Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở việt nam dựa trên chỉ thị ITS

T Ổ NG QUAN

Đa dạ ng và phân lo ạ i sinh h ọ c

1.1.1 Khái niệm đa dạng sinh học

Theo Công ước đa dạng sinh học năm 1992, đa dạng sinh học là sự phong phú của mọi cơ thể sống từ tất cả các nguồn trong các hệ sinh thái, bao gồm đa dạng di truyền, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái Đa dạng sinh học có tầm quan trọng lớn đối với thiên nhiên và con người, mang lại giá trị sinh thái và môi trường, bảo vệ tài nguyên đất và nước, điều hòa khí hậu, đồng thời có giá trị kinh tế lớn nếu được khai thác và sử dụng đúng cách.

1.1.2 Đa dạng di truyền Đa dạng di truyền hay còn gọi là đa dạng nguồn gen là một phần của đa dạng sinh học Đa dạng di truyền thể hiện sự phong phú của những biến dị trong cấu trúc di truyền của các cá thể bên trong loài hoặc giữa các loài; bên trong hoặc giữa những quần thể Đa dạng di truyền xuất phát từ những đột biến nhỏnhư thêm, mất, thay thế hoặc đảo vị trí nucleotide trong chuỗi DNA, hoặc từcác đột biến ở cấp độ cao hơn như các đột biến về sốlượng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể Đa dạng di truyền là sựđa dạng ở cấp độ phân tử, là nền tảng cho sựđa dạng của sinh giới [4] Đây là mức độ nhỏ nhất để cấu thành nên các tổ chức lớn hơn như tế bào hoặc cơ quan Nghiên cứu đa dạng di truyền chính là nghiên cứu sự biến đổi của sinh vật hay quần thể sinh vật ở cấp độ di truyền (gen, DNA) Ngày nay, nghiên cứu đa dạng sinh học nói chung, đa dạng di truyền nói riêng đang ngày càng được phát triển, góp phần giúp định danh chính xác hệ thống sinh vật khổng lồ Ngoài ra, đây còn là cơ sở cho bảo tồn phát triển nguồn gen, lai chọn tạo giống mới, nghiên cứu tiến hóa…

1.1.3 Thực trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam

Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới gió mùa và chiều dài gần 3260 km, sở hữu địa hình đồi núi đa dạng, tạo điều kiện cho sự phát triển phong phú của tài nguyên sinh vật Theo thống kê, Việt Nam là một trong 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh học cao nhất thế giới, đứng thứ 16 trong bảng xếp hạng về đa dạng sinh học toàn cầu.

(chiếm 6,5% số loài có trên thế giới) Chỉ kể đến thực vật, Việt Nam có khoảng

20000 loài trên cạn và dưới nước; gần 4000 loài thực vật có giá trị làm thuốc và có nhiều loài thuộc dược liệu quý hiếm

Suy thoái đa dạng sinh học đang gia tăng nghiêm trọng trên toàn cầu, bao gồm cả Việt Nam, với tốc độ tuyệt chủng các loài thực vật hiện nay cao hơn từ 100 đến 1000 lần so với mức tự nhiên Mỗi hai năm, chúng ta mất ít nhất một loại dược liệu, trong khi 90% các loài vẫn chưa được thống kê và nhiều loài trong số đó đã biến mất Nguyên nhân của sự suy thoái này bao gồm khai thác không bền vững, cháy rừng, chuyển đổi đất đai, ô nhiễm môi trường, chiến tranh và quản lý kém Nguy cơ tuyệt chủng đang gia tăng từng ngày, do đó, nghiên cứu bảo tồn và phân tích đa dạng sinh học là vô cùng cần thiết và có ý nghĩa khoa học, thực tiễn.

Nước ta sở hữu nguồn dược liệu phong phú, nhưng giá trị kinh tế từ nguồn tài nguyên này vẫn còn hạn chế do sản phẩm chưa được chuẩn hóa, dẫn đến sự không ổn định và giá trị thấp Việc phát triển thuốc từ dược liệu gặp khó khăn vì lo ngại về tác dụng và chất lượng Do đó, nghiên cứu đa dạng di truyền là cần thiết để xác định chính xác danh pháp khoa học của các loài, kết hợp với nghiên cứu dược lý nhằm bảo vệ và phát triển nguồn gen, từ đó tạo ra các sản phẩm chất lượng cao.

1.1.4 Các phương pháp phân loại học

Phân loại học có vai trò và ý nghĩa đối với nhiều ngành, nhiều lĩnh vực [13]

Có nhiều cách phân chia vềcác phương pháp phân loại học, phần dưới đây sẽ trình bày một sốphương pháp phân loại chính được sử dụng hiện nay

1.1.4.1 Phương pháp phân loại học truyền thống

Trong phân loại học truyền thống, có hai phương pháp chính được sử dụng là phân loại dựa trên chỉ thị cảm quan, bao gồm hình thái, màu sắc và mùi vị, cùng với phân loại dựa trên chỉ thị hóa học, như sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

Phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái, hay còn gọi là phương pháp hình thái học, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu phân loại học Phương pháp này được áp dụng rộng rãi, cho phép so sánh các đặc điểm hình thái của các cơ quan trong cơ thể sinh vật, đặc biệt là các cơ quan sinh dưỡng và sinh sản Nhờ vào việc làm nổi bật các đặc điểm giống và khác nhau, phương pháp này cũng thể hiện tính ổn định của các đặc điểm hình thái.

Phương pháp phân loại sinh vật cho phép sắp xếp chúng vào các nấc thang khác nhau và xác định mối quan hệ thân cận, nhưng gặp khó khăn trong việc phân biệt các loài đồng hình Việc nhầm lẫn giữa các sinh vật, có thể do lợi ích kinh tế hoặc sai sót trong thu hái, có thể dẫn đến hậu quả nghiêm trọng, đặc biệt là với những cây có chất độc Mặc dù vậy, không thể phủ nhận vai trò quan trọng của các phương pháp phân loại truyền thống trong lĩnh vực phân loại học.

1.1.4.2 Phương pháp phân loại học hiện đại

Phân loại học phân tử

Sự phát triển của sinh học phân tử và tin sinh học từ thập kỷ 80 đã mang lại những tiến bộ quan trọng trong phân loại học, đặc biệt là qua các kỹ thuật chỉ thị sinh học phân tử Phân loại học phân tử xác định các loài dựa trên sự khác biệt về trình tự DNA, protein hoặc isozyme Hiện nay, phần lớn chỉ thị phân tử được sử dụng là chỉ thị DNA, có liên kết gần với gen và ít ảnh hưởng đến kiểu hình, giúp phân biệt nhanh chóng và chính xác giữa các cơ thể hoặc loài khác nhau Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong việc giải quyết các vấn đề về loài đồng hình và nghiên cứu biến dị, khắc phục một phần nhược điểm của phương pháp phân loại truyền thống.

Phân loại học hiện trạng số (numerical taxonomy) là phương pháp sử dụng trên 60 dấu hiệu giống nhau của sinh vật mà không xem xét nguồn gốc của các dấu hiệu Phương pháp này xác định quan hệ phân loại dựa vào mức độ giống nhau của các đối tượng bằng cách áp dụng các thuật toán, giúp loại bỏ tính chủ quan và đảm bảo tính tự nhiên trong hệ thống phân loại Tuy nhiên, nhược điểm lớn của phương pháp này là không tính đến yếu tố tiến hóa và không thể thay thế hoàn toàn phương pháp phân loại truyền thống.

Phân loại học Phylocod xác định các đặc điểm tổ tiên và sự phân ly từ tổ tiên, hình thành các bậc tiến hóa đơn dòng như các loài Khác với phân loại truyền thống với nhiều thứ bậc như loài, giống, họ, bộ, Phylocod chỉ là hệ thống danh pháp Phương pháp này có thể làm tăng số lượng loài, nhưng cũng đặt ra những hạn chế về mẫu chuẩn của loài Do đó, hệ thống danh pháp này chỉ mang tính tham khảo.

Cận phân loại học (Parataxonomy) là phương pháp so sánh tổng quát mức độ phong phú của sinh vật trong một khu vực mà không phân chia thành các loài cụ thể Phương pháp này cho phép phân loại dựa trên quan sát trực quan, phù hợp với cả những người không chuyên về phân loại học Do đó, nhiều nhà khoa học coi cận phân loại học là một kỹ thuật hỗ trợ trong nghiên cứu phân loại học.

Công c ụ phân tích đa dạ ng di truy ề n và ti ế n hóa

1.2.1 Tổng quan về chỉ thị DNA

Nhiệm vụ chính của các chuyên gia trong lĩnh vực hệ thống thực vật, sinh thái học, sinh học tiến hóa, bảo tồn và pháp y ứng dụng là xác định chính xác mẫu động thực vật một cách nhanh chóng, có thể lặp lại và đảm bảo độ tin cậy cao.

Chỉ thị DNA, thông qua các đoạn trình tự gen đặc hiệu, là công cụ hữu ích trong việc xác định và nhận dạng loài Sự gia tăng nghiên cứu sử dụng mã vạch cho thấy tính hiệu quả của phương pháp này Kết hợp di truyền phân tử, công nghệ giải trình tự và tin sinh học, chỉ thị DNA mang lại phương tiện nhanh chóng và chính xác để nhận diện các loài đã biết và khám phá hàng ngàn loài động thực vật chưa được đặt tên, đặc biệt trong quần xã sinh vật nhiệt đới Là công cụ cách mạng trong việc khám phá đa dạng sinh học, chỉ thị DNA đã hỗ trợ tìm kiếm các loài mới tiềm năng cho khoa học và phân tích dữ liệu di truyền, đặc biệt với các loài có nguy cơ tuyệt chủng.

Dựa trên chỉ thị DNA, mã vạch DNA được phát triển để xác định các đơn vị phân loại như loài Mã vạch DNA là công cụ quan trọng trong phân loại học ứng dụng, giúp xác định các loài quy định, loài xâm lấn và loài có nguy cơ tuyệt chủng Ngoài ra, nó còn được sử dụng để kiểm tra danh tính và độ tinh khiết của sản phẩm thực vật, như thuốc thảo dược và thực phẩm chức năng Hiện nay, mã vạch DNA góp phần giải quyết các vấn đề sinh thái, tiến hóa và bảo tồn Quá trình tạo và áp dụng mã vạch DNA cho nhận dạng bao gồm hai bước: xây dựng thư viện mã vạch DNA của các loài đã biết và khớp chuỗi mã vạch DNA của mẫu chưa biết với thư viện Bước đầu tiên yêu cầu chọn cá thể mẫu tham chiếu cho mỗi loài từ các mẫu vật tươi hoặc khô không bị nhiễm nấm mốc.

Bảy thư viện mã vạch DNA hoàn tất sẽ được sử dụng để tách chiết DNA tổng số từ các mẫu chưa biết Mã vạch DNA của các mẫu vật này sẽ được so sánh với các mã vạch DNA đã biết thông qua việc áp dụng một số thuật toán phù hợp.

Chỉ thị DNA là công cụ quan trọng trong việc phân loại các loài, với đoạn gen có thể tìm thấy ở tất cả sinh vật, cho phép so sánh trình tự nucleotide giữa các cá thể trong cùng một loài Khu vực này được sử dụng để nhận diện các loài thông qua việc đối chiếu với dữ liệu từ các cơ sở dữ liệu Các chỉ thị DNA ở thực vật thường bao gồm trình tự DNA trong lạp thể và DNA trong nhân Mặc dù phương pháp này hiệu quả trong việc xác định loài, nhưng vẫn tồn tại những hạn chế, như việc không đủ dữ liệu để mô tả các loài mới, có thể dẫn đến xáo trộn trong hệ thống phân loại truyền thống đã tồn tại hàng trăm năm.

1.2.2 Các kỹ thuật chỉ chị DNA

Các kỹ thuật chỉ thị DNA đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử Chúng được ứng dụng trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen, và chọn giống thông qua đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng giống, cũng như chọn lọc các tính trạng kháng bệnh và khả năng chịu đựng điều kiện môi trường Mỗi kỹ thuật sẽ được áp dụng tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu, hoặc kết hợp nhiều phương pháp để đạt hiệu quả tối ưu Các kỹ thuật không sử dụng PCR như RFLP và REF, trong khi các kỹ thuật sử dụng PCR bao gồm RAPD, AP-PCR và Amplified Sequence Length Polymorphism.

Polymorphism techniques, including Selective Amplification of Polymorphic Loci (SAMPL), play a crucial role in genetic analysis Among these, Inter-Simple Sequence Repeats (ISSR) and Inverse Sequence-Tagged Repeats (ISTR) are key marker-based methods that utilize simple repeat sequences Additionally, PCR techniques that focus on specific sequence-tagged sites enhance the precision of genetic studies.

- STS); đa hình độ dài chuỗi đơn giản (Single Sequence Length Polymorphism -

The article discusses various genetic marker techniques, including Simple Sequence Repeats (SSR) and retrotransposon-based methods such as Inter-Retrotrasposon Amplified Polymorphism (IRAP) and Retrotransposon-Based Insertion Polymorphism (RBIP) Additionally, it mentions other genetic markers like Internal Transcribed Spacer (ITS) regions, highlighting their significance in genetic research and analysis.

Single Nucleotide Polymorphism (SNP) and chloroplast molecular markers, such as Chloroplast Simple Sequence Repeats (cpSSR) and Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of cpDNA (RFLPA cpDNA), are essential techniques used in genetic studies to analyze chloroplast DNA variations.

Công nghệ hỗ trợ hiện đại như công nghệ sắp xếp đa dạng (Diversity array Technology - DarT); giải trình tự thế hệ thứ hai (Next-geneation sequencing - NGS)

1.2.3 Vùng đệm trong được sao mã ( Internal Transcribed Spacer - ITS )

Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) nằm giữa gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ và lớn, là dấu hiệu phát sinh gen quan trọng cho việc phân loại nhiều loài ITS ở thực vật nhân thực bao gồm rRNA 5,8S được bảo tồn cùng với các khu vực biến đổi ITS1 và ITS2 Các vùng này có chiều dài thay đổi và có thể được khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các vùng được bảo tồn của các gen sườn.

Có nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc loại bỏ các khu vực được bảo tồn dẫn đến phân loại chính xác hơn [47]

Các vùng tổ chức nhân (NORs) nằm trong nhiễm sắc thể chứa DNA ribosome (rDNA) với cấu trúc lặp lại, có thể có tới 30.000 bản sao trong mỗi tế bào Vùng rDNA đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu phát sinh gen nhờ vào sự khác biệt trong mức độ bảo tồn của thành phần cấu trúc của nó.

RDNA chứa các exon và intron, trong đó các vùng intron không được sao mã và chức năng của chúng vẫn chưa được xác định Mỗi exon bao gồm các tiểu phần ribosome nhỏ (16S-18S), vùng ITS, và tiểu phần lớn (26S-28S) Hình 1.1b minh họa vùng ITS, bao gồm ba phần: ITS1, 5,8S và ITS2, nằm xen kẽ giữa các tiểu phần ribosome.

Vùng này được gọi chung là vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed

Hình 1.1 trình bày sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật, bao gồm vị trí nhiễm sắc thể của các vùng rDNA và cấu tạo của vùng Intron, Exon liền kề.

Hai vùng đệm ITS1 và ITS2 có độ dài tối đa 300 bp, trong khi tổng độ dài vùng ITS dao động từ 600 đến 700 bp Vùng gen này có mức độ tiến hóa nhanh, dẫn đến sự thay đổi dễ dàng về trình tự và độ dài Các vùng liền kề có trình tự bảo thủ, thuận lợi cho việc thiết kế mồi PCR nhằm nhân dòng vùng gen ITS Hơn nữa, do đoạn trình tự gen ngắn, việc khuếch đại không gặp nhiều khó khăn.

Phân tích vùng gen ITS là một kỹ thuật chỉ thị phân tử quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền Kỹ thuật này hỗ trợ phân loại các nhóm taxon có mối liên hệ gần gũi, từ đó nâng cao hiểu biết về sự đa dạng sinh học.

T ổ ng quan v ề Dây thườ ng xuân (Hedera nepalensis K Koch)

1.3.1 Phân loại học loài Hedera nepalensis K Koch

Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật như sau:

Phân lớp Hoa hồng Rosidae

Loài Hedera nepalenis K Koch thuộc chi Hedera, bao gồm 16 loài phân bố tại châu Âu, Bắc Phi, Macaronesia và châu Á Đây là chi duy nhất trong họ Nhân sâm (Araliaceae) có hình thái dây leo, với đặc điểm là cây leo thường xanh, có nhiều rễ móc khí sinh, nhẵn và không có gai Lá của chúng mọc so le, phiến lá đơn, dài từ 5 – 10 cm và rộng từ 3 - 8 cm, với gân chân vịt Cụm hoa chùy có nhiều tán, hoa nhỏ màu vàng trắng và lục trắng, lá bắc rất nhỏ, tràng hoa có 5 cánh và nhị 5 Quả hình hạch tròn, chín có màu đen H nepalnensis có dây bò dài tới 20 m, nhiều rễ khí sinh ở các mắt, lá đơn và cụm hoa có lông đỏ nâu, thường gặp ở độ cao 1000 – 3000 m.

Hình 1.3 Cây Dây thường xuân H nepalensis [61]

1.3.2 Đặc điểm hình thái và phân bố địa lý

Châu Á được xác định là trung tâm xuất xứ của chi Hedera, từ đó các loài trong chi này đã lan rộng đến Châu Âu và vùng Địa Trung Hải Hiện nay, Hedera chủ yếu phân bố ở các vùng ôn đới và cận nhiệt đới như Châu Âu và một số khu vực ở Châu Á, nơi có nhiệt độ trung bình từ 26 – 30 độ C và độ ẩm cao Hai loài được nghiên cứu và sử dụng nhiều trong dược học là Thường xuân (H helix) và Dây thường xuân (H nepalensis), cả hai đều có phạm vi phân bố hạn chế Tại Việt Nam, Viện Dược liệu cho biết Dây thường xuân có trữ lượng lớn, chủ yếu tập trung ở các tỉnh miền Bắc như Sơn La, Lào Cai và Hòa.

Bình, Lai Châu, Hà Giang… (Hình 1.3)

Hình 1.4 Phân bốđịa lý của H nepalensis tại miền Bắc nước ta

1.3.3.1 Nghiên cứu dược lý trên thế giới

Tác dụng chống ung thư

Năm 2015, Laila và cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu trong ống nghiệm nhằm phân tích tác dụng ức chế và gây độc đối với các dòng tế bào ung thư của các phân đoạn dịch chiết từ H nepalensis Nghiên cứu sử dụng năm mẫu thử, bao gồm chiết xuất thô (HNC), phân đoạn n-hexane (HNN), phân đoạn ethyl acetate (HNE), phần dịch chiết còn lại (HNA) và Lupeol, và các phân đoạn này đã được thực hiện các xét nghiệm tương ứng để đánh giá hiệu quả.

Nitrate, xét nghiệm NFκB, xét nghiệm aromatase và xét nghiệm quinone reductase

Nghiên cứu tiềm năng gây độc tế bào của H nepalensis được thực hiện trên ba dòng tế bào ung thư MCF-7, MDA-MB-231 và Hela thông qua xét nghiệm sulforhodamine B (SKB) Kết quả cho thấy cả chiết xuất thô và các phần phân đoạn của H nepalensis đều có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư này hơn 60% Đặc biệt, chất lupeol được chiết xuất từ n-hexane và ethyl acetate có giá trị IC50 dao động từ 2,32 đến 10,2 μM, đồng thời ức chế 84,78% sản xuất oxit nitric với giá trị IC50.

Lượng lupeol trong H nepalensis được xác định là 2,1 ± 1,3 μM, với lá của cây này chứa hàm lượng lupeol phong phú nhất, đạt 0,196 mg/100 mg trọng lượng khô Nghiên cứu này là báo cáo đầu tiên chỉ ra tiềm năng của H nepalensis như một nguồn cung cấp các tác nhân hóa trị ung thư và gây độc tế bào.

Nghiên cứu của T Li và cộng sự (2015) đã chỉ ra rằng saponin từ H nepalensis K Koch có khả năng chống ung thư bằng cách kích thích quá trình chết theo chu trình của tế bào ung thư trong ống nghiệm Cụ thể, chiết xuất ethanol 95% từ H nepalensis K Koch có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ A549.

Nghiên cứu cho thấy pulsatilla saponin A và hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside, chiết xuất từ H nepalensis K Koch, có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào A549 với nồng độ 28,39 ± 4,36 μg/ml Pulsatilla saponin A đã được xác nhận trước đây là có khả năng gây ra sự chết theo chu trình cho tế bào A549 Tuy nhiên, hoạt động ức chế tăng trưởng và khả năng gây apoptosis của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside vẫn chưa được công bố Những phát hiện này mở ra triển vọng cho các phương pháp điều trị mới nhằm chống lại ung thư phổi không phải tế bào nhỏ.

Nghiên cứu của Qamar và cộng sự (2019) đã tiến hành thí nghiệm sàng lọc 10 cây thuốc ít được khám phá, bao gồm H nepalensis Kết quả cho thấy các cây thuốc này có hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ với giá trị gây độc tế bào tối thiểu (IC50 > 3 μM) và độc tính thấp hoặc không đáng kể Đánh giá về gây độc tế bào phụ thuộc vào liều được thực hiện thông qua xét nghiệm MTT trong ống nghiệm và mô hình.

Các nghiên cứu cho thấy 16 khối u trên động vật có IC50 trong khoảng 0,009 - 0,528 mg/mL, cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của khối u của các cây này Chúng hoạt động bằng cách nhắm vào các mục tiêu phân tử như chống tăng sinh, prooptotic, chống di căn và chống angiogen Với tính có sẵn, giá cả phải chăng và tác dụng phụ tối thiểu, các loại cây này được sử dụng rộng rãi trong điều trị.

Tác dụng chống oxi hóa

Nghiên cứu của Laila Jafri và cộng sự (2014) nhằm xác định các hợp chất polyphenolic có tác dụng chống oxy hóa trong các phân đoạn của H nepalensis Các mẫu nghiên cứu bao gồm chiết xuất thô và các phần phân đoạn thu được từ các dung môi n-hexane, ethyl acetate và nước.

Khả năng chống oxy hóa của H nepalensis được xác định thông qua việc đo lường khả năng loại bỏ hydro peroxide (H2O2) Các phân đoạn dịch chiết đều cho thấy tiềm năng loại bỏ H2O2 đáng kể (P < 0,05), với giá trị IC50 dao động từ 31,19 trở lên.

Nghiên cứu cho thấy phần ethyl acetate của H nepalensis có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, theo phương pháp phosphomolybdenum, tiếp theo là n-hexane, chiết xuất thô và phần nước Điều này chứng minh rằng ethyl acetate chứa hàm lượng phenolic và flavonoid cao, cho thấy tiềm năng chống oxy hóa đáng kể.

Một nghiên cứu đã xác định tiềm năng chống oxy hóa của dịch chiết methanol từ H nepalensis trong môi trường nước và lipid Các xét nghiệm DPPH và ABTS được sử dụng để đánh giá khả năng dọn gốc tự do trong môi trường nước, trong khi chỉ số ôi hóa TBARS được áp dụng cho môi trường lipid Kết quả cho thấy hàm lượng các gốc DPPH, ABTS và TBARS lần lượt là 26,7 ± 0,2 (mM TE/g), 54,7 ± 1,6 (mmol TE/g) và 393 ± 3,4 (mmol TE/g) Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng trong dịch chiết thô của H nepalensis có chứa hai chất chống oxy hóa là axit chlorogen và rutin.

Tác dụng chống tiểu đường

Nghiên cứu của Samreen Saleem và cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng hai loài Fagonia cretica và H nepalensis có khả năng ức chế enzyme DPP-4, mang lại hiệu quả trong điều trị tiểu đường Các mẫu thử trong nghiên cứu bao gồm chiết xuất thô của H nepalensis cùng với các phân đoạn khác nhau.

Trong nghiên cứu về các dung môi như hexane, ethyl acetate và nước, phát hiện rằng chúng đều có khả năng ức chế hoạt động của enzyme DPP-4, enzyme này có vai trò làm bất hoạt hai hormone incretin là GLP-1 và GIP Đặc biệt, triterpenoid lupeol được chiết xuất từ H nepalensis cho thấy giá trị IC50 đáng chú ý trong việc ức chế DPP-4.

VẬ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

V ậ t li ệ u nghiên c ứ u

45 mẫu lá thường xuân, trong đó 44 mẫu được thu thập từ các tỉnh khắp Việt

Nam; 01 mẫu được thu thập từ vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc do Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu (Bộ Y tế) cung cấp (Bảng 2.1)

Các mẫu lá sau khi được sấy khô và bảo quản trong túi nilon chứa silicagel ở nhiệt độ phòng sẽ được nghiền mịn trong nitơ lỏng Sau đó, chúng được chia đều vào các ống eppendorf 1,5 mL và bảo quản ở -30 ºC cho đến khi tiến hành tách chiết DNA tổng số.

Bảng 2.1 Thông tin các mẫu thực vật được nghiên cứu

STT Ký hi ệ u m ẫ u Địa điể m l ấ y m ẫ u (huy ệ n, t ỉ nh)

4 H4* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E

10 HH** Vườ n TV Hoa Nam, TQ 23°11'12"N - 113°21'51"E

22 H27* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'18.38"N - 104°35'45.13"E

23 H28* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'43.50"N - 104°36'11.35"E

26 H31* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'11.06"N - 104°36'11.85"E

27 H32* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E

28 H33* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'08.44"N - 104°36'17.29"E

29 H34* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'00.73"N - 104°36'19.57"E

32 H38* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E

34 H41* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E

35 H42* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E

36 H43* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'04.61"N - 104°35'59.54"E

37 H44* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'04.61"N - 104°35'59.54"E

45 H52** Đà Lạt, Lâm Đồ ng 11°56'11.56"N - 108°27'28.12"E

Ghi chú phân lo ạ i hình thái: * - H nepalensis; ** - H helix

2.1.2 Hóa chấtchính sử dụng trong nghiên cứu

Tách DNA tổng số: Bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini (Thermo Scientific, Mỹ)

Để nhân dòng đoạn gen đích ITS, cặp mồi 17SE (5’ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC3’) và 28SE (5’TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C3’) đã được tổng hợp bởi công ty Phusa Biochem (Việt Nam) Các vật liệu sử dụng bao gồm 5X Buffer, dNTP mix (Thermo Scientific), Phusion DNA Polymerase (Thermo Scientific) và nước khử ion Quá trình điện di được thực hiện bằng Gel Agarose, sử dụng 5X DNA loading dye (Lonza), GeneRuler 100bp DNA Ladder (Thermo Scientific) và Lambda DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific).

Phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội được trang bị nhiều thiết bị và dụng cụ thí nghiệm hiện đại Các thiết bị bao gồm: cân phân tích, máy quang phổ NP80 (Nanophotometer, Đức), máy chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), bể ổn nhiệt, máy lắc VELP (Scientifica, Đức) và tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản).

Tủ lạnh âm sâu -30 o C (Panasonic, Nhật Bản), Tủ mát 4 o C (FRIMED, Nhật Bản)

Máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức).

Phương pháp nghiên cứ u

Quy trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ lá khô đã nghiền trong nitơ lỏng bằng bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) Bộ kit này sử dụng công nghệ màng silica dạng cột quay, giúp quá trình tách chiết nhanh chóng, không độc hại và hiệu quả cho DNA có kích thước lên đến 30 kb Quy trình tách chiết được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Kiểm tra và định lượng DNA

DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% với hiệu điện thế 100 V, 500 mA trong 40 phút trong đệm TAE 1X Tỉ lệ mẫu sử dụng là 4 µL DNA và 1 µL DYE 5X Để định lượng nồng độ DNA và độ tinh sạch, chỉ số OD260/280 được đo trên máy quang phổ NP80, với OD260 phản ánh tỷ lệ hấp thụ quang của DNA ở bước sóng 260 nm so với 280 nm Mỗi mẫu DNA được đo hai lần và lấy giá trị trung bình Nồng độ DNA cao và giá trị OD260/280 trong khoảng 1,8 – 2,0 cho thấy DNA tách chiết có độ tinh sạch cao.

2.2.2 Nhân dòng đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR Để tìm ra quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định cho các mẫu trong quá trình PCR, chúng tôi tiến hành 3 loại phản ứng tối ưu: Tối ưu nhiệt độ, tối ưu nồng độ DNA và tối ưu nồng độ mồi Các phản ứng đều có đối chứng âm là các ống phản ứng không bổ sung DNA khuôn để loại bỏ khảnăng bị nhiễm mẫu trong quá trình thao tác Đối chứng dương là mẫu DNA Dây thường xuân đã khuếch đại thành công đoạn gen GBSSI (mẫu H3) Chúng tôi sử dụng enzyme Phusion Hight-Fidelity DNA Polymerase có hiệu suất cao hơn Taq thông thường đến 52 lần, giảm thiểu thời gian của phản ứng PCR Enzyme này cho hiệu suất cao ngay cả với những phản ứng có chứa DNA có nhiều sản phẩm thứ cấp như DNA tổng số có nguồn gốc thực vật

Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 μL, bao gồm 5x buffer, dNTP 2M, Phusion DNA polymerase, mồi 17SE/28SE, nước khử ion và DNA khuôn Phản ứng nhân dòng gen ITS được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700).

Kiểm tra sản phẩm PCR: Điện di trên Gel agarose 1,5% trong điều kiện 100

Chúng tôi đã thực hiện điện di với dòng điện 500 mA trong 45 phút trên đệm TAE 1x, sử dụng thang chuẩn GeneRuler 100 bp DNA Ladder để xác định kích thước DNA Ảnh điện di được ghi lại bằng máy soi Gel Doc từ Mỹ.

Chúng tôi đã đóng gói sản phẩm PCR trong ống Eppendorf 1,5 mL với thể tích khoảng 20 μL và gửi đến hãng First Base (Malaysia) để tinh sạch và giải trình tự theo chiều mồi xuôi 17SE Kết quả giải trình tự được hiển thị qua phần mềm BioEdit ver 7.2.6.1 hoặc Chromas pro 2.1.6, cho phép xác định kiểu gen của mẫu nghiên cứu Cách đọc kết quả dựa trên 04 nucleotide.

23 được thể hiện bằng 04 màu khác nhau (G: màu đen, T: màu đỏ, C: màu xanh dương, A: màu xanh lá cây)

Hình 2.2 Hiển thị kết quả giải trình tự qua phần mềm BioEdit

2.3.4 Xử lý số liệu và phân tích kết quả

Sau khi thu thập trình tự gen ITS từ các mẫu, chúng tôi đã sử dụng phần mềm Sequencher ver 5.4.6 để chỉnh sửa và lắp ghép các đoạn trình tự, loại bỏ những phần bị nhiễu, thường là ở đầu và cuối Các trình tự đã chỉnh sửa sau đó sẽ được so sánh với các mẫu có sẵn trong ngân hàng dữ liệu.

Chúng tôi sử dụng Genbank qua https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để đánh giá sự tương đồng giữa các mẫu thu được và các trình tự có sẵn Bằng cách áp dụng nhiều phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại như UPGMA, Maximum Likelihood, và Neighbor-Joining thông qua phần mềm MEGA phiên bản X với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại, chúng tôi đã xác định được nguồn gen Dây thường xuân dựa trên các phân nhánh tương ứng với các trình tự tham chiếu đã chọn.

KẾ T QU Ả NGHIÊN C Ứ U

Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của 45 mẫu được tách chiết theo Kit Thermo và điện di trên gel agarose 1,2% Kết quả cho thấy tất cả các mẫu đều có một băng DNA tổng số với kích thước khoảng 23,1 kb của marker, cho thấy DNA thu được có nồng độ cao, ít đứt gãy và đủ điều kiện cho các thí nghiệm tiếp theo Hình 3.1 minh họa băng điện di DNA tổng số của một số mẫu thực vật.

Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số của một số mẫu trên gel agarose 1,2 % Làn M:

Marker Lamda DNA/HindIII được sử dụng để xác định mẫu DNA tổng số từ các mẫu thực vật, với các mẫu từ 01 đến 19 tương ứng Đối chứng âm được thể hiện bằng ký hiệu (-) Kết quả định lượng và đo độ tinh sạch của DNA tổng số từ các mẫu lá khô cho thấy hiệu quả rõ rệt.

Nồng độ DNA trung bình đạt 12,23 ng/μL ± 4,28; chỉ số hấp thụquang đo ở bước sóng 260 và 280 nm có giá trị trung bình 2,00 ± 0,80 Số liệu chi tiết thống kê ở

Bảng 3.1 Nồng độ và OD260/280 DNA tổng số của của các mẫu nghiên cứu

STT Ký hi ệ u m ẫ u N ồng độ trung bỡnh (ng/àL) OD 260/280 trung bỡnh

Kết quả nhân dòng đoạn gen ITS bằng phản ứng PCR

3.2.1 Kết quả các phản ứng tối ưu

Chúng tôi tiến hành tối ưu các thành phần của phản ứng nhân dòng đoạn gen

ITS như nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA, nồng độ mồi, để đảm bảo có được một quy trình nhân dòng gen đặc hiệu và ổn định

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Phản ứng tối ưu nhiệt độ gắn mồi là yếu tố then chốt ảnh hưởng đến hiệu suất của PCR Chúng tôi đã thực hiện PCR với 9 nhiệt độ khác nhau xung quanh nhiệt độ gắn mồi tham khảo cho gen ITS Kết quả được phân tích qua điện di trên gel agarose.

Nghiên cứu cho thấy rằng ở dải nhiệt độ từ 43,9 – 62,1 ºC, các băng điện di đặc hiệu xuất hiện với độ sáng tăng dần, đặc biệt rõ nét trong khoảng 55,1 – 62,1 ºC Để đảm bảo phản ứng PCR không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ cao, nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen ITS được lựa chọn là 55,1ºC.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng nhân dòng gen ITS, với thang chuẩn Gene Ruler 100 bp được hiển thị ở làn M Các ký hiệu trên các làn thể hiện nhiệt độ gắn mồi (ºC), trong đó làn (-) là đối chứng âm và làn (+) là đối chứng dương Ngoài ra, việc tối ưu nồng độ DNA cũng được thực hiện để nâng cao hiệu quả của phản ứng.

Chúng tôi lựa chọn dải nồng độ DNA theo cấp sô nhân: 0,75; 1,25; 2,5; 5;

Sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1,5% cho thấy các băng đều rõ ràng và đặc hiệu ở dải nồng độ 10 và 20 ng/µL Tuy nhiên, nồng độ 5 ng/µL tạo ra băng rõ ràng và đồng nhất nhất Do đó, chúng tôi chọn 5 ng/µL là nồng độ tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen ITS.

Hình 3.3 cho thấy quá trình tối ưu nồng độ DNA trong phản ứng nhân dòng gen ITS Làn M là thang chuẩn Gene Ruler 100 bp, với các ký hiệu trên các làn thể hiện nồng độ DNA (ng/µL) Làn (-) là đối chứng âm, trong khi làn (+) là đối chứng dương.

Để nâng cao độ lặp lại của phản ứng PCR, chúng tôi đã tối ưu nồng độ mồi bằng cách thử nghiệm trên ba mẫu khác nhau với các nồng độ 0,1; 0,3; và 0,9 µM Sản phẩm phản ứng sau khi tối ưu được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%, cho thấy các băng đặc hiệu rõ nét và sáng.

03 lụ mẫu, chỳng tụi lựa chọn được tại nồng độ 0,3 àM phản ứng PCR cho hiệu suất cao nhất (Hình 3.4)

Hình 3.4 thể hiện quá trình tối ưu nồng độ mồi phản ứng nhân dòng gen ITS Các làn mẫu được đánh dấu với nồng độ mồi (µM) tương ứng, bao gồm ba lụ mẫu khác nhau Làn (-) là đối chứng âm, trong khi làn (+) là đối chứng dương, và thang chuẩn Gene Ruler 100 bp được sử dụng để xác định kích thước sản phẩm PCR.

Kết quả nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR nhân đoạn gen ITS là gắn mồi ở 55,1 ºC, nồng độ DNA 5 ng/µL và nồng độ mồi 0,3 µM Chi tiết về thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày trong Bảng 3.2 Quy trình này được áp dụng cho tất cả các phản ứng nhân dòng gen ITS của các mẫu thực vật trong nghiên cứu, bao gồm cả đối chứng âm (không chứa DNA khuôn) và đối chứng dương (mẫu H4).

Bảng 3.2.Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen ITS

Ho ạt độ ng Th ể tớch (àL) Chu trỡnh nhi ệ t

*Bi ến tính ban đầ u: 98 ºC trong 30 giây

- Bi ế n tính: 98 ºC trong 10 giây

- Kéo dài chu ỗ i: 72 ºC trong 30 giây

*T ổ ng h ợ p cu ố i: 72 ºC trong 10 phút

*Giữ sản phẩm ở 4 ºC dNTP 2 mM 0,2 mM 2,5

3.2.2 Kết quả nhân dòng gen ITS từ các mẫu thực vật

Chúng tôi đã thực hiện PCR với 45 mẫu DNA đã được tách chiết thành công Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1,5%.

Chúng tôi đã ghi nhận 45/45 mẫu nghiên cứu cho sản phẩm PCR đặc hiệu, với kích thước khoảng 900 bp so với Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp Sản phẩm này đáp ứng đủ điều kiện để gửi đi giải trình tự.

Kết quả PCR nhân dòng gen ITS của một số mẫu được trình bày trong Hình 3.5, với làn M là thang chuẩn Gene Ruler 100 bp Các ký hiệu trên các làn đại diện cho các mẫu phân tích, trong khi làn (-) là đối chứng âm và làn (+) là đối chứng dương.

Gi ả i trình t ự

Sản phẩm PCR sau khi giải trình tự bởi hãng First Base (Malaysia) được hiển thị thông qua phần mềm BioEdit ver 7.2.6.1 hoặc Sequencher ver 5.4.6 (Hình 3.6)

Chúng tôi đã giải trình tự 45 mẫu bằng mồi xuôi 17SE, cho thấy chiều dài đoạn gen ITS dao động từ 839 bp (H48) đến 858 bp (H4) trước khi xử lý đoạn nhiễu Kết quả này tương đối đồng đều giữa các mẫu và phù hợp với kết quả điện di.

Hình 3.6 Kết quả hiển thị giải trình tự của mẫu H1 qua phần mềm BioEdit

Độ tương đồng của trình tự gen ITS được khuếch đại

Các chuỗi trình tự được tinh chỉnh bằng cách loại bỏ nucleotide nhiễu thông qua phần mềm Sequencher ver 5.4.6 Chúng tôi sử dụng phần mềm BLAST với chế độ Nucleotide BLAST để so sánh các chuỗi mẫu với hàng ngàn trình tự trên Genbank Kết quả cho thấy các trình tự có độ tương đồng khác nhau, từ cao đến thấp, giúp xác định đoạn gen đã được nhân lên và chứa đầy đủ vùng gen ITS.

Mẫu H4 được so sánh với mẫu H.nepalensis đối chứng (AJ131238) từ ngân hàng Genbank và cho thấy độ tương đồng 100% Hình 3.7 minh họa sự sắp xếp đồng hàng các nucleotide giữa hai mẫu này.

Hình 3.7 Kết quả so sánh BLAST của mẫu H4 và H nepalensis (AJ131238)

“Query” là trình tự của H4, “Sbjct” là trình tự của H.nepalensis (AJ131238.1)

Sử dụng phần mềm BLAST, đã xác định được 11 haplotype (Bảng 3.3) thông qua việc so sánh các chuỗi Trong đó, 21/44 mẫu (47,7%) thuộc haplotype N1 giống hoàn toàn với mẫu H nepalensis (AJ131238.1) đối chứng, và 05/45 mẫu thuộc nhóm N3 cũng giống 100% với mẫu H helix (AM503887.2) đối chứng Các mẫu còn lại không có trình tự giống 100% trên Genbank nhưng có sự tương đồng hoàn toàn khi so sánh với nhau, được phân loại vào các haplotype khác.

Bảng 3.3 Các haplotype trong nghiên cứu

STT Haplotype Tên m ẫ u S ố lượ ng

Cây phát sinh ch ủ ng lo ạ i d ự a trên vùng gen ITS

Trước khi xây dựng cây phát sinh chủng loại, mô hình tiến hóa đặc trưng cho ITS đã được tính toán bằng phần mềm Mega X Mô hình tối ưu được xác định là T92+G với phân phối Gamma, cho kết quả BIC 637,829; AICc 24,941; -lnL 82,367; R = 1,76 Phân tích bootstrap được thực hiện với 1000 lần lấy lại mẫu, trong đó mức độ tin cậy được đánh giá theo giá trị bootstrap: mức độ tin cậy cao (>85%), mức độ tin cậy trung bình (65-85%) và mức độ tin cậy thấp (