể, nếu bệnh nhân có alen CYP2C9*3, cần giảm 20% liều acenocoumarol ban đầu, trong khi alen *2 chỉ yêu cầu giảm 1% Sự khác biệt này cho thấy alen *3 có ảnh hưởng lớn hơn alen *2 trong việc xác định liều dùng thuốc Nghiên cứu của Visser cũng xác nhận rằng bệnh nhân mang một alen *3 cần giảm 20% liều, trong khi những người chỉ có một alen *2 nên giảm 13%.

Sự tăng cường của alen *3 dẫn đến mức độ giảm liều mạnh hơn, với khả năng giảm liều lên tới 40% ở những bệnh nhân mang cả hai alen *2 và *3 Nghiên cứu của Visser cũng chỉ ra rằng, những bệnh nhân mang alen *2 và *3 có nguy cơ chảy máu cao gấp 1,83 lần so với những người không mang hai alen này.

Bảng 4.1 Mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 *3 tới chỉ định liều Acenocoumarol và nguy cơ chảy máu của một số nhóm nghiên cứu Hà Lan

Tài liệu tham khảo Số người tham gia Mối liên quan

Schalekamp, 2004 [39] 231 Giảm liều khi mang 1 alen: *2: 1 %, *3: 20 % Visser, 2004 [46] 1124

Visser, 2004 [47] 996 Nguy cơ chảy máu tăng 1,83 khi mang alen

Bảng 4.2 Các biến trong thuật toán tính liều acenocoumarol ở nhóm nghiên cứu người Tây Ban Nha [13]

Sử dụng thuốc cảm ứng hoạt hoá enzym CYP2C9 0,119

Một nghiên cứu đã công bố thuật toán định lượng liều acenocoumarol trên 147 bệnh nhân người Tây Ban Nha Bác sĩ sẽ xác định liều khởi đầu dựa trên khuyến cáo của đơn vị y tế, sau đó điều chỉnh liều cho từng bệnh nhân dựa trên các biến và ảnh hưởng được mô tả trong bảng 4.2.

Nghiên cứu cho thấy biến thể CYP2C9*3 ảnh hưởng đến liều acenocoumarol, bên cạnh đó, các yếu tố như tuổi tác, cân nặng, chiều cao (BMI), tình trạng sử dụng thuốc cảm ứng CYP2C9, amiodarone, alen CYP2C9 *1 và *2, gen VKORC1, CYP4F2 và APOE cũng cần được xem xét Trong nhóm bệnh nhân có đặc điểm lâm sàng tương đồng, thuật toán dự đoán liều ổn định đạt độ chính xác 59,8%, cao hơn nhiều so với 37,6% khi chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng.

Một thuật toán chi tiết đã được phát triển cho nhóm 100 bệnh nhân Bắc Ấn Độ, dựa trên các yếu tố ảnh hưởng đến liều thuốc và mức độ tác động của chúng Thuật toán này cung cấp cách tính liều một cách chi tiết, nhằm tối ưu hóa hiệu quả điều trị cho từng bệnh nhân.

Liều lượng thuốc hàng ngày (mg/ngày) được tính theo công thức: 3,082 - 0,013 x (tình trạng hút thuốc: 1 cho người hút thuốc, 0 cho người không hút thuốc) - 0,433 x (giới tính: 1 cho nam, 0 cho nữ) - 0,004 x (tuổi) + chỉ định x (0,327 cho bệnh nhân thay van đôi, -0,092 cho bệnh nhân thay van động mạch chủ) + 0,026 x (chiều cao cm) + 0,151 x (trọng lượng kg) - 7,660 x (diện tích bề mặt cơ thể cm2) - 0,862 x (VKORC1 AG) - 2,257 x (VKORC1 AA) - 0,049 x (CYP2C9 * 1 / *).

2 ) – 0,456 x (CYP2C9 * 1 / * 3) + 0,449 x (CYP4F2 AG) + 0,230 x (CYP4F2 AA)

Bảng 4.3 So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật toán của các nhóm nghiên cứu khác nhau THUẬT TOÁN LIỀU TRUNG BÌNH (mg/tuần)

Liều điều trị khuyến cáo 21,31 ± 8,35 Nghiên cứu Bắc Ấn Độ [35] 21,16 ± 4,82 Nhóm nghiên cứu Thổ Nhĩ Kỳ [33] 27,16 ± 1,19 Nhóm nghiên cứu Trung Quốc [48] 27,87 ± 4,94

Thuật toán dược động học của Ấn Độ chỉ ra rằng việc thay đổi liều ở người bệnh là cần thiết, chiếm 41,4% trường hợp (p < 0,001) So sánh giữa liều dự đoán và liều điều trị thực tế tại bệnh viện khu vực cho thấy thuật toán này có khả năng dự đoán tốt hơn so với các thuật toán đã được thiết lập dựa trên các biến tương tự của các nghiên cứu trước đó vào năm 2008.

Bảng 4.3 chỉ ra rằng số lượng biến lớn hơn và mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố được xem xét một cách cẩn thận, dẫn đến việc phân loại chính xác hơn.

Trong việc so sánh các thuật toán, nhiều yếu tố như chiều cao, cân nặng và kiểu gen ảnh hưởng đến liều điều trị acenocoumarol Kết quả từ các thuật toán dược động học cho thấy khả năng dự đoán liều nhanh và chính xác hơn so với chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng Nghiên cứu này là nền tảng cho y học cá thể hóa, giúp nâng cao chất lượng điều trị cho từng bệnh nhân Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến liều điều trị có sự khác biệt giữa các nhóm Do đó, tôi đề xuất nghiên cứu để xác lập thuật toán phù hợp cho bệnh nhân Việt Nam, hướng tới việc định liều thuốc cá nhân hóa trong tương lai.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Dựa vào những kết quả đạt được, tôi đưa ra một số kết luận như sau:

- Quy trình phân tích kiểu gen CYP2C9*3 sử dụng mẫu máu toàn phần đã được xây dựng thành công

Quy trình phân tích gen CYP2C9*3 đã được áp dụng thành công trên 100 bệnh nhân sử dụng thuốc chống đông acenocoumarol sau khi thay van tim tại Bệnh viện Tim Hà Nội Kết quả cho thấy 96% bệnh nhân mang kiểu gen AA và 4% mang kiểu gen AC, trong khi tần số đột biến C là 0,02.

Hướng tới y học cá thể hóa, điều trị nhằm nâng cao chất lượng chăm sóc cho bệnh nhân và giảm thiểu các biến chứng có thể xảy ra, tôi xin đưa ra một số kiến nghị sau đây.

Nghiên cứu mở rộng nhằm xác định kiểu gen CYP2C9*3 với cỡ mẫu lớn hơn sẽ giúp làm rõ mức độ ảnh hưởng của kiểu gen này đối với quá trình chuyển hóa acenocoumarol.

Phân tích tác động của các yếu tố như chiều cao, cân nặng, độ tuổi và các gen mới là cần thiết để xây dựng thuật toán định lượng liều acenocoumarol cho bệnh nhân Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), "Phân tích gen và sản phẩm của gen", Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội

2 Hội Tim mạch (2008), Khuyến cáo 2008 của Hội tim mạch Việt Nam về chẩn đoán điều trị các bệnh van tim

3 Lê Thị Nhiên (2016), “ Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 ở người bệnh đặt Stent động mạch vành qua da”, Luận văn Thạc sĩ Dược học Đại học Dược Hà Nội

4 Nguyễn Lân Việt (2003), Thực hành bệnh tim mạch, Nhà xuất bản Y học

5 Phạm Hùng Vân (2009), "Real-time PCR Các vấn đề cơ bản", PCR và realtime PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học,

6 Phạm Thị Minh Đức (2011), “ Sinh lý máu”, Sinh lý học, NXB Y học

7 Tạ Thành Văn (2010), "Realtime PCR và PCR định lượng", PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, NXB Y học, 33-66

8 Võ Thị Thương Lan (2007), "Phản ứng PCR", Một số vấn đề của sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 86-88

9 Abhijit Trailokya, JS Hiremath, JPS Sawhney và các cộng sự (2016),

“Acenocoumarol; A Review of Anticoagulant Efficacy and Safety”, Journal of The Association of Physiccian of India, 64

10 Alec Vahanican, Ottavio Alfrieri, Felicita Andreotti và các cộng sự (2012),

“Guideline onthe management of valvular heart disease”, European Heart

11 Ansell J, Hirsh J, Hylek E và các cộng sự (2008), “ Pharmacology and management of the vitamin K antagonists: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition)”,

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,5 MB