Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xây dựng được quy trình phân tích một số đa hình di truyền gen NAT2 ở người bệnh mắc lao tại Việt Nam. Áp dụng được quy trình đã tối ưu để bước đầu đánh giá mức độ đa hình di truyền gen NAT2 trên 100 mẫu người bệnh lao ở Việt Nam.
ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Một nghiên cứu đã được thực hiện với 100 bệnh nhân từ Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện 74 Trung Ương và Bệnh viện Phổi Hà Nội Các bệnh nhân tham gia đều có kết quả AFB dương tính, bao gồm cả lao phổi mới và lao phổi tái trị Họ được điều trị bằng các thuốc chống lao hàng 1 theo phác đồ của Chương trình Chống lao Quốc gia Việt Nam năm 2017 và đã tự nguyện tham gia nghiên cứu.
Tiêu chuẩn loại trừ trong nghiên cứu bao gồm phụ nữ đang mang thai và cho con bú, cũng như những bệnh nhân có kết quả nuôi cấy không phát triển khuẩn lạc, nhằm xác định các thông số dược động học chính xác.
Thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 6 năm 2017 đến tháng 9 năm 2018, tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y Dược học cơ sở thuộc Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Hóa chất dùng cho tách DNA tổng số: E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega-Biotek)
Hóa chất dùng cho điện di: Ethylene Diamine Tetra Acetic Axit (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix), TAE 1X, 5X DNA loading dye (hãng
ThermoScientific), Oˈ GeneRuler 50 bp DNA Ladder (hãng Thermo Scientific) ,
Oˈ GeneRuler 1kb DNA Ladder (hãng ThermoScientific), Lambda DNA/HindIII
Marker (hãng ThermoScientific), Tris base (hãng Bio basic), axit acetic (hãng Merck)
Hóa chất cho PCR bao gồm cặp mồi được tổng hợp bởi hãng Phusa-biochem tại Việt Nam Trình tự mồi này đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu trước đó, với mã 5'-GGA ACA.
AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3' [18, 34], nước khử ion (hãng Omega Biotek), Kapa2G T M Robust HotStart ReadyMix (2X) (hãng
Hóa chất dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR: E.Z.N.A.® CyclePure Kit (hãng Omega-biotek)
Hóa chất dùng cho PCR-RFLP: nước khử ion (hãng Omega Biotek), enzym cắt FastDigest KpnI, FastDigest BamHI, FastDigest TaqI (hãng ThermoScientific)
Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It - Mỹ), hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd
- Mỹ), máy PCR (Prime Thermal Cycler - Anh), tủ an toàn sinh học (ESCO - Đức),
The School of Medicine and Pharmacy at VNU utilizes advanced laboratory equipment, including the EBA 21 centrifuge from Hettich Zentrifugen in Europe, the VELP shaker from Scientifica in Europe, the NP80 spectrophotometer from Nanophotometer in Germany, and the Fiocchetti flake ice machine.
- Anh), tủ ấm (Panasonic - Nhật bản), tủ lạnh sâu -30 o C (Panasonic - Nhật Bản), tủ mát
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện qua 6 bước chính: (1) thu thập mẫu sinh phẩm, (2) tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số, (3) nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng phương pháp PCR, (4) tinh sạch sản phẩm PCR, (5) xác định kiểu gen qua PCR-RFLP hoặc giải trình tự, và (6) phân tích kết quả.
Hình 2 1 Các bước tiến hành nghiên cứu
Tách chiết DNA tổng số
PCR nhân dòng đoạn gen NAT2
Xác định kiểu gen thông qua RFLP và giải trình tự tự
Thu thập100 mẫu máu BN lao
Tinh sạch sản phẩm PCR
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Mỗi người bệnh cung cấp 2mL mẫu máu toàn phần lưu trong ống có chứa EDTA, bảo quản ở - 20 o C cho đến khi sử dụng
Kí hiệu mẫu là thông tin quan trọng về mẫu máu của người bệnh, bao gồm tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
2.2.2 Tách chiết DNA tổng số
Tách DNA tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng
Phương pháp tách chiết axit nucleic dựa vào sự hấp thụ chọn lọc vào màng silica-gel, bao gồm bốn bước chính: ly giải tế bào, gắn DNA vào màng silica, rửa sạch tạp chất, và cuối cùng là giải phóng và thu DNA.
Quá trình ly giải là bước quan trọng để phá vỡ tế bào và giải phóng DNA, sử dụng dung dịch chất ly giải chứa muối hoạt động bề mặt với nồng độ cao nhằm làm mất ổn định các liên kết hydro và tương tác kị nước, giúp DNA chuyển lên màng silica Tiếp theo, DNA gắn vào màng silica gel nhờ sự hỗ trợ của muối hoạt động bề mặt và cồn như ethanol hoặc isopropanol Sau đó, quá trình rửa diễn ra để loại bỏ tạp chất trên màng silica gel bằng dung dịch chứa muối hoạt động bề mặt cao, tiếp theo là ethanol để loại bỏ muối Cuối cùng, DNA được làm khô bằng ly tâm để đảm bảo ethanol đã được loại bỏ, hoàn tất quá trình thu DNA.
Bằng cách sử dụng dung dịch muối phù hợp, thường là Tris 10 mM ở pH 8 hoặc 9,
DNA sẽ hòa tan vào muối Cuối cùng sau khi chắc chắn DNA đã hòa tan, các cột sẽ được li tâm để thu DNA [27]
Hình 2 2 Nguyên lý tách DNA tổng số bằng kit [33]
(1) Ly giải (2) Gắn DNA vào màng
(4) Giải phóng và thu DNA
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA tổng số thu được được điện di trên gel agarose 1,2%, đệm TAE 1X Trộn
Để phân tích DNA, trộn 4 µL DNA với 1 µL 5X DNA loading Dye chứa Ethidium bromide (50 µg/mL) trước khi nạp mẫu Điện di được thực hiện ở hiệu điện thế 84 volt trong 40 phút, sử dụng thang chuẩn DNA λ/HindIII ladder, và các băng DNA được quan sát dưới ánh sáng UV Nồng độ và độ tinh khiết của DNA được xác định bằng cách đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) DNA được coi là tinh khiết cao khi giá trị OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
Phương pháp đo mật độ quang dựa trên việc axit nucleic hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm nhờ sự hiện diện của base purin và pyrimidin Để tính nồng độ DNA, cần xác định giá trị mật độ quang tại OD260, với 1 đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ 50 ng/ml cho dung dịch DNA sợi đôi Đồng thời, đo ở bước sóng OD280 để đánh giá mức hấp thụ protein, từ đó tính tỉ lệ OD260/OD280 để kiểm tra độ tinh sạch của DNA Các mẫu nên được đo ít nhất 2 lần ở cả hai bước sóng 260 và 280 nm, và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA chính xác.
2.2.3 Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
Dựa trên dữ liệu từ NCBI, gen NAT2 kiểu dại dài 1093 bp đã được khuếch đại thông qua phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với trình tự lý thuyết như mô tả trong Hình 2.3 [62].
1 GGAACAAATT GGACTTGGAA ACATTAACTG ACATTCTTGA GCACCAGATC CGGGCTGTTC CCTTTGAGAA CCTTAACATG
81 CATTGTGGGC AAGCCATGGA GTTGGGCTTA GAGGCTATTT TTGATCACAT TGTAAGAAGA AACCGGGGTG GGTGGTGTCT
161 CCAGGTCAAT CAACTTCTGT ACTGGGCTCT GACCACAATC GGTTTTCAGA CCACAATGTT AGGAGGGTAT TTTTACATCC
241 CTCCAGTTAA CAAATACAGC ACTGGCATGG TTCACCTTCT CCTGCAGGTG ACCATTGACG GCAGGAATTA CATTG TCGAT
321 GCTGGGTCTG GAAGCTCCTC CCAGATGTGG CAGCCTCTAG AATTAATTTC TGGGAAGGAT CAGCCTCAGG TGCCTTGCAT
401 TTTCTGCTTG ACAGAAGAGA GAGGAATCTG GTACCTGGAC CAAATCAGGA GAGAGCAGTA TATTACAAAC AAAGAATTTC
481 TTAATTCTCA TCTCCTGCCA AAGAAGAAAC ACCAAAAAAT ATACTTATTT ACGCTTGAAC CTCGAACAAT TGAAGATTTT
561 GAGTCTATGA ATACATACCT GCAGACGTCT CCAACATCTT CATTTATAAC CACATCATTT TGTTCCTTGC AGACCCCAGA
641 AGGGGTTTAC TGTTTGGTGG GCTTCATCCT CACCTATAGA AAATTCAATT ATAAAGACAA TACAGATCTG GTCGAGTTTA
721 AAACTCTCAC TGAGGAAGAG GTTGAAGAAG TGCTGAGAAA TATATTTAAG ATTTCCTTGG GGAGAAATCT CGTGCCCAAA
801 CCTGGTGATG GATCCCTTAC TATTTAGAAT AAGGAACAAA ATAAACCCTT GTGTATGTAT CACCCAACTC ACTAATTATC
881 AACTTATGTG CTATCAGATA TCCTCTCTAC CCTCACGTTA TTTTGAAGAA AATCCTAAAC ATCAAATACT TTCATCCATA
961 AAAATGTCAG CATTTATTAA AAAACAATAA CTTTTTAAAG AAACATAAGG ACACATTTTC AAATTAATAA AAATAAAGGC
1041 ATTTTAAGGA TGGCCTGTGA TTATCTTGGG AAGCAGAGTG ATTCATGCTA GA
Để xác định kiểu alen của gen NAT2, chúng tôi đã tối ưu hóa quy trình nhân dòng bằng cách điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Sản phẩm PCR được kiểm tra chất lượng trên gel agarose 1,5%, sử dụng thang chuẩn O’ GeneRuler DNA.
Ladder để xác định kích thước sản phẩm Tất cả các phản ứng đều sử dụng đối chứng âm để đảm bảo mẫu không bị ngoại nhiễm
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR tinh sạch được thực hiện bằng E.Z.N.A.® CyclePure Kit theo quy trình khuyến cáo của nhà sản xuất Phương pháp này dựa trên nguyên lý loại bỏ mồi, muối và tạp chất từ mẫu DNA thông qua cột có màng silica gel, tương tự như quy trình tách chiết DNA đã được đề cập trước đó.
2.2.5 Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được pha loãng đến nồng độ 100 ng/µL để sử dụng cho phản ứng cắt Để thực hiện phản ứng cắt, chúng tôi sử dụng enzym FastDigest KpnI.
FastDigest TaqI và FastDigest BamI được sử dụng để cắt ba alen NAT2*5, *6, *7 Dựa vào vị trí cắt của enzym trên gen NAT2, kích thước các băng điện di tương ứng với từng kiểu gen đã được dự đoán và thể hiện trong hình.
2.4 mô tả Alen NAT2*5 (c.341T > C) không có vị trí nhận biết của enzym cắt, tuy nhiên lại liên kết chặt chẽ với c.481C > T có vị trí nhận biết của KpnI Chính vì vậy, kiểu gen NAT2*5 được xác định thông qua kiểu gen của c.481C > T Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt được trình bày trong Bảng 2.1
Bảng 2 1 Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt Thành phần
Thể tích 1 phản ứng (10 àL) Điều kiện cắt Đệm 10X 1 àL Ủ 5 phút ở 37 ˚C, bất hoạt
DNA khuụn 100 ng/àL 3,5 àL
Kết quả dự kiến từ việc cắt alen NAT2*5, NAT2*6 và NAT2*7 cho thấy các kiểu gen khác nhau: TT là đồng hợp tử kiểu dại, CT là dị hợp tử, CC là đồng hợp tử đột biến, GG là đồng hợp tử kiểu dại, AG là dị hợp tử, và AA là đồng hợp tử đột biến.
Chiều dài đoạn gen ước tính sau khi cắt alen NAT2*5 và NAT2*7 lớn hơn
200bp và các đoạn gen có chiều dài khác biệt trên 200 bp, vì vậy tiến sản phẩm cắt 2
Sản phẩm DNA được điện di trên gel agarose 2% với thang chuẩn O’ GeneRuler 1kb DNA ladder (ThermoScientific) và hiển thị dưới ánh sáng UV qua máy soi gel Đối với sản phẩm cắt NAT2*6 có chiều dài ước tính nhỏ hơn 400 bp và các đoạn gen cách nhau ít nhất 15 bp, chúng tôi đã sử dụng gel acrylamide 10% cùng với thang chuẩn O’ GeneRuler 50bp DNA ladder để thu được hình ảnh rõ nét hơn, sau đó áp dụng phương pháp nhuộm bạc để hiện hình sản phẩm.
2.2.6 Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp giải trình tự
20 mẫu sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose và tinh sạch bằng kit, sau đó sẽ được gửi đến hãng First Base (Malaysia) để thực hiện giải trình tự với cùng một mồi cho đoạn gen NAT2 Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.1.9 để xác định kiểu gen của từng bệnh nhân.
Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ quy định đạo đức trong thiết kế thử nghiệm lâm sàng theo Bộ Y tế Trước khi tham gia, người bệnh được cung cấp đầy đủ thông tin về mục đích, lợi ích và các ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu Người bệnh sẽ ký vào bản đồng thuận tham gia và có quyền rút lui bất cứ lúc nào Thông tin cá nhân của người bệnh được bảo mật tuyệt đối và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu.
Nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội phê duyệt trước khi tiến hành Tất cả mẫu bệnh án và phiếu xác nhận tự nguyện tham gia nghiên cứu của người bệnh đã được thu thập đầy đủ.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tách chiết DNA tổng số
Các mẫu máu từ 100 bệnh nhân đã được tách DNA bằng bộ kit của Omega, sử dụng phương pháp tách chiết điện di trên gel agarose 1,2% Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách chiết đạt chất lượng tốt.
Kết quả phân tích DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân cho thấy các sản phẩm DNA đều có băng DNA rõ nét và chất lượng cao.
DNA từ các mẫu khác nhau cho thấy sự đồng đều và ổn định, với các băng điện di sáng rõ tương ứng với băng chuẩn 23,1 kb.
Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở 260 nm cho thấy nồng độ DNA tổng số dao động từ 20 - 230 ng/µL, với chỉ số OD260/OD280 chủ yếu nằm trong khoảng 1,6 đến 2,2.
DNA tổng số thu được ít bị đứt gãy, đảm bảo tính tinh khiết và đủ điều kiện cho phản ứng nhân dòng tiếp theo.
Hình 3 1 Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2% Làn M1: thang chuẩn
DNA λ/HindIII; Làn 1 – 12: sản phẩm DNA tổng số của 12 mẫu nghiên cứu.
Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
3.2.1 Tối ưu quy trình PCR
Khi thực hiện PCR, việc tối ưu nhiệt độ gắn mồi là rất quan trọng để đạt hiệu suất cao nhất Chúng tôi đã tiến hành PCR ở 10 nhiệt độ khác nhau, trong khoảng từ 51,1 oC đến 59,9 oC Đồng thời, nồng độ DNA nhân dòng tối ưu được xác định từ các mức nồng độ 25, 50, 84, 150, 200 và 250 ng/µL.
Kết quả điện di trong Hình 3.2A cho thấy rằng ở nhiệt độ gắn mồi từ 57,8 o C đến 58,9 o C, sản phẩm PCR tạo ra băng đặc hiệu, rõ ràng và có kích thước phù hợp với lý thuyết.
(1093 bp).Tuy nhiên, tại nhiệt độ gắn mồi 52,6 o C đến 55,8 o C có xuất hiện băng phụ, còn tại nhiệt độ 52,6 o C; 53,6 o C; 59,5 o C và 59,9 o C các băng xuất hiện mờ, không rõ nét
Nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 58 o C, giúp tạo ra băng sáng nhất và rõ nét mà không có băng phụ, do đó được chọn cho các phản ứng tiếp theo Kết quả cho thấy nồng độ đạt được là tối ưu.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Kết quả từ Hình 3.2B cho thấy rằng PCR đạt hiệu quả tốt nhất với nồng độ DNA từ 150-250 ng/µL Cụ thể, nồng độ 150 ng/µL và 250 ng/µL cho băng mờ, trong khi nồng độ 200 ng/µL tạo ra băng sáng rõ nét mà không có băng phụ, do đó được chọn làm nồng độ tối ưu.
Hình 3.2 trình bày kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 trên gel agarose 1,5% Phần (A) thể hiện kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi, trong khi phần (B) cho thấy kết quả tối ưu nồng độ DNA Làn M là thang chuẩn kích thước DNA 1kb, và làn (-) là đối chứng âm.
3.3.2 Nhân dòng gen NAT2 của 100 mẫu nghiên cứu
Sử dụng điều kiện tối ưu với thành phần và chu trình nhiệt đã được xác định, nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc nhân dòng 100 sản phẩm Kết quả điện di nhân dòng gen NAT2 của 10 mẫu đầu tiên cho thấy băng sáng rõ nét, chứng tỏ phản ứng PCR đạt hiệu suất và độ đặc hiệu cao, sẵn sàng cho các phản ứng tiếp theo Thí nghiệm PCR luôn đi kèm với đối chứng âm, cho kết quả âm tính, khẳng định quy trình không bị nhiễm DNA ngoại lai Kích thước băng so với thang chuẩn phù hợp với kích thước lý thuyết khoảng 1093 bp.
Bảng 3 1 Thành phần và điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA khuụn 200 ng/àL 1 -Kộo dài cuối:
Hình 3 3 Kết quả nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu Làn M: thang chuẩn kích thước DNA 1kb; Làn (-): đối chứng âm.
Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP
Xác định kiểu gen NAT2*5 sử dụng phương pháp FastDigest KpnI cho kết quả như sau: kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại CC sẽ hiển thị hai băng kích thước 659 bp và 434 bp; kiểu gen dị hợp tử CT sẽ có ba băng với kích thước lần lượt là 1093 bp, 659 bp và 434 bp; trong khi kiểu gen đồng hợp tử đột biến sẽ cho các băng khác.
TT không bị cắt cho một băng với kích thước 1093 bp (Hình 3.4A)
Phân tích kiểu gen NAT2 thông qua phương pháp PCR-RFLP cho thấy các kiểu gen NAT2*5 và NAT2*7 được điện di trên gel agarose 2%, với M1 là thang chuẩn kích thước DNA 1kb Đồng thời, kiểu gen NAT2*6 được điện di trên gel acrylamide 10%, với M2 là thang chuẩn kích thước.
DNA 50bp; Làn (-): đối chứng âm
Xác định kiểu gen NAT2*6 bằng phương pháp FastDigest TaqI cho thấy kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG sau khi cắt bằng enzym giới hạn sẽ tạo ra 4 băng điện di có kích thước 316 bp.
226, 170 và 381 bp Kiểu gen dị hợp tử GA cho 5 băng điện di với kích thước 396,
381, 316, 226 và 170 bp Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA sẽ cho 3 băng điện di với kích thước 396, 381 và 316 bp (Hình 3.4B)
Xác định kiểu gen NAT2*7 bằng phương pháp FastDigest BamHI cho thấy kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG tạo ra 2 băng với kích thước 810 bp và 283 bp, trong khi kiểu gen dị hợp GA cho 3 băng.
Tại Trường Y Dược, ĐHQGHN, kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA không bị cắt và cho một băng duy nhất có kích thước 1093 bp, tương ứng với kích thước các băng 1093, 810 và 283 bp (Hình 3.4A).
Xác định kiểu gen NAT2 bằng giải trình tự
SNP Đồng hợp tử kiểu dại Dị hợp Đồng hợp tử đột biến
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 3 5 Kết quả xác định các kiểu gen NAT2 trên BioEdit version 7.1.9
Hình 3.5 trình bày kết quả phân tích kiểu gen của 6 alen NAT2*5 thông qua phần mềm BioEdit 7.1.9 Các kiểu gen này cung cấp thông tin quan trọng về sự đa dạng di truyền của alen.
*6, *7, *11, *12, *13 đều xuất hiện trong mẫu nghiên cứu của chúng tôi.
Kết quả phân bố tần số alen và tỷ lệ kiểu gen, kiểu hình NAT2
Kết quả phân tích trên 100 mẫu nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ 6 alen NAT2*5, *6,
Tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa dựa trên 3 SNP và 6 SNP là giống nhau, với tỷ lệ acetyl hóa nhanh, trung bình và chậm lần lượt là 25%, 38% và 37% (Bảng 3.3) Các giá trị cụ thể cho các SNP 7, 11, 12, 13 là 6%, 32%, 12%, 6%, 7% và 49% (Bảng 3.2).
Bảng 3 2 Kết quả phân tích kiểu gen và tần số của đa hình NAT2
Tần số alen p - value χ 2 Đồng hợp tử kiểu dại
Dị hợp tử Đồng hợp tử đột biến
Bảng 3 3 Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trên 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam
Kiểu hình Nhanh Trung bình Chậm Tổng
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
BÀN LUẬN
Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyền NAT2
Nhóm nghiên cứu đã chọn hai phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự để thực hiện nghiên cứu, nhờ vào những ưu điểm bổ sung của mỗi phương pháp Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả của từng phương pháp trong việc phân tích các kiểu gen NAT2.
Khó khăn trong việc nhân dòng gen NAT2 chủ yếu do độ dài đoạn gen cần khuếch đại vượt quá 1 kb Thêm vào đó, các loại thuốc mà bệnh nhân đã sử dụng có thể tồn tại trong mẫu DNA, gây ức chế cho phản ứng PCR Do đó, chúng tôi quyết định sử dụng Kapa2G T M để khắc phục vấn đề này.
Robust Hotstart Ready Mix đã có sẵn tất cả các chất cần thiết cho PCR, trừ mồi và
Enzym Kapa2G giúp đơn giản hóa quy trình thao tác và giảm thời gian thực hiện từ 20% đến 50% so với các enzym khác Điểm mạnh nổi bật của enzym này là khả năng thực hiện PCR ngay cả khi có sự hiện diện của các chất ức chế hoặc khi mẫu DNA có độ tinh sạch chưa cao.
Mặt khác, ngoài hoạt tính 5’-3’ DNA polymerase, Kapa2G còn có hoạt tính 5’-3’ exonuclease cho phép tăng độ chính xác trong quá trình khuếch đại gen [63]
Ngoài enzym Kapa2G, HotStartTaq DNA polymerase của hãng QIAGEN cũng cho kết quả nhân dòng với hiệu suất và độ đặc hiệu cao Ưu điểm của HotStartTaq
DNA polymerase QIAGEN cho phép nhân dòng dễ dàng ngay cả với các mẫu có nồng độ DNA thấp và các mẫu DNA phức tạp Buffer PCR đi kèm hỗ trợ quá trình này một cách hiệu quả.
QIAGEN được phát triển với điều kiện ủ mồi nghiêm ngặt và nồng độ Mg 2+ cao hơn so với các buffer PCR thông thường, giúp tăng cường hiệu suất và độ đặc hiệu của phản ứng.
Enzym của QIAGEN có ưu điểm nổi bật nhờ vào dung dịch Q, một chất không độc hại thay thế cho DMSO Dung dịch này giúp điều chỉnh độ tan chảy của DNA, tạo điều kiện thuận lợi cho việc khuếch đại các mẫu khó bằng các enzym thông thường.
4.1.2 Phương pháp giải trình tự
Phương pháp giải trình tự gen được xem là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định đột biến, được áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực di truyền y học Nhờ vào sự phát triển của công nghệ y sinh, chi phí giải trình tự mẫu tại Việt Nam ngày càng giảm và số lượng cơ sở giải trình tự tăng lên Điều này cho phép các cơ sở y tế không có hệ thống giải trình tự có thể gửi mẫu đến các cơ sở khác để phân tích Giải trình tự gen mang lại thông tin chi tiết về các điểm đột biến, bao gồm loại và vị trí của chúng, đồng thời giúp xác định chính xác các điểm đột biến trên toàn bộ hệ gen.
Giải trình tự gen là phương pháp hiệu quả để xác định chính xác tất cả các đa hình trong đoạn gen cần nghiên cứu, đặc biệt hữu ích cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý Một gen có thể chứa nhiều đột biến liên quan đến nhiều bệnh khác nhau, do đó, việc giải trình tự giúp cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ cho các đối tượng nghiên cứu Trong nghiên cứu này, cặp mồi được sử dụng cho phép nhân dòng toàn bộ vùng gen mã hóa enzym NAT2, từ đó cung cấp thông tin di truyền phong phú về gen NAT2, bao gồm cả các alen khác Việc xác định tất cả các đa hình trên gen NAT2 lần đầu tiên đã tạo ra bộ dữ liệu đa hình di truyền gen NAT2 cho bệnh nhân lao.
Hiện nay phương pháp giải trình tự đang được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
Các đột biến DNA đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá nguy cơ ung thư và xác định hiệu quả của các liệu pháp điều trị đích sinh học Chúng giúp chẩn đoán nguy cơ mắc bệnh và tình trạng các bệnh lý thần kinh, cũng như các bệnh lý di truyền như bệnh Parkinson.
Huntington, teo cơ Lateral Sclerosis và các loại bệnh mất trí nhớ như bệnh Alzheimer
Giải trình tự gen không chỉ hỗ trợ chẩn đoán chính xác các loại virus, vi khuẩn và nấm, mà còn đánh giá mối liên hệ giữa đột biến và khả năng đáp ứng hoặc kháng thuốc Sự gia tăng ứng dụng của giải trình tự trong y sinh học, dược học và các lĩnh vực liên quan ngày càng khẳng định tầm quan trọng của phương pháp này.
Phương pháp PCR-RFLP nổi bật với thời gian thao tác nhanh, chi phí thấp và tính dễ thực hiện, khiến nó trở thành lựa chọn phổ biến cho nhiều nhà nghiên cứu Phương pháp này thường được sử dụng để phân tích kiểu hình acetyl hóa qua ba alen NAT2*5, *6.
Khi áp dụng vào thực hành lâm sàng, phương pháp RFLP là một lựa chọn hiệu quả cho những bệnh nhân cần nhận kết quả nhanh chóng.
Phân tích RFLP của ba alen NAT2*5, *6, *7 cho thấy kết quả kiểu gen hoàn toàn tương đồng với giải trình tự Các kiểu hình xác định dựa trên ba SNP và sáu SNP trong nghiên cứu không có sự khác biệt, hoàn toàn giống nhau Do đó, chúng tôi khuyến cáo nên sử dụng kỹ thuật RFLP để dự đoán kiểu hình acetyl hóa thông qua ba alen NAT2*5, *6, *7.
Về đa hình di truyền NAT2
4.2.1 Tần số alen và tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa
Các biến thể di truyền của gen NAT2 có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng acetyl hóa tại gan, từ đó tác động đến quá trình chuyển hóa thuốc và độ nhạy cảm với một số bệnh Nhiều nghiên cứu hiện nay thường bỏ qua các đa hình không làm thay đổi chức năng của enzym, chỉ tập trung vào một số đột biến "chỉ thị" như NAT2*5, *6, *7, *11, *12 và *13, điều này hạn chế khả năng hiểu biết về toàn bộ vai trò của NAT2 trong cơ thể.
Our research at the School of Medicine and Pharmacy, VNU, involved over 100 Vietnamese patients with tuberculosis The findings revealed the allele frequencies of NAT2 variants: NAT2*5 at 6%, NAT2*6 at 32%, NAT2*7 at 12%, NAT2*11 at 49%, NAT2*12 at 6%, and NAT2*13 at 7%.
Kết hợp dữ liệu tần số alen NAT2 đã được công bố, tôi tiến hành so sánh kết quả nghiên cứu với các vùng và lãnh thổ khác nhau.
Alen NAT2*5 xuất hiện với tần số dưới 10% ở quần thể Đông Á, nhưng lại có tần số cao từ 29% đến 45% ở các quần thể khác Alen NAT2*7 có tần số thấp dưới 3% ở quần thể Châu Âu và Châu Phi, trong khi ở Đông Á, tần số cao nhất là 19%, và nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận là 12% (p 0,256) Alen NAT2*6 chiếm tỷ lệ đáng kể, dao động từ 23% đến 36% ở các vùng khác nhau.
Tỷ lệ phân bố các alen NAT2*11 giữa các vùng địa lý không có sự chênh lệch nhiều, trong khi NAT2*12 và *13 lại có sự khác biệt rõ rệt, với tỷ lệ nhỏ hơn 10% ở người Việt Nam và Đông Á, nhưng trên 35% ở các khu vực khác Điều này cho thấy sự khác nhau trong tỷ lệ phân bố alen giữa các vùng và dân tộc, mặc dù các vùng địa lý gần nhau, như nhóm dân tộc Kinh tại thành phố Hồ Chí Minh và người Đông Á, lại có sự tương đồng Sự tương đồng này chứng tỏ ảnh hưởng của yếu tố địa lý đến cấu trúc di truyền của quần thể.
Hình 4.1 trình bày tần số phân bố của các alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12 và *13 tại một số vùng và khu vực trên toàn cầu, với các mẫu được sắp xếp theo vị trí địa lý.
Châu Phi (n = 661), Châu Mỹ (n = 347), Châu Âu (n = 503) , Hồ Chí Minh ( Dân tộc Kinh ở thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam, n = 198), nghiên cứu (nhóm người Việt
Nam mắcl lao, n = 100), Đông Á (n = 504), Nam Á (n = 489) [61]
Nghiên cứu về tần số các alen liên quan đến kiểu hình acetyl hóa chậm và tỷ lệ kiểu hình này đang được tiến hành trên toàn thế giới Các nghiên cứu cũng xem xét nồng độ INH sau khi uống và liều điều trị phù hợp cho từng cá nhân Theo Geetha Ramachandran và S Swaminathan (2012), tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm ở người Mông Cổ, giống như ở người Eskimos, là 10%.
Nhật Bản và Trung Quốc, 90% ở Trung Đông, 60% ở Negroid, da trắng và Nam Ấn
Châu Phi Châu Mỹ Châu Âu Nghiên cứu Hồ Chí
NAT2*5 NAT2*6 NAT2*7 NAT2*11 NAT2*12 NAT2*13
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Độ và 72% ở Mỹ [49] Kiểu hình acetyl hóa chậm trong nghiên cứu của chúng tôi là
37%, thấp hơn so với Ấn Độ, Mỹ và Negroid; cao hơn ở người Mông Cổ, Nhật bản và
Nghiên cứu của Audrey Sabbagh và cộng sự năm 2011 trên 99 quần thể khác nhau cho thấy sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm có liên quan đến nghề nghiệp tại mỗi quốc gia hoặc vùng lãnh thổ Sự thích ứng với điều kiện môi trường đã ảnh hưởng đến bộ gen con người, dẫn đến sự thay đổi tần số alen để phù hợp với biến đổi môi trường.
Hình 4 2 Sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm trên 99 quần thể trên thế giới
Biểu đồ hình tròn báo cáo tỷ lệ phần trăm, trong đó màu cam đại diện cho tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm, trong khi màu vàng thể hiện tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa nhanh và trung bình.
Nghiên cứu của Toure A và cộng sự trên 96 bệnh nhân lao đã sử dụng hai phương pháp chính để đo nồng độ INH trong huyết tương sau khi uống, cụ thể là tại thời điểm 3 giờ và 6 giờ nhằm xác định chỉ số acetyl hóa và kiểu hình acetyl hóa (nhanh hay chậm), cũng như xác định kiểu gen NAT2 qua PCR - RFLP hoặc giải trình tự Kết quả cho thấy các alen NAT2*4, *5A, *6A, *13A là quan trọng nhất, và kiểu hình acetyl hóa tương đồng giữa hai phương pháp Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nồng độ INH huyết tương sau 3 giờ và 6 giờ ở nhóm acetyl chậm cao hơn so với nhóm acetyl nhanh.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Donald và cộng sự đã nghiên cứu tác động của liều isoniazid và kiểu gen
Nghiên cứu về NAT2 dựa trên dược động học và dược lực học của INH ở người lớn mắc lao phổi cho thấy rằng acetyl hóa nhanh của INH với liều 6 mg/kg/ngày có tác dụng tương đương với liều 3 mg/kg/ngày của kiểu hình acetyl hóa chậm Nhóm nghiên cứu cảnh báo rằng việc giảm liều INH xuống dưới 6 mg/kg có thể gây bất lợi cho những người có kiểu hình acetyl hóa nhanh, trong khi liều 3 mg/kg là đủ cho người có kiểu hình acetyl hóa chậm để đạt nồng độ INH điều trị hiệu quả.
326 người bệnh ở Ấn Độ cho thấy tỷ lệ acetyl hóa chậm, trung bình, nhanh lần lượt là
Sau 2 giờ sử dụng INH đơn độc (6 mg/kg), nồng độ INH trong máu của các kiểu hình acetyl hóa chậm, trung bình và nhanh lần lượt là 10,2 àg/mL, 8,1 àg/mL và 4,1 àg/mL Điều này cho thấy người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm sẽ có nồng độ INH cao hơn so với các kiểu hình còn lại.
Nồng độ INH trong máu cao hơn ở kiểu hình acetyl hóa chậm so với hai kiểu hình còn lại, dẫn đến sự gia tăng các chất trung gian độc hại cho cơ thể Một nghiên cứu trên 201 bệnh nhân tại Ấn Độ đã xác định tần số các đa hình NAT2 và mối liên quan giữa kiểu hình acetyl hóa và nồng độ INH, với kết quả tần số tương đương 55%, 32%, và 13% Tuy nhiên, nồng độ INH trong huyết tương của kiểu hình acetyl hóa chậm lại cao hơn so với các nghiên cứu trước đó.
Hình 4 3 Nồng độ INH sau 2 giờ của mỗi kiểu hình acetyl hóa[26]
Nghiên cứu cho thấy bệnh nhân có kiểu hình acetyl hóa chậm cần sử dụng liều INH thấp hơn liều khuyến cáo Một nghiên cứu ngẫu nhiên trên 172 bệnh nhân tại Nhật Bản vào năm 2013 đã xác nhận hiệu quả của việc điều trị liều INH theo kiểu gen.
NAT2 có vai trò quan trọng trong việc cải thiện khả năng dung nạp thuốc và nâng cao hiệu quả của phác đồ điều trị 6 tháng cho bệnh nhân lao phổi mới Nghiên cứu này nhằm xác định tỷ lệ tổn thương liên quan đến việc sử dụng NAT2 trong điều trị.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU gan do INH (INH-DILI) trong 8 tuần điều trị và tỷ lệ thất bại điều trị sớm ở tuần thứ 8