Khóa luận lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở việt nam dựa trên chỉ thị GBSSI

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

9 mẫu thực vật đã được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái thuộc loài

Hedera nepalensis được thu thập tại một số tỉnh miền núi phía Bắc, với các mẫu được lấy bởi nhóm nghiên cứu từ Viện Dược liệu, chi tiết được trình bày trong Bảng 2.1.

Một mẫu thuộc loài Hedera helix được sử dụng trong nghiên cứu để đối chiếu, lấy từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu: mẫu lá non, sạch đã được sấy khô và bảo quản trong túi silicagel chống ẩm

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu

Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2018 đến ngày 25 tháng 4 năm 2019, tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Y Dược học cơ sở, thuộc Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

TT Ký hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu Tọa độ địa lý

1 H1 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N-103°47'31.76"E

2 H2 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E

3 H3 Trạm cây thuốc Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E

4 H4 Hồ Thầu, Hoàng Su Phì,

5 H5 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

6 H6 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

7 H15 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E

8 H16 Phó Bảng, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E

9 H21 Sủng Là, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E

10 HH Vườn Thực vật Hoa Nam,

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

To extract total DNA, several chemical kits and reagents are available, including the Dneasy Plant Mini kit from Qiagen (Germany) and the GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini kit from Thermo Scientific (USA) Additionally, the CTAB method and its improved version, sourced from Merck, utilize a 3% CTAB solution combined with Tris (1M, pH 8), EDTA, NaCl, and deionized water, along with TE buffer (Tris 1M, pH 8).

8, EDTA, nước khử ion); Isopropanol; Isoamylalcohol; Chloroform; β- mercaptoethanol

Hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật PCR bao gồm dNTP mix và Phusion Polymerase từ Thermo Scientific, cùng với cặp mồi tổng hợp từ Phusa Biochem (Việt Nam) Cặp mồi này đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu trên thế giới, với trình tự mồi xuôi F là 5’CAC AAC TGT AAG ATC CTT TCA AA 3’ và mồi ngược R là 5’CAT ACG CAT AGC ATG TAA CTG 3’.

Electrophoresis chemicals include Agarose, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA) from Affymetrix, and 5X DNA loading dye from Lonza Essential tools for DNA analysis are the GeneRuler 100bp DNA Ladder and Lambda DNA/HindIII Ladder, both provided by Thermo Scientific Additionally, Tris base from Bio Basic and acetic acid from Merck are crucial components in the preparation of electrophoresis gels.

The article highlights essential laboratory equipment including the Gel Doc It imaging system from the USA, Cleaver Scientific Ltd's electrophoresis system from the UK, and the Prime Thermal Cycler PCR machine also from the UK It features the ESCO biological safety cabinet from Singapore, Hettich Zentrifugen's EBA 21 centrifuge from Germany, and the VELP Scientifica shaker from Germany Additionally, it mentions the NP80 spectrophotometer from Nanophotometer in Germany, the Fiocchetti flake ice maker from Italy, the Panasonic incubator from Japan, and both the -30°C Panasonic deep freezer and the 4°C FRIMED refrigerator from Japan.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.1

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA can be isolated using four methods: the Mini-CTAB method (Sanghai-Maroof et al., 1984), an improved CTAB method (Elias et al., 2004), the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany), and the GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, USA).

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Quy trình DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) thực hiện theo khuyến cáo của hãng

Quy trình CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 20 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 388 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C và bổ sung 12 àL β-mercaptoethanol

Bước 3: Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút trong khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút, cứ 20 phút đảo mẫu một lần

Bước 4: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 200 àL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút, dùng khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút trong 20 phút

Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 6: Hút dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 7: Bổ sung thể tích tương đương Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và 80 àL CTAB 3%

Bước 8: Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 9: Hỳt dịch pha trờn chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 140 àL isopropanol đã làm lạnh ở -20 o C

Bước 10: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 60 phút

Bước 11: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi

Bước 12: Bổ sung 0,5mL dung dịch ethanol 70%, búng đều

Bước 13: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút ít nhất 12 giờ

Bước 14: Hũa tan DNA tủa trong 100 àL đệm TE và 2 àL RNase

Quy trình Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 50 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 800 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút (cứ 15 phút đảo mẫu một lần)

Bước 3: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 500 àL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút

Bước 4: Ly tâm lạnh ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 5: Hỳt 500 àL phần dịch bờn trờn và chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 6: Bổ sung 500 àL Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và

Bước 8: Hỳt 500 àL từ từ phần dịch bờn trờn (pha trong) và chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 350 àL isopropanol đó làm lạnh ở -20 o C

Bước 9: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 30 phút

Bước 11: Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút

Bước 12: Hũa tan DNA tủa trong 150 àL đệm

Với sự tiến bộ của khoa học, nhiều phương pháp mới đã được phát triển để nâng cao hiệu suất phân lập DNA, bao gồm việc sử dụng các bộ dụng cụ thương mại như DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) Nguyên tắc của các bộ kit này dựa trên việc thay đổi môi trường pH, giúp tăng ái lực của DNA và gắn DNA lên màng silica Quá trình này bao gồm việc ly giải mẫu thực vật, loại bỏ tạp chất, gắn DNA lên màng silica và rửa giải để thu được DNA tinh khiết.

Axit ascorbic, axit diethyldithiocarbamic và 2-mercaptoethanol có khả năng bảo vệ DNA khỏi oxy hóa và biến tính Để loại bỏ RNA, có thể sử dụng enzyme RNase.

Hình 1.6 Nguyên lí hoạt động màng silica [58]

Hình 1.7 Sơ đồ mô tả quy trình tách chiết DNA sử dụng cột thu silica

Các bước tách chiết DNA sử dụng màng silica cơ bản gồm:

Bước đầu tiên trong quy trình tách DNA là ly giải tế bào thực vật, nơi mà các tế bào được phá vỡ nhờ vào sự tác động của đệm ly giải và các muối chaotropic Những yếu tố này giúp làm mất tính bền vững của các liên kết hydro, lực Van der Waals, cũng như các tương tác kỵ nước, từ đó giải phóng DNA ra khỏi tế bào.

Bước 2: Loại bỏ tạp chất: thêm 1 số enzym có khả năng phân hủy protein,

RNASE để loại bỏ RNA

Bước 3: Gắn DNA lên bề mặt hạt silica bằng cách sử dụng muối hoạt động hoặc cồn, giúp phá vỡ lớp vỏ hydrat hóa xung quanh Quá trình này cho phép các ion tích điện dương tạo thành cầu nối muối giữa silica tích điện âm và DNA tích điện âm.

Bước 4 trong quy trình là rửa giải, nhằm loại bỏ tạp chất còn sót lại trên màng silica gel và sử dụng ethanol để loại bỏ muối dư Sau khi hoàn thành bước này, chỉ còn DNA gắn trên màng silica gel, và chúng sẽ được làm khô bằng ly tâm để đảm bảo ethanol đã được loại bỏ hoàn toàn.

Bước 5: Giải phóng thu hồi DNA: DNA được giải phóng khỏi màng silica bằng cách giải hấp với dung dịch ion thấp, chẳng hạn như TE hoặc nước

Kiểm tra và định lượng DNA

Kiểm tra sự có mặt của DNA được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm tách trên gel agarose 1.2% trong vòng 30 phút với hiệu điện thế 100 V Mẫu 4 µL sản phẩm tách được trộn với 1 µL đệm chứa ethidium bromide trong đệm TAE 1X Các băng DNA sẽ được hiện hình khi soi dưới ánh sáng tử ngoại Định lượng nồng độ và độ tinh khiết của DNA tách chiết được thực hiện bằng cách đo chỉ số.

Tỷ lệ OD260/280 là chỉ số quan trọng để đánh giá độ tinh khiết của DNA, được tính bằng cách so sánh độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm với độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm Giá trị OD260/280 lý tưởng cho DNA tinh khiết thường nằm trong khoảng 1.8-2.0.

2.4.2 Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Tất cả các phản ứng đều có đối chứng âm và đối chứng dương Phusion DNA polymerase được sử dụng cho phản ứng PCR với khả năng tạo những mẫu dài với độ chính xác và tốc độ cao chỉ với một enzyme duy nhất ngay cả ở những đoạn gen khó nhân dòng nhất Phusion DNA polymerase đem lại hiệu suất cao nhờ hoạt tính nhân dòng chiều 5’- 3’ và đọc sửa

Enzyme cắt mạch DNA hoạt động theo chiều 3' - 5', có khả năng nhận diện và loại bỏ các cặp base không chính xác Khi gặp base không bổ sung đúng, DNA polymerase sẽ đảo ngược chiều và cắt bỏ base sai Sau khi loại bỏ, enzyme này sẽ lắp lại base chính xác và tiếp tục quá trình tái bản DNA.

Sản phẩm PCR được kiểm tra chất lượng bằng cách sử dụng gel agarose 1,5% trong đệm TAE, với thang chuẩn GeneRuler 100 bp DNA Ladder để xác định kích thước sản phẩm.

2.4.3 Tinh sạch và giải trình tự Để thu được kết quả giải trỡnh tự chỳng tụi tiến hành thu 20 àL sản phẩm PCR gửi đi hãng First Base (Malaysia) để tinh sạch và giải trình tự Kết quả giải trình tự được hiển thị bằng phần mềm BioEdit version 7.2.6.1, qua đó xác định được kiểu gen của từng mẫu nghiên cứu

Khi đọc kết quả giải trình tự, mỗi nucleotit được biểu diễn bằng một đỉnh màu sắc đặc trưng: A (màu xanh lá cây), C (màu xanh da trời), G (màu đen) và T (màu đỏ) Nếu tại vị trí của một nucleotit chỉ xuất hiện một đỉnh màu, điều này cho thấy mẫu thực vật có kiểu gen đồng hợp tử Ngược lại, nếu có hai đỉnh màu xuất hiện, mẫu đó có kiểu gen dị hợp tử.

Hình 2.2 Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit

2.4.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen

Sử dụng phần mềm Sequencher 5.4.6 để chỉnh sửa chuỗi nucleotit, loại bỏ các pic nhiễu ở đầu và cuối chuỗi Phân tích phát sinh loài được thực hiện bằng phương pháp Maximum Likelihood trong phần mềm Mega X với 1000 lần lặp bootstrap Để phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân, có thể tham khảo các trình tự gen đã được công bố trên Genbank, bao gồm các loài thuộc chi Hedera và hai loài thuộc chi Merrilliopanax.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tách chiết DNA tổng số

Kết quả điện di DNA từ 10 mẫu nghiên cứu cho thấy tất cả các mẫu đều thu hồi thành công DNA tổng số qua 4 quy trình tách chiết khác nhau.

DNA từ các mẫu hiện hình cho thấy một băng rõ nét tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn DNA, điều này chứng tỏ rằng DNA ít bị đứt gãy trong quá trình thao tác.

Hình 3.1 Kết quả DNA tổng số điện di trên gel agarose 1,2%

Mẫu lá khô H.nepalensis được phân lập DNA bằng các phương pháp Mini-CTAB, CTAB cải tiến, DNeasy Plant Mini Kit và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit cho thấy nồng độ DNA tổng số dao động từ 10,5 đến 437,4 ng/μL Phương pháp Mini-CTAB đạt hiệu quả cao nhất với nồng độ trung bình 437,4 ng/μL, trong khi CTAB cải tiến cho nồng độ trung bình 237,7 ng/μL Các phương pháp DNeasy Plant Mini Kit và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit chỉ thu hồi được nồng độ DNA trung bình lần lượt là 13,7 và 10,6 ng/μL, thấp hơn hơn 20 lần so với CTAB và CTAB cải tiến.

Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

Kết quả đo OD260/280 trong khoảng từ 1,8-2,0 cho thấy DNA thu được có độ tinh sạch cao, trong khi giá trị dưới 1,8 chỉ ra rằng DNA còn lẫn nhiều protein, tức là độ tinh sạch thấp Độ tinh sạch của nồng độ DNA trong nghiên cứu được đánh giá qua chỉ số hấp thụ quang OD260/280, dao động từ 1,8 đến 2,0, cho thấy DNA đạt độ tinh sạch ở cả 4 phương pháp tách chiết Thông tin về nồng độ và chỉ số OD260/280 được trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2 Chỉ số OD 260/280 của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen GBSSI bằng kỹ thuật PCR27 1 Tối ưu quy trình PCR

3.2.1 Tối ưu quy trình PCR

Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Trong phản ứng PCR, nhiệt độ gắn mồi đóng vai trò quan trọng để đảm bảo hiệu suất cao Dựa trên khuyến cáo của nhà sản xuất, chúng tôi đã tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ trong dải nhiệt gồm 8 mức khác nhau: 48,2°C, 50,3°C và 52,0°C.

Nghiên cứu về nhiệt độ gắn mồi cho gen GBSSI cho thấy rằng ở các nhiệt độ từ 48,2 o C đến 59,2 o C, sản phẩm điện di cho băng sáng kích thước khoảng 700 bp Đặc biệt, trong khoảng nhiệt độ từ 48,2 o C đến 50,3 o C xuất hiện thêm một băng không đặc hiệu, mặc dù rất mờ Kết quả cho thấy rằng việc gắn mồi ở nhiệt độ từ 52 o C đến 57,5 o C tạo ra băng sản phẩm điện di sáng, đặc hiệu và kích thước phù hợp với lý thuyết (~700 bp) Do đó, nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho phản ứng khuếch đại gen GBSSI được xác định nằm trong khoảng từ 52 o C đến 57,5 o C.

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kí hiệu trên các làn: nhiệt độ gắn mồi ( 0 C); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương

Kết quả tối ưu nồng độ DNA

Nồng độ DNA tối ưu được xác định với các mức 6,25; 12,5; 25; 50; 100; và 200 ng/µL Hình 3.3 hiển thị kết quả điện di của sản phẩm với nồng độ DNA tối ưu Các băng đều rõ ràng và đặc hiệu từ nồng độ 6,25 đến 200 ng/µL, trong đó có hai băng xuất hiện ở nồng độ cụ thể.

Nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng PCR được xác định là 25 ng/µL, dựa trên kết quả từ các thí nghiệm với nồng độ 25 ng/µL và 50 ng/µL cho băng đặc hiệu và sỏng nhất.

Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kớ hiệu trờn cỏc làn: nồng độ DNA (ng/àL); (-): Đối chứng õm; (+): Đối chứng dương

Kết quả tối ưu nồng độ mồi:

Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn 100 bp; Kí hiệu trờn cỏc làn: nồng độ mồi (àM) tương ứng với 3 mẫu; (-): Đối chứng õm

Nồng độ tối ưu của mồi gen GBSSI được xác định là 0,1; 0,3 và 0,9 àM Kết quả điện di sản phẩm cho thấy nồng độ 0,3 àM tạo ra các băng sỏng, đặc hiệu và ổn định nhất Do đó, nồng độ hoạt động tối ưu của mồi cho gen GBSSI được chọn là 0,3 àM.

3.2.2 So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình

Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu quy trình chúng tôi tiến hành chạy phản ứng PCR với các thành phần và điều kiện chi tiết trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ hoạt động

(25 àL) Điều kiện (chu trình nhiệt)

Nước khử ion 14,75 *Biến tính đầu: 98 o C – 30 giây

*Giữ sản phẩm ở 4 o C Đệm 5x 1x 5,0 dNTPs 2 mM 0,2 mM 2,5

Hình 3.5 Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% sử dụng DNA tổng số từ quy trình khác nhau Làn M: O Gene Ruler Ladder DNA

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU marker, Làn (-): đối chứng âm Làn H: sản phẩm PCR từ các mẫu có kí hiệu tương ứng

Chúng tôi đã tiến hành PCR gen GBSSI trên 10 mẫu DNA thu được từ 4 quy trình tách chiết khác nhau Quy trình Mini-CTAB chỉ cho 3/10 mẫu lên băng, trong khi quy trình CTAB cải tiến đạt hiệu quả cao hơn với 5/10 mẫu Đặc biệt, PCR từ DNA sử dụng kit GeneJET Mini Kit và DNeasy Plant Mini Kit cho kết quả 9/10 mẫu lên băng sáng rõ Điều này cho thấy hiệu quả nhân dòng gen từ các mẫu DNA thu được từ kit cao hơn so với quy trình Mini-CTAB và CTAB cải tiến.

Độ tương đồng của trình tự gen GBSSI được khuếch đại

Trình tự vùng gen GBSSI của 9/10 mẫu nghiên cứu đã được xác nhận, với chiều dài khoảng 618 bp Để phân tích đa hình di truyền của gen GBSSI, chúng tôi đã so sánh 9 mẫu này với 15 trình tự của các loài khác trong cùng chi.

Hedera cùng với 2 loài khác thuộc chi Merrilliopanax đã công bố trên Genbank với chiều dài khoảng 560 bp Bảng 3.4

Bảng 3.4 Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên loài/thứ Mã số

Phân loại H.nepalensis và H.sinensis hiện vẫn còn nhiều vấn đề tranh cãi

H.helix và H.nepalensis khác biệt di truyền như thế nào cũng là một câu hỏi cần lời giải Chính vì vậy, chúng tôi tiên hành so sánh 9 trình tự của các mẫu trong nghiên cứu này với các trình tự đã được công bố trên genbank của H.nepalensis, H.sinensis, H.helix Kết quả đối chiếu trình tự nucleotit vùng gen nghiên cứu thể

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU hiện ở Hình 3.6 Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự

Kết quả phân tích GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu H.nepalensis, H.sinensis và H.helix cho thấy sự tương đồng lên đến 99.7%, chỉ khác nhau ở 8/618 nucleotit Các mẫu được phân chia thành 3 nhóm: Nhóm I gồm H1, H2, H4, H5, H6 hoàn toàn giống nhau; Nhóm II gồm H3 và HH có 3 nucleotit khác biệt so với Nhóm I tại các vị trí 13, 421 và 603; Nhóm III gồm H16, H21 có 1 vị trí nucleotit khác với Nhóm I tại các vị trí 243 và 263.

Hình 3.6 So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotit sai khác (phía trên bên phải) giữa trình tự GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với

9 mẫu thu thập ở Việt Nam có trình tự tương đồng với so với H.nepalensis

Trình tự nucleotit của H.helix và H.sinensis có sự khác biệt đáng kể so với 9 mẫu nghiên cứu, với độ sai khác thấp nhất là 2/565 nucleotit so với các mẫu H1, H2, H4, H5, H6 và cao nhất là 5/565 nucleotit so với mẫu H3, HH Đặc biệt, H.nepalensis cũng cho thấy sự khác biệt với 268/565 nucleotit so với mẫu H1.

Kết quả phân tích khoảng cách di truyền cho thấy rằng khoảng cách di truyền giữa các mẫu H.nepalensis ở Việt Nam cho gen GBSSI không cao Sự khác biệt di truyền lớn nhất được ghi nhận giữa mẫu H.helix và H.sinensis với giá trị khoảng cách di truyền là 1,91 Trong khi đó, các mẫu H1, H2, H4, H5, H6, H16, H21 và H.nepalensis hầu như không có sự khác biệt di truyền.

Chín mẫu bao gồm H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21, HH đã được nhân dòng và giải trình tự gen GBSSI thành công Phân tích gen cho thấy có 8 nucleotide khác nhau giữa các mẫu trong đoạn gen dài 618 bp.

Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI

Trước khi xây dựng cây phát sinh chủng loại cho GBSSI, mô hình tiến hóa được tính toán bằng phần mềm Mega X Mô hình tối ưu được xác định là Tamura 3 tham số (T92) với phân phối Gamma, cho kết quả BIC = 7042,115; AICc = 6657,293; -lnL = 3277,457; R = 1.45, cùng với phân tích bootstrap 1000 lần Mức độ tin cậy được phân loại: cao (>85%), trung bình (65-85%) và thấp (C), 368 (A=>T) và 263 (T=>C) ở loài H21, cũng như 5 vị trí khác biệt ở loài H3 tại nucleotit thứ 13, 368, 369, 420 và 603 Những vị trí này có thể là đặc trưng riêng cho loài H.nepalensis hoặc liên quan đến sự hình thành thứ loài mới tại Việt Nam, góp phần quan trọng vào việc phân loại các loài thuộc chi này.

Hedera Cụ thể, phân loại được loài H.nepalensis tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc,

Việt Nam có sự hiện diện của nhiều loài như H.algeriensis, H.maroccana, H.caucasigena, H.cypria, H.maderansis, H.pastuchovii, H.azorica, H.canariensis và H.Hibernica Qua đó, có thể kết luận rằng gen GBSSI là một chỉ thị hữu ích trong việc phân loại các loài này.

H.nepalensis với các loài khác trong chi Hedera

Dây thường xuân, mang tên khoa học là Hedera nepalensis K Koch, lần đầu tiên được mô tả và đặt tên theo hệ thống phân loại bởi tác giả K Koch vào năm 1879.

1853 Năm 1929, tác giả Wien gộp một loài khác là Hedera sinensis vào cùng loài

Hedera nepalensis K Koch được coi là một tên đồng danh của Hedera sinensis, nhưng nghiên cứu của Jun Wen năm 2002 chỉ ra rằng loài này có hai thứ: H.nepalensis var.sinensis và H.nepalensis var.nepalensis Sự phân biệt giữa hai thứ này dựa vào hai đặc điểm hình thái: số lượng thùy lá (5 trong var.nepalensis và 3 trong var.sinensis) và số lượng thùy bên (nhiều trong var.nepalensis và hầu như không có trong var.sinensis) Tuy nhiên, một số mẫu của H nepalensis var.sinensis cho thấy sự thay đổi về số lượng thùy lá từ 3 đến 5, dẫn đến sự trùng lặp giữa hai thứ Để giải quyết vấn đề phân loại hình thái, phân tích dựa trên các chỉ thị di truyền được xem là công cụ hữu ích với độ chính xác cao Phân tích đa dạng di truyền cho thấy hai thứ loài này có sự khác biệt rõ rệt, và theo cây phát sinh chủng loại xây dựng bởi chỉ thị GBSSI, H.nepalensis và H.sinensis tách thành hai nhánh với mức độ tin cậy cao (99%) ở nhánh H.nepalensis.

GBSSI có thể giúp giải quyết vấn đề phân loại hình thái giữa hai loài Để làm rõ hơn về đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân, cần tiến hành khảo sát thêm các chỉ thị phân tử khác như ITS (gen nhân) và matK (gen lục lạp).

Tiêu đề	Lựa Chọn Quy Trình Tách Chiết DNA Tổng Số Và Bước Đầu Phân Tích Đa Dạng Di Truyền Nguồn Gen Dây Thường Xuân (Hedera Nepalensis K.Koch) Ở Việt Nam Dựa Trên Chỉ Thị GBSSI
Tác giả	Nguyễn Thị Thu Thảo
Người hướng dẫn	PGS.TS. Đinh Đoàn Long, ThS. Phạm Thị Hồng Nhung
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	54
Dung lượng	1,42 MB