Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở Việt

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được quy trình tách chiết DNA tổng số có hiệu quả từ mẫu lá khô của loài Dây Thường Xuân. Dựa vào giải trình tự gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI để bước đầu xác định được tính đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân thu nhập tại các tỉnh vùng núi phía Bắc Việt Nam nhằm phục vụ cho việc khai thác, quản lý bền vững nguồn cây dược liệu.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

9 mẫu thực vật đã được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái thuộc loài

Hedera nepalensis được thu thập tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc, với các mẫu được lấy bởi nhóm nghiên cứu từ Viện Dược liệu, chi tiết được trình bày trong Bảng 2.1.

Một mẫu thuộc loài Hedera helix được sử dụng trong nghiên cứu để đối chiếu, lấy từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu: mẫu lá non, sạch đã được sấy khô và bảo quản trong túi silicagel chống ẩm

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu

Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2018 đến 25 tháng 4 năm 2019 tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

TT Ký hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu Tọa độ địa lý

1 H1 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N-103°47'31.76"E

2 H2 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E

3 H3 Trạm cây thuốc Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E

4 H4 Hồ Thầu, Hoàng Su Phì,

5 H5 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

6 H6 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

7 H15 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E

8 H16 Phó Bảng, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E

9 H21 Sủng Là, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E

10 HH Vườn Thực vật Hoa Nam,

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

For total DNA extraction, recommended chemical kits include the Dneasy Plant Mini Kit from Qiagen (Germany) and the GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit from Thermo Scientific (USA) Additionally, DNA isolation can be performed using the CTAB method or an improved CTAB protocol, which can be sourced from Merck and includes a 3% CTAB solution combined with Tris (1M, pH 8), EDTA, NaCl, and deionized water, along with a TE buffer (Tris 1M, pH 8).

8, EDTA, nước khử ion); Isopropanol; Isoamylalcohol; Chloroform; β- mercaptoethanol

Trong nghiên cứu này, các hóa chất cần thiết cho kỹ thuật PCR bao gồm dNTP mix và Phusion Polymerase từ Thermo Scientific, cùng với cặp mồi tổng hợp từ hãng Phusa Biochem (Việt Nam) Cặp mồi được sử dụng có trình tự cụ thể: mồi xuôi F là 5’CAC AAC TGT AAG ATC CTT TCA AA 3’ và mồi ngược R là 5’CAT ACG CAT AGC ATG TAA CTG 3’ Những hóa chất này đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu khác trên toàn thế giới.

Electrophoresis chemicals include Agarose, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA) from Affymetrix, 5X DNA loading dye from Lonza, and GeneRuler 100bp DNA Ladder and Lambda DNA/HindIII Ladder from Thermo Scientific Additionally, Tris base from Bio Basic and acetic acid from Merck are essential components for effective DNA analysis.

The article highlights essential laboratory equipment, including the Gel Doc It imaging system from the USA, Cleaver Scientific's electrophoresis system from the UK, and the Prime Thermal Cycler PCR machine also from the UK It features the ESCO biosafety cabinet from Singapore, the EBA 21 centrifuge from Hettich Zentrifugen in Germany, and the VELP shaker from Scientifica, Germany Additionally, it mentions the NP80 nanophotometer from Germany, the Fiocchetti flake ice machine from Italy, and various incubators and refrigerators, including the Panasonic incubator and deep freezer at -30°C, as well as the FRIMED refrigerator at 4°C, both from Japan.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.1

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA can be isolated using four methods: the Mini-CTAB method (Sanghai-Maroof et al., 1984), an improved CTAB method (Elias et al., 2004), the DNeasy Plant Mini Kit from Qiagen (Germany), and the GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit from Thermo Scientific (USA).

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Quy trình DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) thực hiện theo khuyến cáo của hãng

Quy trình CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 20 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 388 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C và bổ sung 12 àL β-mercaptoethanol

Bước 3: Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút trong khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút, cứ 20 phút đảo mẫu một lần

Bước 4: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 200 àL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút, dùng khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút trong 20 phút

Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 6: Hút dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 7: Bổ sung thể tích tương đương Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và 80 àL CTAB 3%

Bước 8: Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 9: Hỳt dịch pha trờn chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 140 àL isopropanol đã làm lạnh ở -20 o C

Bước 10: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 60 phút

Bước 11: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi

Bước 12: Bổ sung 0,5mL dung dịch ethanol 70%, búng đều

Bước 13: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút ít nhất 12 giờ

Bước 14: Hũa tan DNA tủa trong 100 àL đệm TE và 2 àL RNase

Quy trình Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 50 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 800 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút (cứ 15 phút đảo mẫu một lần)

Bước 3: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 500 àL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút

Bước 4: Ly tâm lạnh ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 5: Hỳt 500 àL phần dịch bờn trờn và chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 6: Bổ sung 500 àL Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và

Bước 8: Hỳt 500 àL từ từ phần dịch bờn trờn (pha trong) và chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 350 àL isopropanol đó làm lạnh ở -20 o C

Bước 9: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 30 phút

Bước 11: Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút

Bước 12: Hũa tan DNA tủa trong 150 àL đệm

Với sự tiến bộ của khoa học, nhiều phương pháp mới đã được phát triển để nâng cao hiệu suất phân lập DNA, bao gồm việc sử dụng các bộ dụng cụ thương mại Một số bộ Mini Kit phổ biến cho tách chiết DNA tổng số từ thực vật là DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) Nguyên lý của các bộ kit này dựa trên việc thay đổi môi trường pH, giúp tăng ái lực của DNA và gắn DNA lên màng silica Quá trình này bao gồm việc ly giải mẫu thực vật, loại bỏ tạp chất, gắn DNA lên màng silica và rửa giải để thu được DNA tinh sạch.

Axit ascorbic, axit diethyldithiocarbamic và 2-mercaptoethanol có khả năng bảo vệ DNA khỏi oxy hóa và biến tính Để loại bỏ RNA, có thể sử dụng enzyme RNase.

Hình 1.6 Nguyên lí hoạt động màng silica [58]

Hình 1.7 Sơ đồ mô tả quy trình tách chiết DNA sử dụng cột thu silica

Các bước tách chiết DNA sử dụng màng silica cơ bản gồm:

Để ly giải DNA, thành tế bào thực vật được phá vỡ bằng cách sử dụng đệm ly giải và các muối chaotropic, giúp làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước.

Bước 2: Loại bỏ tạp chất: thêm 1 số enzym có khả năng phân hủy protein,

RNASE để loại bỏ RNA

Bước 3: Gắn DNA lên bề mặt hạt silica bằng cách sử dụng muối hoạt động hoặc cồn, giúp phá vỡ lớp vỏ hydrat hóa xung quanh Quá trình này cho phép các ion tích điện dương tạo thành cầu nối muối giữa silica tích điện âm và DNA tích điện âm.

Bước 4: Rửa giải là quá trình loại bỏ tạp chất còn sót lại trên màng silica gel và dùng ethanol để loại bỏ muối dư Sau khi hoàn thành bước này, chỉ còn DNA gắn trên màng silica gel, và để đảm bảo ethanol đã được loại bỏ hoàn toàn, cần thực hiện ly tâm để làm khô cột.

Bước 5: Giải phóng thu hồi DNA: DNA được giải phóng khỏi màng silica bằng cách giải hấp với dung dịch ion thấp, chẳng hạn như TE hoặc nước

Kiểm tra và định lượng DNA

Kiểm tra sự có mặt của DNA được thực hiện bằng điện di sản phẩm tách trên gel agarose 1.2% trong 30 phút với hiệu điện thế 100 V Mẫu 4 µL sản phẩm tách được trộn với 1 µL đệm chứa ethidium bromide trong đệm TAE 1X Các băng DNA sẽ hiện hình khi soi dưới ánh sáng tử ngoại Định lượng nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết bằng cách đo chỉ số.

Tỷ lệ OD260/280, đo lường sự hấp thụ quang của DNA ở bước sóng 260 nm so với 280 nm, thường dao động trong khoảng 1.8-2.0 Giá trị này cho thấy DNA đã được tách chiết một cách tinh khiết.

2.4.2 Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Tất cả các phản ứng đều có đối chứng âm và đối chứng dương Phusion DNA polymerase được sử dụng cho phản ứng PCR với khả năng tạo những mẫu dài với độ chính xác và tốc độ cao chỉ với một enzyme duy nhất ngay cả ở những đoạn gen khó nhân dòng nhất Phusion DNA polymerase đem lại hiệu suất cao nhờ hoạt tính nhân dòng chiều 5’- 3’ và đọc sửa

Enzyme cắt mạch DNA theo chiều 3' - 5' có khả năng phát hiện và loại bỏ các cặp base bổ sung không chính xác Khi gặp phải base không khớp, DNA polymerase sẽ đảo ngược chiều và cắt bỏ base đó, sau đó lắp lại base chính xác để tiếp tục quá trình tái bản DNA.

Sản phẩm PCR được kiểm tra chất lượng bằng cách sử dụng gel agarose 1,5% trong đệm TAE Để xác định kích thước sản phẩm, chúng tôi sử dụng thang chuẩn GeneRuler 100 bp DNA Ladder.

2.4.3 Tinh sạch và giải trình tự Để thu được kết quả giải trỡnh tự chỳng tụi tiến hành thu 20 àL sản phẩm PCR gửi đi hãng First Base (Malaysia) để tinh sạch và giải trình tự Kết quả giải trình tự được hiển thị bằng phần mềm BioEdit version 7.2.6.1, qua đó xác định được kiểu gen của từng mẫu nghiên cứu

Khi đọc kết quả giải trình tự, mỗi nucleotit được biểu thị bằng một đỉnh có màu sắc đặc trưng: A màu xanh lá cây, C màu xanh da trời, G màu đen, và T màu đỏ Nếu tại vị trí của mỗi nucleotit chỉ có một đỉnh màu xuất hiện, điều này cho thấy mẫu thực vật có kiểu gen đồng hợp tử Ngược lại, nếu có hai đỉnh màu xuất hiện, mẫu thực vật đó có kiểu gen dị hợp tử.

Hình 2.2 Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit

2.4.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen

Sử dụng phần mềm Sequencher 5.4.6 để chỉnh sửa chuỗi nucleotit, loại bỏ những pic nhiễu ở đầu và cuối chuỗi Phân tích phát sinh loài được thực hiện bằng phương pháp Maximum Likelihood trong phần mềm Mega X với 1000 lần lặp bootstrap Để phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân, có thể tham khảo các trình tự gen đã được công bố trên Genbank, bao gồm các loài thuộc chi Hedera và hai loài thuộc chi Merrilliopanax.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tách chiết DNA tổng số

Kết quả điện di DNA từ 10 mẫu nghiên cứu cho thấy tất cả các mẫu đều thu hồi thành công DNA tổng số qua 4 quy trình tách chiết.

DNA từ các mẫu hiện hình cho thấy một băng rõ nét tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn DNA, cho thấy rằng DNA ít bị đứt gãy trong quá trình thao tác.

Hình 3.1 Kết quả DNA tổng số điện di trên gel agarose 1,2%

Nghiên cứu về việc phân lập DNA từ mẫu lá khô H.nepalensis cho thấy nồng độ DNA tổng số dao động từ 10,5 đến 437,4 ng/μL, với phương pháp Mini-CTAB thu hồi lượng DNA cao nhất, trung bình đạt 437,4 ng/μL Phương pháp CTAB cải tiến cho nồng độ DNA trung bình là 237,7 ng/μL, trong khi DNeasy Plant Mini Kit và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit chỉ thu hồi lần lượt 13,7 và 10,6 ng/μL, thấp hơn hơn 20 lần so với các phương pháp CTAB.

Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

Kết quả đo OD260/280 trong khoảng từ 1,8-2,0 cho thấy DNA thu được có độ tinh sạch cao, trong khi giá trị dưới 1,8 chỉ ra sự tồn tại của protein, tức là độ tinh sạch thấp Nghiên cứu cho thấy nồng độ DNA và chỉ số OD260/280 dao động từ 1,8 đến 2,0, chứng tỏ độ tinh sạch của DNA được đảm bảo qua cả 4 phương pháp tách chiết Chi tiết về nồng độ và chỉ số OD260/280 được trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2 Chỉ số OD 260/280 của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen GBSSI bằng kỹ thuật PCR27 1 Tối ưu quy trình PCR

3.2.1 Tối ưu quy trình PCR

Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Trong phản ứng PCR, nhiệt độ gắn mồi đóng vai trò quan trọng để đạt được hiệu suất cao Do đó, dựa trên khuyến cáo của nhà sản xuất, chúng tôi đã tiến hành tối ưu nhiệt độ trong dải nhiệt với 8 mức khác nhau: 48,2; 50,3; và 52,0 độ.

Nghiên cứu về nhiệt độ gắn mồi cho gen GBSSI cho thấy rằng ở nhiệt độ từ 48,2 o C đến 59,2 o C, sản phẩm điện di cho ra băng sáng khoảng 700 bp Trong khoảng 48,2 o C đến 50,3 o C, có thêm một băng không đặc hiệu nhưng rất mờ Kết quả cho thấy rằng nhiệt độ gắn mồi từ 52 o C đến 57,5 o C tạo ra băng sản phẩm điện di sáng, đặc hiệu và có kích thước phù hợp với lý thuyết (~700 bp) Do đó, khoảng nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho phản ứng khuếch đại gen GBSSI là từ 52 o C đến 57,5 o C.

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kí hiệu trên các làn: nhiệt độ gắn mồi ( 0 C); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương

Kết quả tối ưu nồng độ DNA

Nồng độ DNA tối ưu được xác định với các mức 6,25; 12,5; 25; 50; 100; và 200 ng/µL Hình 3.3 minh họa kết quả điện di của sản phẩm với nồng độ DNA tối ưu, cho thấy các băng đều sáng và đặc hiệu trong khoảng nồng độ từ 6,25 đến 200 ng/µL, trong đó có hai băng tại nồng độ cụ thể.

Nồng độ DNA khuẩn tối ưu cho phản ứng PCR được xác định là 25 (ng/àL), dựa trên kết quả từ việc so sánh các nồng độ 25 (ng/àL) và 50 (ng/àL) cho băng đặc hiệu và sỏng nhất.

Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kớ hiệu trờn cỏc làn: nồng độ DNA (ng/àL); (-): Đối chứng õm; (+): Đối chứng dương

Kết quả tối ưu nồng độ mồi:

Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn 100 bp; Kí hiệu trờn cỏc làn: nồng độ mồi (àM) tương ứng với 3 mẫu; (-): Đối chứng õm

Nồng độ tối ưu của mồi gen GBSSI được xác định là 0,1; 0,3 và 0,9 àM Kết quả điện di sản phẩm cho thấy nồng độ 0,3 àM cho ra các băng sỏng, đặc hiệu và ổn định nhất Do đó, nồng độ hoạt động tối ưu được chọn cho mồi gen GBSSI là 0,3 àM.

3.2.2 So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình

Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu quy trình chúng tôi tiến hành chạy phản ứng PCR với các thành phần và điều kiện chi tiết trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ hoạt động

(25 àL) Điều kiện (chu trình nhiệt)

Nước khử ion 14,75 *Biến tính đầu: 98 o C – 30 giây

*Giữ sản phẩm ở 4 o C Đệm 5x 1x 5,0 dNTPs 2 mM 0,2 mM 2,5

Hình 3.5 Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% sử dụng DNA tổng số từ quy trình khác nhau Làn M: O Gene Ruler Ladder DNA

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU marker, Làn (-): đối chứng âm Làn H: sản phẩm PCR từ các mẫu có kí hiệu tương ứng

Chúng tôi đã tiến hành PCR gen GBSSI trên 10 mẫu DNA thu được từ 4 quy trình tách chiết khác nhau Quy trình Mini-CTAB chỉ cho 3/10 mẫu lên băng, bao gồm H3, H4, H21 Trong khi đó, quy trình CTAB cải tiến cho hiệu quả nhân dòng cao hơn với 5/10 mẫu, cụ thể là H2, H3, H4, H6, HH Đặc biệt, PCR từ DNA sử dụng bộ kit GeneJET Mini Kit và DNeasy Plant Mini Kit cho kết quả tốt nhất với 9/10 mẫu lên băng sáng rõ Kết quả cho thấy hiệu quả nhân dòng gen từ các mẫu DNA thu được từ kit cao hơn so với quy trình Mini-CTAB và CTAB cải tiến.

Độ tương đồng của trình tự gen GBSSI được khuếch đại

Trình tự vùng gen GBSSI của 9/10 mẫu nghiên cứu đã được xác nhận, với chiều dài khoảng 618 bp Để nghiên cứu đa hình di truyền của gen này, chúng tôi đã tiến hành so sánh 9 mẫu với 15 trình tự từ các loài khác trong cùng chi.

Hedera cùng với 2 loài khác thuộc chi Merrilliopanax đã công bố trên Genbank với chiều dài khoảng 560 bp Bảng 3.4

Bảng 3.4 Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên loài/thứ Mã số

Phân loại H.nepalensis và H.sinensis hiện vẫn còn nhiều vấn đề tranh cãi

H.helix và H.nepalensis khác biệt di truyền như thế nào cũng là một câu hỏi cần lời giải Chính vì vậy, chúng tôi tiên hành so sánh 9 trình tự của các mẫu trong nghiên cứu này với các trình tự đã được công bố trên genbank của H.nepalensis, H.sinensis, H.helix Kết quả đối chiếu trình tự nucleotit vùng gen nghiên cứu thể

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU hiện ở Hình 3.6 Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự

Kết quả phân tích GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu H.nepalensis, H.sinensis và H.helix cho thấy chúng có sự tương đồng 99.7%, chỉ khác nhau ở 8/618 nucleotit Các mẫu được phân thành 3 nhóm: Nhóm I gồm H1, H2, H4, H5, H6 hoàn toàn giống nhau; Nhóm II gồm H3 và HH với 3 nucleotit khác biệt tại các vị trí 13, 421 và 603 so với Nhóm I; Nhóm III gồm H16, H21 có 1 nucleotit khác tại vị trí 243 và 263 so với Nhóm I.

Hình 3.6 So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotit sai khác (phía trên bên phải) giữa trình tự GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với

9 mẫu thu thập ở Việt Nam có trình tự tương đồng với so với H.nepalensis

Trình tự nucleotit của AY204084.1 cho thấy sự khác biệt đáng kể, với ít nhất 2/565 nucleotit so với các mẫu H1, H2, H4, H5, H6 và lên đến 5/565 nucleotit với các mẫu H3, HH Sự khác biệt giữa H.helix và H.sinensis là rõ rệt, với 9 mẫu nghiên cứu có sự khác biệt 268/618 so với mẫu H1, và H.nepalensis cũng có sự khác biệt 268/565 nucleotit.

Kết quả phân tích khoảng cách di truyền cho thấy rằng khoảng cách di truyền giữa các mẫu H.nepalensis ở Việt Nam cho gen GBSSI không cao Sự khác biệt di truyền lớn nhất được ghi nhận giữa mẫu H.helix và H.sinensis với giá trị khoảng cách di truyền là 1,91 Trong khi đó, các mẫu H1, H2, H4, H5, H6, H16, H21 và H.nepalensis hầu như không có sự khác biệt di truyền.

Chín mẫu bao gồm H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21, HH đã được nhân dòng và giải trình tự gen GBSSI thành công Phân tích gen cho thấy có 8 nucleotit khác nhau giữa các mẫu trong đoạn gen dài 618 bp.

Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI

Trước khi xây dựng cây phát sinh chủng loại cho GBSSI, mô hình tiến hóa được tính toán bằng phần mềm Mega X Mô hình tối ưu là Tamura 3 tham số (T92) với phân phối Gamma, đạt BIC = 7042,115; AICc = 6657,293; -lnL = 3277,457; R = 1.45 Phân tích bootstrap được thực hiện với 1000 lần lấy lại mẫu, trong đó mức độ tin cậy được phân loại như sau: cao (>85%), trung bình (65-85%), và thấp (C) và 368 (A=>T) cho thấy sự khác biệt ở loài H21, cùng với ba vị trí khác tại nucleotit số 263 (T=>C), 368 (A=>T) và 269 (A=>C) Đặc biệt, loài H3 có năm vị trí khác biệt tại các nucleotit 13, 368, 369, 420 và 603 Những vị trí này có thể là đặc trưng riêng của loài H.nepalensis tại Việt Nam hoặc liên quan đến sự hình thành loài mới tại đây Nghiên cứu của chúng tôi đã bổ sung dữ liệu quan trọng cho việc phân loại một số loài thuộc chi này.

Hedera Cụ thể, phân loại được loài H.nepalensis tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc,

Việt Nam có sự hiện diện của nhiều loài như H.algeriensis, H.maroccana, H.caucasigena, H.cypria, H.maderansis, H.pastuchovii, H.azorica, H.canariensis, và H.Hibernica Điều này cho thấy rằng, gen GBSSI đóng vai trò quan trọng trong việc phân loại các loài này.

H.nepalensis với các loài khác trong chi Hedera

Loài Dây thường xuân, có tên khoa học là Hedera nepalensis K Koch, lần đầu tiên được mô tả và đặt tên theo hệ thống phân loại bởi tác giả K Koch vào năm 1880.

1853 Năm 1929, tác giả Wien gộp một loài khác là Hedera sinensis vào cùng loài

Hedera nepalensis K Koch được coi là một tên đồng danh của Hedera sinensis, nhưng theo nghiên cứu của Jun Wen vào năm 2002, loài này được chia thành hai thứ: H.nepalensis var.sinensis và H.nepalensis var.nepalensis Hai thứ này có thể phân biệt dựa trên số lượng thùy lá, với var.nepalensis có 5 thùy và var.sinensis có 3 thùy, cùng với sự khác biệt về số lượng thùy bên Tuy nhiên, một số mẫu của H nepalensis var.sinensis cho thấy sự biến đổi về số lượng thùy lá, dẫn đến sự trùng lặp giữa hai thứ này Để giải quyết vấn đề phân loại hình thái, phân tích di truyền là công cụ chính xác và hữu ích Trong phân tích đa dạng di truyền, hai thứ loài được phân biệt bởi mức độ đa dạng, và theo cây phát sinh chủng loại từ chỉ thị GBSSI, H.nepalensis và H.sinensis được tách thành hai nhánh với độ tin cậy cao ở nhánh H.nepalensis (99%).

GBSSI có thể giúp giải quyết vấn đề phân loại hình thái giữa hai loài Để nâng cao hiểu biết về đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân, cần khảo sát thêm các chỉ thị phân tử khác như ITS (gen nhân) và matK (gen lục lạp).

Định dạng
Số trang	54
Dung lượng	1,42 MB