Khóa luận lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở việt nam dựa trên chỉ thị GBSSI

TỔ NG QUAN TÀI LI Ệ U

Đa dạ ng di truy ề n

Đa dạng sinh học là sự phong phú của sự sống trên Trái Đất, bao gồm hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, cùng với sự phong phú về nguyên liệu di truyền và các hệ sinh thái phức tạp Đa dạng sinh học được chia thành ba cấp độ: đa dạng gen, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái Đa dạng gen đề cập đến sự biến đổi các đặc điểm di truyền trong loài và quần thể, giúp các quần thể thích nghi với môi trường sống thay đổi Dưới áp lực như chọn lọc nhân tạo và môi trường sống khắc nghiệt, một số cá thể trong quần thể có khả năng sở hữu những biến dị alen phù hợp hơn, từ đó duy trì nòi giống và tạo ra nhiều thế hệ tiếp theo.

Đa dạng di truyền là yếu tố cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo ra sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể Nó không chỉ xuất hiện trong phạm vi một loài mà còn giữa các loài và hệ sinh thái, đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của sự đa dạng sinh giới Nghiên cứu về đa dạng di truyền cung cấp những hiểu biết chính xác về sự khác biệt giữa các loài, tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn chưa nhận được sự quan tâm đúng mức, mặc dù nó là nền tảng cho sự phong phú của sinh vật.

1.1.2 Phân loại học sinh vật

Phân loại học sinh vật là quá trình sắp xếp các sinh vật thành các đơn vị phân loại (taxon) dựa trên những đặc điểm chung, giúp dự đoán vị trí của chúng trong hệ thống phân loại và hiểu rõ hơn về quá trình tiến hóa Hệ thống phân loại còn có ý nghĩa thực tiễn quan trọng, nhờ vào danh pháp khoa học, giúp tránh nhầm lẫn do nhiều sinh vật có tên dân gian khác nhau ở các vùng miền.

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Có nhiều phương pháp nghiên cứu trong phân loại và xác định loài động, thực vật, chủ yếu dựa trên nguyên tắc các loài có chung nguồn gốc và tính chất tương đồng Sự giống nhau có thể thể hiện qua đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hóa và phôi sinh học Đối với thực vật, việc nhận diện dựa trên hình thái như lá, hoa, quả và cách phân cành dễ quan sát nhưng hiệu quả thấp khi mẫu vật không còn nguyên vẹn Do đó, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ chính xác hơn khi kết hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại.

Ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại học là một phương pháp mới, giúp xác định các loài dựa trên trình tự DNA nucleotit của đoạn gen đặc trưng Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong việc giải quyết các vấn đề về loài đồng hình và nghiên cứu các biến dị Dữ liệu về trình tự DNA nucleotit của các loài được tổ chức thành hệ thống dữ liệu mã vạch DNA.

Phân loại học phân tử dựa vào nghiên cứu các gen trong hệ gen nhân, hệ gen của bào quan như ty thể và lục lạp, cùng với các sản phẩm của gen như protein và enzym Mỗi loại gen và sản phẩm gen phục vụ cho các đối tượng và mục đích nghiên cứu khác nhau Các kỹ thuật phổ biến như isozym, giải trình tự DNA, đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP), đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD), và đa hình chiều dài các đoạn DNA được nhân bản (AFLP) đã giúp làm rõ vị trí phân loại, đánh giá tính đa dạng di truyền, và nghiên cứu mối quan hệ chủng loại cũng như tiến hóa của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật.

Các kỹ thuật này được sử dụng như chỉ thị phân tử để xác định các gen liên quan đến tính trạng của cá thể, loài hoặc nhóm loài.

1.1.3 Thực trạng đadạng sinh học tại Việt Nam

Việt Nam đứng thứ 16 trong bảng xếp hạng về đa dạng sinh học, được công nhận là một trung tâm đa dạng sinh học toàn cầu với các hệ sinh thái tự nhiên phong phú và đa dạng.

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU đa dạng.Trong đó,đã xác định được khoảng 49.200 loài sinh vật bao gồm: khoảng

Việt Nam sở hữu một hệ sinh thái phong phú với 7.500 chủng vi sinh vật, 20.000 loài thực vật cả trên cạn và dưới nước, 10.500 loài động vật trên cạn, 2.000 loài động vật không xương sống và cá nước ngọt, cùng với khoảng 11.000 loài sinh vật biển Đặc biệt, nhiều loài thực vật và động vật tại đây có những đặc tính quý hiếm, mang lại tiềm năng phát triển và giá trị kinh tế cao cho đất nước.

Việt Nam sở hữu 500 loài dược liệu, trong đó có nhiều loài quý hiếm và đa dạng sinh học phong phú, nhưng sản phẩm từ dược liệu chưa được khai thác và sử dụng rộng rãi Chi Hedera, với 16 loài trên thế giới, chỉ có H.nepalensis và H.helix được chứng minh có tác dụng dược lý Tuy nhiên, H.nepalensis vẫn thiếu nghiên cứu về tiềm năng dược lý và đa dạng sinh học, đặc biệt trong việc bảo tồn và phát triển nguồn gen Hơn nữa, việc phân loại Dây Thường Xuân dựa vào đặc điểm hình thái có thể gây nhầm lẫn do sự biến đổi lớn ở lá cây Do đó, cần phân tích đa dạng di truyền và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng để khai thác hiệu quả và quản lý bền vững nguồn tài nguyên dược liệu.

Mã vạch DNA là một công nghệ mới cho phép nhận diện loài một cách nhanh chóng và chính xác bằng cách sử dụng đoạn DNA ngắn Công nghệ này có tiềm năng lớn trong phân loại học, khoa học pháp y, công nghệ sinh học, và ngành thực phẩm, giúp xác định và phân định ranh giới giữa các loài Với khoảng 300.000 loài thực vật trên toàn cầu, việc phân loại chính xác vẫn là thách thức lớn ngay cả với các chuyên gia Phương pháp phân loại truyền thống dựa vào chỉ thị hình thái và giải phẫu tốn nhiều thời gian và công sức, đồng thời chỉ hiệu quả ở một số giai đoạn sống và giới tính nhất định của loài.

Mã vạch DNA đã mang lại tác động tích cực đến phân loại học, khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống và ngày càng trở nên phổ biến trên toàn cầu Đặc điểm nổi bật nhất của mã vạch DNA là tính đặc hiệu cao và dễ sử dụng.

Một mã vạch DNA lý tưởng cần đáp ứng ba tiêu chí chính: đầu tiên, nó phải có độ đột biến đủ để phân biệt các loài khác nhau, đồng thời có vùng bảo tồn để nhận diện các cá thể trong cùng một loài Thứ hai, mã vạch này cần phổ biến trong các loài để phục vụ cho nhiều nhóm phân loại khác nhau Cuối cùng, đoạn DNA phải đủ ngắn để dễ dàng xử lý và phân tích.

Các đoạn DNA dài khoảng 700 bp hoặc nhỏ hơn chứa thông tin di truyền cần thiết để xác định nhanh chóng các loài trong nhóm phân loại của chúng Cuối cùng, các vị trí mồi được bảo tồn tốt, giúp khuếch đại và giải trình tự DNA với độ tin cậy cao.

Năm 2004, hiệp hội mã vạch cho cuộc sống được thành lập nhằm xây dựng công cụ mã vạch chính xác cho nghiên cứu phân loại thực vật và động vật Năm 2006, Hebert và cộng sự đề xuất gen ti thể cytochrom oxyase tiểu đơn vị 1 (CO1) làm trình tự mã vạch chung cho động vật, và từ đó, nhiều ấn phẩm đã chứng minh tính hữu ích của nó trong phân loại loài CO1 không chỉ chứa vùng trình tự bảo tồn cao mà còn có đủ biến dị để phân biệt các nhóm trong loài, đồng thời cho phép phân biệt nhiều mẫu động vật cùng tổ tiên, kể cả những mẫu đã lưu trữ lâu Đối với thực vật, gen lục lạp được coi là mã vạch tin cậy do sự biến đổi chậm của hệ gen ty thể.

Tổng quan về loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch)

ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Hình 1.1 Cấu trúc một phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae Mũi tên chỉ vị trí cặp mồi nhân dòng [39]

1.2 Tổng quan về loài Dây Thường Xuân ( Hedera nepalensis K.Koch) 1.2.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây Thường Xuân

* Đặc điểm hình thái chung của chi Hedera

Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật như sau:

Phân lớp Hoa hồng Rosidae

Chi Hedera hiện nay có 16 loài đã được ghi nhận, đặc trưng bởi hình thái dây leo và khả năng tạo thành lớp bao phủ mặt đất với chiều cao đa dạng.

Hedera là loại cây leo có chiều dài từ 6-10 cm và có khả năng leo cao tới 30 m nhờ vào hệ thống rễ mọc ký sinh tạo ra chất bám dính Lá cây thuộc loại lá đơn, không có lá kèm, với phiến lá phân thùy dài 5-10 cm và rộng 3-8 cm, có gân chân vịt Cụm hoa của cây hình chùy, bao gồm nhiều tán và có lông sao, với hoa nhỏ màu vàng trắng và lục trắng, cùng với lá bắc rất nhỏ và dài.

Cây có 5 răng nhỏ, tràng 5, gốc rộng và một mào cuốn ở giữa, nhị 5 và bầu 5 Quả hạch hình tròn, mọng, dài từ 5-9 mm, đường kính 6-9 mm, trọng lượng trung bình khoảng 281,5 mg, chứa từ 2-5 hạt Khi chín, quả có màu đen.

* Đặc điểm hình thái loài Hedera nepalensis

H.nepalnensis K.Koch là loài có dây leo có thể dài tới 20 m, có nhiều rễ mọc ký sinh ở các mắt, lá đơn, cụm hoa mọc dấu ở cành thành tán tròn hoặc tán ngù, mọc rải rác trong rừng thưa; phổ biến ở độ cao 1000-3000 m [3]

Hình 1.2 Cây Dây Thường Xuân [53]

1.2.2 Đặc điểm phân bố địa lý

Hedera nepalensis K Koch thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), có nguồn gốc từ Nepal, Bhutan cũng như ở Trung Quốc, Afganistan, Ấn Độ, Lào, Thái Lan,

Myanmar và Việt Nam có độ cao từ 1000 đến 3000 m Tại Việt Nam, Dây Thường Xuân xuất hiện ở một số vùng núi cao phía Bắc như Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn.

Hình 1.3 Phân bốđịa lý của Dây Thường Xuân tại phía Bắc Việt Nam [2]

Theo nhiều nghiên cứu, thành phần hóa học chính trong lá và thân của H.nepalensis K Koch là saponin, trong đó hai hợp chất hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A có tác dụng chống ung thư đã được T Li và cộng sự phân lập vào năm 2015 Ngoài ra, H.nepalensis còn chứa các hợp chất phenolic có khả năng chống oxy hóa, được xác định bằng phương pháp so màu với quercetin và axit gallic Để định lượng, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được áp dụng, phát hiện catechin và caffeic trong phân đoạn etyl acetate Các phân tích hóa sinh cũng cho thấy Dây Thường Xuân chứa nhiều nhóm chất khác như carbohydrate, protein, alkaloid, tanin, terpenoid và phytosterol.

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A [26]

Bộ phận dùng: rễ, thân, lá và quả tươi hoặc phơi khô

Dây Thường Xuân có vị đắng và tính mát, giúp khu phong, giải độc, hoạt huyết và tiêu sưng Trong khi đó, quả của cây này có vị ngọt và tính ấm, thường được sử dụng để trừ phong huyết.

Công dụng của lá thường xuân bao gồm việc chữa trị sưng đau hiệu quả Để thực hiện, bạn có thể chế rượu từ lá thường xuân đã giã nhỏ, sau đó gạn lấy dịch để uống, trong khi phần bã còn lại được dùng để đắp vào vùng sưng đau Ngoài ra, lá thường xuân cũng hỗ trợ điều trị các vấn đề về mụn lở.

Cây Dây Thường Xuân, với thân hoặc rễ được sắc thuốc hoặc ngâm rượu, có tác dụng chữa huyết bế trong bụng và giảm triệu chứng đau lưng, mỏi gối ở người già Tại Ấn Độ, lá cây được dùng làm thuốc chườm nóng để trị sưng hạch, trong khi quả của cây được hãm uống để điều trị thấp khớp.

Tác dụng chống đái tháo đường:

Một nghiên cứu trên chuột mắc bệnh tiểu đường đã được thực hiện để đánh giá hiệu quả của dịch chiết thô từ H.nepalensis Hiệu quả được xác định thông qua nồng độ glucose đo bằng máy đo đường huyết, và các thông số giữa chuột được điều trị và không được điều trị đã được so sánh Kết quả nghiên cứu cho thấy

H.nepalensis làm giảm đáng kể mức đường huyết theo thời gian và làm phục hồi chức năng gan [26] Nghiên cứu khác cũng chỉ ra H.nepalensis chứa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính ức chế dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) Một trong số cơ chế của thuốc chống đái tháo đường hiện nay dựa trên nguyên lý ức chế DPP-4, đây là một enzym phá hủy incretins Incretins là hóc-môn tựnhiên do cơ thể tiết ra lượng lớn sau bữa ăn, với vai trò điều chỉnh lượng đường huyết thông qua kích thích tuyến tụy tiết insulin Khi ức chế enzym DPP-4 sẽ làm tăng nồng độ và kéo dài thời gian tác dụng của incretins, làm tăng tiết insulin và giảm tiết glucagon trong tuần hoàn, dẫn đến giảm glucose máu Do đó, H.nepalensis được đánh giá có tiềm năng trong điều trịđái tháo đường [44]

Tác dụng chống oxy hóa:

Nghiên cứu của Samia Inayatullah và cộng sự về tiềm năng chống oxy hóa của dịch chiết methanol H.nepalensis thử nghiệm trong môi trường nước và lipid

Khả năng chống oxy hóa đã được nghiên cứu tại Việt Nam thông qua các xét nghiệm quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và ABTS (2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) Đồng thời, hoạt tính chống oxy hóa trong lipid được xác định bằng cách đánh giá chỉ số ôi hóa thông qua TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive Substances).

Các chất nghiên cứu có khả năng chống oxy hóa thông qua cơ chế diệt gốc tự do, giúp giảm màu của dung dịch chứa nồng độ chất tự do xác định Khả năng chống oxy hóa được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bước sóng thích hợp Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng gốc DPPH đạt 26,7 ± 0,2 (mM TE/g), ABTS là 54,7 ± 1,6 (mmol TE/g), và TBARS là 393 ± 3,4 (mmol TE/g).

Trong đú, mM TE/g là àmol đương lượng chất chuẩn Trolox (Trolox Equivalent -

TE) trên 1 g chất khô Hai hợp chất chính trong dịch chiết thô của H.nepalensis có chất có khảnăng chống oxy hóa là axit chlorogen và rutin [36]

Nghiên cứu về các chất chống oxy hóa tự nhiên đã chỉ ra khả năng chống oxy hóa của H.nepalensis thông qua việc phân tích các hợp chất polyphenolic Nguyên liệu nghiên cứu bao gồm dịch chiết thô và các dịch chiết phân đoạn từ n-hexan, ethyl acetate và nước Hàm lượng flavonoid và phenolic được xác định bằng phương pháp so màu với quercetin và axit gallic Kết quả cho thấy hàm lượng flavonoid đạt 2,4 ± 0,164 QE/100 mg và hàm lượng phenolic là 12,90 ± 0,15 mg GAE/100 mg, cho thấy tiềm năng cao của H.nepalensis trong việc cung cấp các chất chống oxy hóa tự nhiên.

Tác dụng chống oxy hóa của H nepalensis được đánh giá qua khả năng loại bỏ hydro peroxide (H2O2), với các chiết xuất thô và phân đoạn cho thấy chỉ số IC50 từ 31,19 đến 200 µg/mL Trong số đó, dịch chiết ethyl acetate có khả năng chống oxy hóa cao nhất, tiếp theo là dịch chiết n-hexan và cuối cùng là dịch chiết nước.

Tác dụng chống ung thư:

Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Tách chiết axit deoxyribonucleic (DNA) tổng số là quá trình loại bỏ DNA khỏi protein và các vật liệu tế bào khác bằng các phương pháp vật lý và hóa học Quá trình này lần đầu tiên được thực hiện bởi Friedrich Miescher vào năm 1869 và thường là một trong những bước tốn nhiều công sức nhất trong phân tích DNA Thời gian tách chiết có thể khác nhau, có thể cần ủ qua đêm hoặc chỉ mất vài phút đến vài giờ tùy thuộc vào quy trình cụ thể.

Quá trình tách chiết DNA cần được thực hiện cẩn thận để tránh nhiễm mẫu và nhiễm chéo Các phương pháp phân lập DNA phải đảm bảo lượng DNA thu được đủ lớn, có độ tinh khiết cao và ít bị đứt gãy, nhằm phục vụ cho các quy trình phân tích tiếp theo một cách hiệu quả.

Khả năng chiết xuất DNA chất lượng cao là rất quan trọng trong nghiên cứu di truyền phân tử của sinh vật Khác với tế bào động vật, tế bào thực vật có vách tế bào dày và chứa nhiều polysacarit cũng như tannin, khiến việc loại bỏ chúng trở nên khó khăn Việc phân lập DNA từ mô thực vật cần có sự hỗ trợ của carbohydrate và enzym để đảm bảo quá trình ly giải tế bào diễn ra hiệu quả Ngoài ra, các chất gây nhiễm như polysacarit, polyphenol và các hợp chất hữu cơ khác có thể ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng DNA và ức chế phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR).

Bước đột phá trong việc phân lập DNA bắt đầu vào năm 1980 nhờ vào ứng dụng của cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB), được nghiên cứu bởi M.G Murray và W.F Thompson Ngày nay, CTAB đã trở thành hóa chất phổ biến trong việc tách chiết DNA từ nhiều loài thực vật Kỹ thuật này dựa trên khả năng tạo kết tủa chọn lọc DNA với CTAB, một chất tẩy cation có khả năng kết tủa DNA ở nồng độ muối cao, trong khi các tạp chất không tạo kết tủa sẽ được loại bỏ Sau khi kết tủa DNA với CTAB, DNA sẽ được hòa tan trong dung dịch muối nồng độ thấp.

Sử dụng NaCl 1N kết hợp với các bộ kit thương mại giúp tiết kiệm thời gian và tách DNA với độ tinh khiết cao nhờ nguyên lý trao đổi ion trên màng silica, bên cạnh phương pháp tách bằng hóa chất CTAB.

Trong quá trình tách chiết DNA thực vật, chưa có phương pháp nào được xác định là tối ưu nhất Năng suất DNA có sự khác biệt giữa các loài và mô, phụ thuộc vào kích thước bộ gen, số lượng tế bào và độ tuổi của từng mẫu.

Để đánh giá hiệu quả của phương pháp tách chiết DNA, cần xem xét không chỉ nồng độ và độ tinh sạch của DNA mà còn khả năng phân lập thành công các đoạn gen đích thông qua kỹ thuật PCR.

1.3.2 Phương pháp khuếch đại đoạn gen đích bằng PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là kỹ thuật quan trọng trong sinh học phân tử, sử dụng enzym DNA polymerase để tổng hợp DNA mới từ mẫu DNA khuôn Quy trình PCR diễn ra qua ba giai đoạn chính: đầu tiên là giai đoạn biến tính, nơi nhiệt độ cao (94-98°C) làm tách mạch DNA thành hai mạch; tiếp theo là giai đoạn gắn mồi, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA khuôn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như đặc tính và trình tự của mồi; cuối cùng là giai đoạn kéo dài, trong đó DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA mới bằng cách thêm các dNTPs từ hỗn hợp.

Quá trình phản ứng diễn ra theo chiều từ 5'-3', với sản phẩm tạo thành trở thành nguyên liệu cho chu kỳ tiếp theo Số lượng phân tử DNA tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ, bắt đầu từ một phân tử DNA ban đầu, sau n chu kỳ sẽ tạo thành 2^n phân tử DNA.

Hình 1.5 Giải trình tựtheo phương pháp Sanger

Giải trình tự gen là phương pháp xác định trình tự của bốn loại nucleotit trong DNA, dựa trên kỹ thuật Sanger với việc sử dụng 2’, 3’-dideoxynucleotit (ddNTP) thiếu nhóm C3’-OH Nhóm 3’-OH cho phép gắn thêm nucleotit mới vào chuỗi; khi ddNTP được thêm vào, sự thiếu hụt này khiến phản ứng tổng hợp dừng lại, tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau.

Trong thí nghiệm của Sanger, bốn ống nghiệm riêng biệt được chuẩn bị với đoạn mồi, DNA khuôn và dNTP, mỗi ống chỉ bổ sung một loại ddNTP đã được đánh dấu phóng xạ Sau khi thực hiện phản ứng tổng hợp, sản phẩm được điện di trên gel polyacrylamide Kết quả thu được là hỗn hợp các phân tử DNA sao chép không hoàn chỉnh, có cùng chiều dài ở đầu 5’ nhưng khác nhau về chiều dài và nucleotide kết thúc ở đầu 3’, với kích thước chênh lệch nhau một nucleotide.

Phương pháp giải trình tự gen thủ công theo Sanger được sử dụng phổ biến, nhưng để giải trình tự DNA ở hệ gen lớn, phương pháp tự động là lựa chọn chủ yếu Phương pháp này sử dụng các ddNTP gắn chất phát quang khác nhau, với nguồn sáng Argon kích thích chúng, tạo ra các màu sắc tương ứng với từng loại nucleotit Máy giải trình tự tự động có khả năng đọc trình tự dài từ 600 đến 1.000 bp, mang lại ưu điểm vượt trội về tự động hóa, tốc độ đọc nhanh và độ chính xác cao.

1.3.4 Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại

Phương pháp Ma trận khoảng cách (Distance Matrix) là một nhóm thuật toán lâu đời trong nghiên cứu tiến hóa, bắt đầu được áp dụng từ những năm 1990 Các thuật toán này giúp xác định mối quan hệ giữa các loài dựa trên các dấu hiệu hình thái Trong số đó, thuật toán UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) phân tích tất cả các dấu hiệu để xác định khoảng cách di truyền giữa các cặp mẫu, sau đó gộp những cặp mẫu có khoảng cách di truyền thấp nhất.

Các thuật toán dựa trên "ma trận khoảng cách" mang lại kết quả phân tích nhanh chóng và hiệu quả cho việc xử lý lượng dữ liệu lớn, cho phép xác định khoảng cách di truyền tương đối giữa các loài Tuy nhiên, chúng không thể phản ánh đầy đủ quá trình tiến hóa của từng gen.

Phương pháp Tiết kiệm tối đa - Maximum Parisimony

Thuật toán này dựa trên nguyên tắc sinh học cho rằng đột biến hiếm khi xảy ra, từ đó xác định cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có đột biến thấp nhất giữa các taxon được phân tích Cây tiến hóa này được gọi là cây tích phân tiến hóa tối ưu Giá trị tin cậy (bootstrap) được sử dụng để đánh giá độ tin cậy của từng nhánh cây, với yêu cầu đạt trên 70% để được coi là đáng tin cậy Phương pháp này có ưu điểm là tốc độ tính toán nhanh và tính khách quan cao, vì không đưa ra giả định nào về quá trình tiến hóa.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Đối tượ ng nghiên c ứ u

9 mẫu thực vật đã được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái thuộc loài

Hedera nepalensis được thu thập tại một số tỉnh miền núi phía Bắc, với các mẫu nghiên cứu được thực hiện bởi nhóm chuyên gia tại Viện Dược liệu, thông tin chi tiết được trình bày trong Bảng 2.1.

Một mẫu thuộc loài Hedera helix được sử dụng trong nghiên cứu để đối chiếu, lấy từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu: mẫu lá non, sạch đã được sấy khô và bảo quản trong túi silicagel chống ẩm

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu

Th ời gian, địa điể m nghiên c ứ u

Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2018 đến ngày 25 tháng 4 năm 2019, tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

TT Ký hi ệ u m ẫ u Đị a điể m l ấ y m ẫ u T ọa độ đị a lý

1 H1 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N-103°47'31.76"E

2 H2 B ả n Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E

3 H3 Tr ạ m cây thu ố c Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E

5 H5 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

6 H6 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

7 H15 B ả n Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E

8 H16 Phó B ảng, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E

9 H21 S ủng Là, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E

10 HH Vườ n Th ự c v ậ t Hoa Nam,

Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

For total DNA extraction, recommended chemical kits include the Dneasy Plant Mini Kit from Qiagen (Germany) and the GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit from Thermo Scientific (USA) Additionally, DNA isolation can be performed using the CTAB method, with an improved CTAB solution available from Merck, which consists of 3% CTAB (Tris 1M pH 8, EDTA, NaCl, and deionized water) and TE buffer (Tris 1M pH 8).

8, EDTA, nước khử ion); Isopropanol; Isoamylalcohol; Chloroform; β- mercaptoethanol

Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật PCR bao gồm dNTP mix và Phusion Polymerase từ Thermo Scientific, cùng với cặp mồi tổng hợp từ Phusa Biochem (Việt Nam) Cặp mồi này đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu trên thế giới, với trình tự mồi xuôi F: 5’CAC AAC TGT AAG ATC CTT TCA AA 3’ và mồi ngược R: 5’CAT ACG CAT AGC ATG TAA CTG 3’.

Electrophoresis chemicals include Agarose, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA, Affymetrix), and 5X DNA loading dye (Lonza) Essential tools for DNA analysis are the GeneRuler 100bp DNA Ladder and Lambda DNA/HindIII Ladder, both from Thermo Scientific Additionally, Tris base (Bio Basic) and acetic acid (Merck) are crucial components in preparing electrophoresis gels.

Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), Máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO,

The article highlights a range of laboratory equipment, including the EBA 21 centrifuge from Hettich Zentrifugen in Germany, the VELP shaker from Scientifica in Germany, and the NP80 spectrophotometer from Nanophotometer, also in Germany It also mentions the Fiocchetti flake ice maker from Italy, the Panasonic incubator from Japan, and deep freezers operating at -30°C and refrigerators at 4°C, both from Panasonic, as well as the FRIMED refrigerator from Japan.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.1

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA can be isolated using four methods: the Mini-CTAB method (Sanghai-Maroof et al., 1984), an improved CTAB method (Elias et al., 2004), the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany), and the GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, USA).

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Quy trình DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) thực hiện theo khuyến cáo của hãng

Quy trình CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 20 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 388 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C và bổ sung 12 àL β-mercaptoethanol

Bước 3: Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút trong khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút, cứ 20 phút đảo mẫu một lần

Bước 4: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 200 àL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút, dùng khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút trong 20 phút

Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 6: Hút dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 7: Bổ sung thể tích tương đương Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và 80 àL CTAB 3%

Bước 8: Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 9: Hỳt dịch pha trờn chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 140 àL isopropanol đã làm lạnh ở -20 o C

Bước 10: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 60 phút

Bước 11: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi

Bước 12: Bổ sung 0,5mL dung dịch ethanol 70%, búng đều

Ly tâm mẫu ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút ít nhất 12 giờ Cuối cùng, hòa tan tủa DNA trong 100 µL đệm TE và 2 µL RNase.

Quy trình Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 50 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 800 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút (cứ15 phút đảo mẫu một lần)

Bước 3: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 500 àL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút

Bước 4: Ly tâm lạnh ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 5: Hỳt 500 àL phần dịch bờn trờn và chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 6: Bổ sung 500 àL Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và

Bước 8: Hỳt 500 àL từ từ phần dịch bờn trờn (pha trong) và chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 350 àL isopropanol đó làm lạnh ở -20 o C

Bước 9: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 30 phút

Bước 11: Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút

Bước 12: Hũa tan DNA tủa trong 150 àL đệm

Với sự tiến bộ trong khoa học, nhiều phương pháp mới đã được phát triển để nâng cao hiệu suất phân lập DNA, đặc biệt là thông qua các bộ dụng cụ thương mại Hai bộ Mini Kit phổ biến trong việc tách chiết DNA tổng số từ thực vật là DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) Nguyên lý tách DNA của các bộ kit này dựa trên sự thay đổi pH, giúp tăng ái lực của DNA và gắn chúng lên màng silica Quá trình này bao gồm việc ly giải mẫu thực vật, loại bỏ tạp chất, gắn DNA lên màng silica và rửa giải để thu được DNA tinh khiết.

Axit ascorbic, axit diethyldithiocarbamic và 2-mercaptoethanol có khả năng bảo vệ DNA khỏi oxy hóa và biến tính Để loại bỏ RNA, có thể sử dụng enzyme RNase.

Hình 1.6 Nguyên lí hoạt động màng silica [58]

Hình 1.7 Sơ đồ mô tả quy trình tách chiết DNA sử dụng cột thu silica

Các bước tách chiết DNA sử dụng màng silica cơ bản gồm:

Bước đầu tiên trong quá trình tách chiết DNA là ly giải tế bào thực vật, sử dụng đệm ly giải kết hợp với các muối chaotropic Các muối này giúp phá vỡ cấu trúc tế bào bằng cách làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước, từ đó giải phóng DNA.

Bước 2: Loại bỏ tạp chất: thêm 1 số enzym có khả năng phân hủy protein,

RNASE để loại bỏ RNA

Bước 3: Gắn DNA lên bề mặt hạt silica bằng cách sử dụng muối hoạt động hoặc cồn, giúp phá vỡ lớp vỏ hydrat hóa xung quanh Quá trình này cho phép các ion tích điện dương tạo thành cầu nối muối giữa silica tích điện âm và DNA tích điện âm.

Bước 4 trong quy trình là rửa giải, nhằm loại bỏ các tạp chất còn sót lại trên màng silica gel và sử dụng ethanol để loại bỏ muối dư Sau khi thực hiện bước này, chỉ còn DNA gắn trên màng silica gel, và quá trình ly tâm sẽ được thực hiện để đảm bảo ethanol đã được loại bỏ hoàn toàn.

Bước 5: Giải phóng thu hồi DNA: DNA được giải phóng khỏi màng silica bằng cách giải hấp với dung dịch ion thấp, chẳng hạn như TE hoặc nước

Kiểm tra và định lượng DNA

Để kiểm tra sự có mặt của DNA, sản phẩm tách chiết được điện di trên gel agarose 1.2% trong vòng 30 phút với hiệu điện thế 100 V Mẫu DNA 4 µL được trộn với 1 µL đệm chứa ethidium bromide trong đệm TAE 1X Các băng DNA sẽ được hiện hình khi soi dưới ánh sáng tử ngoại Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được định lượng bằng cách đo chỉ số.

Tỷ lệ OD260/280, đo lường sự hấp thụ quang của DNA ở bước sóng 260 nm so với 280 nm, thường dao động trong khoảng 1.8-2.0 Giá trị này cho thấy DNA đã được tách chiết một cách tinh sạch.

2.4.2 Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Tất cả các phản ứng đều có đối chứng âm và đối chứng dương Phusion DNA polymerase được sử dụng cho phản ứng PCR với khả năng tạo những mẫu dài với độ chính xác và tốc độ cao chỉ với một enzyme duy nhất ngay cả ở những đoạn gen khó nhân dòng nhất Phusion DNA polymerase đem lại hiệu suất cao nhờ hoạt tính nhân dòng chiều 5’- 3’ và đọc sửa

3' - 5' (đây là hoạt tính enzyme cắt mạch DNA từ tận cùng đầu mút theo chiều 3' -

Khi DNA polymerase phát hiện một cặp base bổ sung không chính xác, nó sẽ đảo ngược chiều đi và loại bỏ base không khớp Sau khi cắt bỏ base sai, polymerase có khả năng lắp lại base chính xác và tiếp tục quá trình tái bản DNA.

Sản phẩm PCR được kiểm tra chất lượng bằng cách sử dụng gel agarose 1,5% trong đệm TAE, với thang chuẩn GeneRuler 100 bp DNA Ladder để xác định kích thước của sản phẩm.

2.4.3 Tinh sạch và giải trình tự Để thu được kết quả giải trỡnh tự chỳng tụi tiến hành thu 20 àL sản phẩm PCR gửi đi hãng First Base (Malaysia) để tinh sạch và giải trình tự Kết quả giải trình tự được hiển thị bằng phần mềm BioEdit version 7.2.6.1, qua đó xác định được kiểu gen của từng mẫu nghiên cứu

Khi đọc kết quả giải trình tự, mỗi nucleotit được biểu thị bằng một đỉnh có màu sắc đặc trưng: A là màu xanh lá cây, C là màu xanh da trời, G là màu đen, và T là màu đỏ Nếu tại vị trí của một nucleotit chỉ có một đỉnh màu xuất hiện, điều này cho thấy mẫu thực vật có kiểu gen đồng hợp tử Ngược lại, nếu có hai đỉnh màu xuất hiện, mẫu thực vật đó có kiểu gen dị hợp tử.

Hình 2.2 Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit

2.4.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen

Sử dụng phần mềm Sequencher 5.4.6 để chỉnh sửa chuỗi nucleotit, loại bỏ các pic nhiễu và không rõ ràng ở đầu và cuối chuỗi Phân tích phát sinh loài được thực hiện dựa trên trình tự DNA.

KẾ T QU Ả NGHIÊN C Ứ U

Tách chiết DNA tổng số

Kết quả điện di DNA từ 10 mẫu nghiên cứu cho thấy tất cả các mẫu đều thu hồi DNA tổng số thành công qua 4 quy trình tách chiết.

DNA tổng số từ các mẫu hiện hình với băng rõ nét tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn DNA, cho thấy rằng DNA ít bị đứt gãy trong quá trình thao tác.

Hình 3.1 Kết quả DNA tổng sốđiện di trên gel agarose 1,2%

Từ mẫu lá khô H.nepalensis được phân lập DNA bằng phương pháp Mini-

The CTAB method, along with the improved CTAB method (Elias et al., 2004), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany), and GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit, as shown in Table 3.1, demonstrates that the total DNA concentration varies from 10.5 to [insert value].

Phương pháp Mini-CTAB cho thấy hiệu quả cao nhất trong việc thu hồi DNA, với nồng độ trung bình đạt 437,4 ng/μL Trong khi đó, quy trình CTAB cải tiến mang lại nồng độ DNA trung bình là 237,7 ng/μL Đối với các phương pháp khác như DNeasy Plant Mini Kit và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit, nồng độ DNA thu hồi chỉ đạt trung bình 13,7 ng/μL và 10,6 ng/μL, thấp hơn hơn 20 lần so với quy trình tách sử dụng CTAB và CTAB cải tiến.

Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

Kết quả đo OD 260/280 trong khoảng từ 1,8-2,0 cho thấy DNA thu được có độ tinh sạch cao, trong khi giá trị dưới 1,8 chỉ ra sự tồn tại của protein, tức là độ tinh sạch thấp Nồng độ DNA và chỉ số OD260/280 trong nghiên cứu cho thấy DNA đảm bảo độ tinh sạch qua cả 4 phương pháp tách chiết Thông tin chi tiết về nồng độ và chỉ số OD260/280 được trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2 Chỉ số OD 260/280 của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

K ế t qu ả t ối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạ n gen GBSSI b ằ ng k ỹ thu ậ t PCR27 1 Tối ưu quy trình PCR

3.2.1 Tối ưu quy trình PCR

K ế t qu ả t ối ưu nhiệt độ g ắ n m ồ i

Nhiệt độ gắn mồi là yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR để đạt hiệu suất cao Do đó, dựa trên khuyến cáo của nhà sản xuất, chúng tôi đã tiến hành tối ưu nhiệt độ trong dải nhiệt với 8 mức khác nhau: 48,2; 50,3; 52,0.

Nghiên cứu về nhiệt độ gắn mồi cho gen GBSSI cho thấy rằng tại các nhiệt độ từ 48,2 o C đến 59,2 o C, sản phẩm điện di đều tạo ra băng sáng kích thước khoảng 700 bp Đặc biệt, trong khoảng nhiệt độ từ 48,2 o C đến 50,3 o C xuất hiện một băng không đặc hiệu mờ Các nhiệt độ từ 52 o C đến 57,5 o C cho kết quả băng sản phẩm điện di sáng và đặc hiệu, phù hợp với kích thước lý thuyết (~700 bp) Do đó, khoảng nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại gen GBSSI được xác định là từ 52 o C đến 57,5 o C.

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kí hiệu trên các làn: nhiệt độ gắn mồi ( 0 C); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương

K ế t qu ả t ối ưu nồng độ DNA

Nồng độ DNA tối ưu được xác định với các giá trị 6,25; 12,5; 25; 50; 100; và 200 ng/µL Hình 3.3 minh họa kết quả điện di của sản phẩm DNA tại các nồng độ này, cho thấy các băng đều sáng và đặc hiệu từ nồng độ 6,25 đến 200 ng/µL, với hai băng nổi bật ở nồng độ cao hơn.

Nồng độ DNA khuụn tối ưu cho phản ứng PCR được xác định là 25 ng/àL, dựa trên kết quả từ các băng đặc hiệu và sỏng nhất với nồng độ 25 ng/àL và 50 ng/àL.

Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kớ hiệu trờn cỏc làn: nồng độ DNA (ng/àL); (-): Đối chứng õm; (+): Đối chứng dương

K ế t qu ả t ối ưu n ồng độ m ồ i:

Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn 100 bp; Kí hiệu trờn cỏc làn: nồng độ mồi (àM) tương ứng với 3 mẫu; (-): Đối chứng õm

Nồng độ tối ưu của mồi gen GBSSI được xác định là 0,1; 0,3 và 0,9 àM Hình 3.4 trình bày kết quả điện di sản phẩm từ các nồng độ mồi khác nhau, cho thấy nồng độ 0,3 àM tạo ra các băng sỏng, đặc hiệu và ổn định nhất Do đó, nồng độ hoạt động tối ưu được chọn cho mồi là 0,3 àM.

3.2.2 So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình

Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu quy trình chúng tôi tiến hành chạy phản ứng PCR với các thành phần và điều kiện chi tiết trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ hoạt động

(25 àL) Điều kiện (chu trình nhiệt)

Nước khử ion 14,75 *Biến tính đầu: 98 o C – 30 giây

*Giữ sản phẩm ở 4 o C Đệm 5x 1x 5,0 dNTPs 2 mM 0,2 mM 2,5

Hình 3.5 Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% sử dụng DNA tổng số từ quy trình khác nhau Làn M: O Gene Ruler Ladder DNA

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Marker Làn (-) indicates negative control, while marker Làn H represents PCR products from corresponding samples.

Chúng tôi đã tiến hành PCR gen GBSSI trên 10 mẫu DNA, sử dụng DNA khuôn được chiết xuất từ 4 quy trình tách chiết khác nhau Trong số đó, quy trình Mini

Quy trình CTAB cho 3/10 mẫu lên băng là H3, H4, H21, trong khi CTAB cải tiến cho hiệu quả nhân dòng gen cao hơn với 5/10 mẫu gồm H2, H3, H4, H6, HH PCR từ DNA thu được từ hai bộ kit GeneJET Mini Kit và DNeasy Plant Mini Kit có 9/10 mẫu lên với băng sáng rõ Điều này cho thấy hiệu quả nhân dòng gen thông qua PCR từ các mẫu DNA thu được từ kit cao hơn so với mẫu DNA từ quy trình Mini-CTAB và CTAB cải tiến.

Độ tương đồ ng c ủ a trình t ự gen GBSSI đượ c khu ếch đạ i

Trình tự vùng gen GBSSI của 9/10 mẫu nghiên cứu đã được xác nhận với chiều dài khoảng 618 bp Để phân tích đa hình di truyền của gen GBSSI, chúng tôi đã so sánh 9 mẫu nghiên cứu với 15 trình tự của các loài khác trong cùng chi.

Hedera cùng với 2 loài khác thuộc chi Merrilliopanax đã công bố trên Genbank với chiều dài khoảng 560 bp Bảng 3.4

Bảng 3.4 Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên loài/thứ Mã số

Phân loại H.nepalensis và H.sinensis hiện vẫn còn nhiều vấn đề tranh cãi

H.helix và H.nepalensis khác biệt di truyền như thế nào cũng là một câu hỏi cần lời giải Chính vì vậy, chúng tôi tiên hành so sánh 9 trình tự của các mẫu trong nghiên cứu này với các trình tự đã được công bố trên genbank của H.nepalensis, H.sinensis, H.helix Kết quả đối chiếu trình tự nucleotit vùng gen nghiên cứu thể

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU hiện ở Hình 3.6 Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự

Kết quả phân tích GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu H.nepalensis, H.sinensis và H.helix cho thấy sự tương đồng lên đến 99.7%, chỉ khác nhau ở 8/618 nucleotit Các mẫu được phân chia thành 3 nhóm: Nhóm I gồm H1, H2, H4, H5, H6 hoàn toàn giống nhau; Nhóm II gồm H3 và HH có 3 nucleotit khác biệt với Nhóm I tại các vị trí 13, 421 và 603; Nhóm III bao gồm H16, H21 với 1 vị trí nucleotit khác so với Nhóm I tại vị trí 243 và 263.

Hình 3.6 So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và sốlượng nucleotit sai khác (phía trên bên phải) giữa trình tự GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với

9 mẫu thu thập ở Việt Nam có trình tự tương đồng với so với H.nepalensis

Trình tự nucleotit của H.helix và H.sinensis có sự khác biệt đáng kể so với các mẫu H1, H2, H4, H5, H6, với mức sai khác thấp nhất là 2/565 nucleotit và cao nhất là 5/565 nucleotit ở các mẫu H3, HH Cụ thể, sự khác biệt giữa 9 mẫu nghiên cứu và mẫu H1 là 268/618, trong khi so với H.nepalensis là 268/565 nucleotit.

Kết quả phân tích khoảng cách di truyền cho thấy rằng khoảng cách di truyền giữa các mẫu H nepalensis tại Việt Nam cho gen GBSSI không cao Sự khác biệt di truyền lớn nhất được ghi nhận giữa các mẫu H helix và H sinensis, với giá trị khoảng cách di truyền là 1,91 Ngoài ra, hầu như không có sự khác biệt di truyền giữa các mẫu H1, H2, H4, H5, H6, H16, H21 và H nepalensis.

Chín mẫu bao gồm các loại H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21, HH đã được nhân dòng và giải trình tự gen GBSSI thành công Phân tích gen cho thấy có 8 nucleotide khác nhau giữa các mẫu trong đoạn gen dài 618 bp.

Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI

Trước khi xây dựng cây phát sinh chủng loại cho GBSSI, mô hình tiến hóa được tính toán bằng phần mềm Mega X Mô hình tối ưu được xác định là Tamura 3 tham số (T92) với phân phối Gamma, cho kết quả BIC = 7042,115; AICc = 6657,293; -lnL = 3277,457; R = 1.45, và phân tích bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu Mức độ tin cậy được phân loại: cao (>85%), trung bình (65-85%), và thấp (

Tiêu đề	Lựa Chọn Quy Trình Tách Chiết DNA Tổng Số Và Bước Đầu Phân Tích Đa Dạng Di Truyền Nguồn Gen Dây Thường Xuân (Hedera Nepalensis K.Koch) Ở Việt Nam Dựa Trên Chỉ Thị GBSSI
Tác giả	Nguyễn Thị Thu Thảo
Người hướng dẫn	PGS.TS. Đinh Đoàn Long, ThS. Phạm Thị Hồng Nhung
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	54
Dung lượng	1,03 MB