Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở miền bắc việt nam dựa trên chỉ thị matk

ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Bài viết giới thiệu 43 mẫu lá Dây thường xuân, trong đó có 41 mẫu được thu thập từ các tỉnh miền núi phía Bắc như Lào Cai, Hà Giang, Lai Châu và Lạng Sơn Ngoài ra, còn có 01 mẫu từ Lâm Đồng và 01 mẫu từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc, do Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu cung cấp.

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu bao gồm lá non, sạch, đã được sấy khô và bảo quản trong túi silicagel chống ẩm Các mẫu lá sau khi nhận về phòng thí nghiệm sẽ được nghiền mịn trong nitơ lỏng và bảo quản trong ống eppendorf 1,5 mL ở nhiệt độ -30 ºC cho đến khi sử dụng Thông tin chi tiết về 43 mẫu được trình bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu

Kí hiệu Địa điểm lấy mẫu Toạ độ địa lý

H4* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E

HH** Vườn TV Hoa Nam, Trung Quốc 23°11'12"N - 113°21'51"E

H27* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'18.38"N - 104°35'45.13"E

H28* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'43.50"N - 104°36'11.35"E

H31* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'11.06"N - 104°36'11.85"E

H32* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E

H33* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'08.44"N - 104°36'17.29"E

H34* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'00.73"N - 104°36'19.57"E

H38* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E

H41* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E

H42* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'31.37"N - 104°36'11.12"E

H43* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'04.61"N - 104°35'59.54"E

H44* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°40'04.61"N - 104°35'59.54"E

Nhận dạng hình thái: *Hedera nepalensis; ** Hedera helix

Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15/6/2018 đến 25/11/2019 tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

Hóa chất để tách chiết DNA tổng số: Bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini (Thermo Scientific, Mỹ)

Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật PCR bao gồm dNTP mix và Phusion Polymerase, cả hai đều đến từ Thermo Scientific Cặp mồi 390F/1326R được tổng hợp bởi công ty Phusa Biochem tại Việt Nam.

Mồi xuôi 390F: 5’ CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C 3’

Mồi ngược 1326R: 5’ TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T 3’

Electrophoresis chemicals essential for DNA analysis include Agarose, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA from Affymetrix), 5X DNA loading dye from Lonza, GeneRuler 100bp DNA Ladder and Lambda DNA/HindIII Ladder from Thermo Scientific, as well as Tris base from Bio Basic and acetic acid from Merck.

Phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội được trang bị nhiều thiết bị và dụng cụ thí nghiệm hiện đại, bao gồm cân phân tích, bể ổn nhiệt, máy soi chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức), máy lắc VELP (Scientifica, Đức), máy quang phổ NP80 (Nanophotometer, Đức), máy làm đá vảy (Fiocchetti, Ý), tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản), tủ lạnh sâu -30 o C (Panasonic, Nhật Bản) và tủ mát 4 o C (FRIMED, Nhật Bản).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA được phân lập bằng GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ), theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Thảo và cộng sự Quá trình bắt đầu bằng việc ly giải mẫu trong Lysis Buffer có RNase A, sau đó protein và polysaccharide được loại bỏ bằng Precipitation Solution Dịch ly giải được trộn với Plant gDNA Binding Solution và ethanol, rồi nạp vào cột tinh chế để DNA liên kết với màng silica Các tạp chất được loại bỏ bằng cách rửa cột với bộ đệm rửa, và DNA tổng số được rửa giải trong điều kiện cường độ ion thấp với Elution Buffer Quy trình này được thực hiện theo khuyến cáo của hãng.

Kiểm tra và định lượng DNA

Kiểm tra sự hiện diện của DNA được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm tách trên gel agarose 1.2% với hiệu điện thế 100 V và dòng điện 500 mA trong thời gian 45 phút.

Trộn 5 µL sản phẩm với 1 µL DYE 5X (chứa ethidium bromide) trong đệm TAE 1X Các băng DNA sẽ được hiện hình khi soi dưới ánh sáng tử ngoại Để xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết, tiến hành đo chỉ số.

Tỷ lệ OD260/280 đo lường sự hấp thụ quang của DNA tại bước sóng 260 nm so với 280 nm Giá trị OD260/280 trong khoảng 1,8 – 2,0 cho thấy DNA đã được tách chiết một cách tinh khiết.

2.4.2 Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Tất cả các phản ứng đều có đối chứng âm và đối chứng dương để loại bỏ sai sót của thao tác

Phusion DNA polymerase là enzyme lý tưởng cho phản ứng PCR, cho phép tạo ra các mẫu DNA dài với độ chính xác và tốc độ cao chỉ bằng một enzyme duy nhất, ngay cả trong các đoạn gen khó nhân dòng Enzyme này hoạt động hiệu quả nhờ vào khả năng nhân dòng theo chiều 5'-3' với mồi xuôi và sửa chữa theo chiều 3'-5' với mồi ngược Khi phát hiện cặp base bổ sung không chính xác, Phusion DNA polymerase có khả năng đảo ngược và cắt bỏ base không khớp, sau đó lắp lại base chính xác và tiếp tục quá trình tái bản DNA.

Phusion là một trong những polymerase ổn định nhiệt chính xác nhất hiện có, với tỷ lệ lỗi thấp hơn 50 lần so với Taq DNA polymerase và thấp hơn 6 lần so với Pyrococcus furiosus DNA polymerase.

Mỗi phản ứng PCR bao gồm 25 μL, sử dụng máy GeneAmp* PCR System

Phản ứng PCR bao gồm các thành phần chính như 5x buffer, dNTP 2 mM, Phusion DNA polymerase, mồi xuôi, mồi ngược, DDW và DNA Quy trình nhiệt cho phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 98 ºC trong 30 giây, sau đó trải qua 35 chu kỳ với các bước: 98 ºC trong 10 giây, T ºC trong 30 giây, và 72 ºC trong 30 giây Cuối cùng, sản phẩm được giữ ở 72 ºC trong 10 phút và bảo quản ở 4 ºC.

Kiểm tra sản phẩm PCR: Đánh giá chất lượng bằng cách điện di sản phẩm

PCR trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE 1X, sử dụng thang chuẩn GeneRuler

100 bp DNA để xác định kích thước sản phẩm và chụp bằng máy soi Gel

2.4.3 Tinh sạch và giải trình tự Để thu được kết quả giải trỡnh tự chỳng tụi tiến hành thu 20 àL sản phẩm PCR gửi đi hãng First Base (Malaysia) để tinh sạch và giải trình tự Kết quả giải trình tự được hiển thị bằng phần mềm BioEdit version 7.2.6.1, qua đó xác định được trình tự gen của từng mẫu nghiên cứu Mỗi loại nucleotide được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ), qua đó có thể xác định được trình tự nucleotide

2.4.4 Xử lý số liệu và phân tích kết quả

Sau khi thu thập trình tự gen từ các mẫu, chúng tôi sử dụng phần mềm Sequencher 5.4.6 để chỉnh sửa và loại bỏ các đoạn nhiễu Các trình tự này sau đó được so sánh với dữ liệu trong ngân hàng Genbank qua chương trình BLAST để đánh giá sự tương đồng Kết hợp các mẫu thu được với trình tự có sẵn, chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit version 7.2.6.1 để thực hiện so sánh Tiếp theo, cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng các phương pháp như Maximum likelihood và UPGMA thông qua phần mềm MEGA version X với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại Cuối cùng, dựa trên kết quả từ cây phát sinh, chúng tôi tiến hành định danh nguồn gen Dây thường xuân dựa vào các phân nhánh với trình tự tham chiếu đã chọn.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tách chiết DNA tổng số

Tổng số DNA của 43/43 mẫu đã được tách chiết thành công bằng Kit GeneJet và được điện di trên gel agarose 1,2% Kết quả cho thấy tất cả các mẫu đều có một băng DNA tổng số với kích thước khoảng 23,1 kb, cho thấy DNA thu được có nồng độ cao, ít đứt gãy và đủ điều kiện cho các thí nghiệm tiếp theo Hình 3.1 minh họa băng điện di DNA tổng số của một số mẫu thực vật.

Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 1,2%

Làn M: Lamda DNA/HindIII marker cho thấy mẫu DNA tổng số thu từ thực vật có ký hiệu tương ứng, với (-) là đối chứng âm Kết quả định lượng và đo độ tinh sạch của DNA từ các mẫu lá khô cho thấy nồng độ DNA trung bình đạt 15,55 ng/μL ± 4,420, trong khi chỉ số hấp thụ quang ở bước sóng 260 và 289 nm có giá trị trung bình là 1,983 ± 0,539 Số liệu chi tiết thống kê được trình bày rõ ràng.

Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu

STT Ký hiệu mẫu Nồng độ trung bỡnh (ng/àL) OD 260/280 trung bỡnh

Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen matK bằng kỹ thuật PCR 27 1 Tối ưu quy trình PCR

3.2.1 Tối ưu quy trình PCR

Chúng tôi tối ưu hóa các yếu tố trong phản ứng nhân dòng đoạn gen matK, bao gồm nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA và nồng độ mồi, nhằm đảm bảo quy trình nhân dòng gen đạt độ đặc hiệu và ổn định cao.

Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Trong phản ứng PCR, nhiệt độ gắn mồi đóng vai trò quyết định đến hiệu suất của quá trình này Chúng tôi đã tối ưu hóa nhiệt độ trong dải từ 43,9 đến 62,1 độ C, bao gồm 9 mức nhiệt khác nhau Hai mẫu đối chứng được thực hiện: mẫu đối chứng âm (DDW) không có DNA để kiểm soát nhiễm chéo và mẫu đối chứng dương là DNA chiết xuất từ lá Dây thường xuân, dùng để nhân đoạn gen GBSSI với cặp mồi 10F/11R Mẫu đối chứng dương giúp xác định độ ổn định của các thành phần phản ứng, đảm bảo khả năng PCR thành công Sau khi tối ưu hóa nhiệt độ, sản phẩm PCR thành công sẽ được sử dụng làm đối chứng cho các phản ứng sau.

Kết quả điện di sản phẩm tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho gen matK cho thấy dải nhiệt độ từ 43,9 – 60,1 o C tạo ra băng đặc hiệu Trong đó, nhiệt độ từ 49,8 – 57,7 o C cho băng sáng rõ, đặc biệt băng ở 55,1 o C Do đó, nhiệt độ gắn mồi được chọn là 55,1 o C.

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen matK

Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Kí hiệu trên các làn: nhiệt độ gắn mồi ( o C); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương

Kết quả tối ưu nồng độ DNA cho phản ứng với gen matK được xác định trong khoảng 1,25 đến 40 ng/µL Điện di sản phẩm PCR cho thấy băng đặc hiệu xuất hiện tại nồng độ DNA từ 1,25 - 40 ng/µL, trong khi băng sỏng rừ từ 2,5 đến 40 ng/µL Tuy nhiên, nồng độ DNA khuụn tối ưu nhất được xác định là từ 2,5 đến 10 ng/µL (Hình 3.3).

Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA phản ứng nhân dòng gen matK

Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Ký hiệu trên các làn: nồng độ DNA (ng/ àL); Làn (-): Đối chứng õm; Làn (+): Đối chứng dương

Để tối ưu hóa nồng độ mồi và tăng độ lặp lại cho phản ứng, tôi đã tiến hành thử nghiệm trên 03 lô mẫu khác nhau với các nồng độ 0,1; 0,3 và 0,9 àM Kết quả điện di trên gel agarose 1,5% cho thấy tất cả các nồng độ đều tạo ra các băng đặc hiệu Trong số 03 lô mẫu, nồng độ 0,3 àM đã cho phản ứng PCR có hiệu suất cao nhất đối với gen matK (Hình 3.4)

Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi phản ứng nhân dòng gen matK

Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Ký hiệu các làn: nồng độ mồi

Điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR nhằm nhân dòng đoạn gen matK được xác định là gắn mồi ở nhiệt độ 51,1 ºC, với nồng độ DNA từ 2,5 đến 10 ng/µL và nồng độ mồi là 0,3 µM Các mẫu đối chứng âm và dương được sử dụng để đảm bảo tính chính xác của phản ứng.

3.2.2 Kết quả nhân dòng gen matK từ các mẫu thực vật

Chúng tôi tiến hành PCR với điều kiện phản ứng được trình bày chi tiết trong

Bảng 3.2, với 43 mẫu DNA tổng số đã nhân dòng thành công

Bảng 3.2 Các thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen matK

Thành phần Nồng độ hoạt động

5x buffer 1x 5,0 *Biến tính ban đầu: 98 ºC trong

- Biến tính: 98 ºC trong 10 giây

- Gắn mồi: 55,1 ºC trong 30 giây

- Kéo dài chuỗi: 72 ºC trong 30 giây

* Tổng hợp cuối: 72 ºC trong 10 phút

*Giữ sản phẩm ở 4 ºC dNTP 2 mM 0,2 mM 2,5

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, cho thấy 43/43 mẫu nghiên cứu đều cho kết quả đặc hiệu và rõ nét với kích thước khoảng 950 bp so với thang chuẩn Gene Ruler 100 bp Sản phẩm này đáp ứng đầy đủ điều kiện để tiến hành giải trình tự.

Hình 3.5 Kết quả PCR nhân dòng đoạn gen matK

Làn M: Thang chuẩn Gene Ruler 100 bp; Ký hiệu trên các làn: ký hiệu các mẫu phân tích; Làn (-): Đối chứng âm; Làn (+): Đối chứng dương

Giải trình tự

Sản phẩm PCR sau khi giải trình tự bởi hãng First Base (Malaysia) được đọc thông qua phần mềm BioEdit ver 7.2.6.1 ( Hình 3.6 )

Tất cả 43 mẫu đã được giải trình tự vùng gen matK Chúng tôi quan sát thấy chiều dài đoạn gen matK của các mẫu đạt khoảng 920 bp khi chưa xử lý đoạn nhiễu.

Kết quả này tương đối đồng đều giữa các mẫu và với kết quả điện di

Hình 3.6 Kết quả hiển thị giải trình tự của mẫu đại diện H4 của gen matK qua phần mềm BioEdit

Độ tương đồng của trình tự gen matK được khuếch đại

Từ kết quả chạy chương trình BLAST, chúng tôi tiến hành chọn các trình tự

H nepalensis và H helix làm nhóm nội và trình tự Tetrapanax papyrifer làm nhóm ngoại, thông tin chi tiết được trình bày trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Các trình tự tham chiếu lấy từ Genbank sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên loài Mã số Genbank

1 Hedera nepalensis var sinensis GQ434260.1 [27]

Chúng tôi đã phân loại các mẫu dựa trên dữ liệu so sánh từ chương trình BLAST (Bảng 3.4) Các mẫu có 100% nucleotide giống nhau được nhóm lại để tối ưu hóa cây phát sinh chủng loại.

Bảng 3.4 Phân nhóm các mẫu trong nghiên cứu

STT Haplotype Số lượng mẫu Mẫu

Phản ứng nhân đoạn gen matK với cặp mồi 390F/1326R cho ra trình tự dài khoảng 920 bp, nằm hoàn toàn trong gen matK có tổng chiều dài khoảng 1500 bp Haplotype N1 có trình tự tương đồng 100% với trình tự đã được xác định.

GQ434260.1 H nepalensis var sinensis Haplotype N2 có trình tự tương đồng

Haplotype N3 của H nepalensis var sinensis có trình tự GQ434260.1 với độ tương đồng 99,88% và hoàn toàn giống với trình tự AJ319073.1 của H helix Bảng 3.5 trình bày khoảng cách di truyền và số lượng nucleotide khác biệt giữa ba nhóm mẫu và các trình tự tham chiếu.

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía trên bên phải) giữa 03 haplotype với 03 trình tự tham chiếu

Hình 3.7 So sánh trình tự đoạn gen matK của các haplotype nghiên cứu với các trình tự tham chiếu

Theo bảng khoảng cách di truyền, haplotype N1 có trình tự nucleotide hoàn toàn giống với H nepalensis var sinensis (GQ434260.1) trên Genbank, chỉ khác haplotype N2 1 nucleotide tại vị trí 782 Haplotype N3 giống hoàn toàn với H helix (AJ319073.1) và khác haplotype N1 2 nucleotide tại vị trí 606 và 782 Haplotype N2 khác N3 1 nucleotide ở vị trí 606, với tổng số nucleotide trong trình tự là 792 Sự khác biệt về nucleotide và vị trí sai khác được thể hiện rõ ràng.

Cây phát sinh chủng loại dựa trên vùng gen matK

Trước khi xây dựng cây phát sinh chủng loại cho matK, mô hình tiến hóa đã được tính toán bằng phần mềm MEGA X Mô hình tối ưu được xác định là mô hình 3 tham số Tamura (T92) với phân phối Gamma, cho thấy đây là lựa chọn phù hợp nhất.

Mô hình tiến hóa tốt nhất được xác định với BIC = 2456,978 và AICc = 2385,904, cho thấy điểm BIC thấp nhất Phân tích bootstrap được thực hiện với 1000 lần lấy lại mẫu, với R = 0,91 thể hiện độ lệch đồng hoán/dị hoán, trong khi lnL đạt giá trị tối đa là 1181,924.

Mức độ tin cậy được đánh giá theo giá trị bootstrap như sau: mức độ tin cậy cao:

>85%; mức độ tin cậy trung bình: 65-85%; mức độ tin cậy thấp: 65%) Đặc biệt, haplotype N2 có mối quan hệ gần gũi với N1 và H nepalensis, nhưng chỉ số bootstrap của nó chỉ đạt 28%.

Chúng tôi đã tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại cho 3 haplotype trong nghiên cứu, sử dụng trình tự các loài thuộc chi Hedera đã được công bố.

Genbank Cây phân loài được xây dựng theo phương pháp UPGMA để xác định mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các loài Hedera

Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp UPGMA của

03 haplotype với trình tự các loài Hedera dựa trên chỉ thị matK

Lịch sử tiến hóa đã được suy luận thông qua phương pháp UPGMA, với cây tối ưu có tổng chiều dài nhánh là 0,02826992 Tỷ lệ phần trăm của các cây sao chép cho thấy sự liên kết của các đơn vị phân loại trong thử nghiệm bootstrap.

Khoảng cách tiến hóa được tính toán bằng phương pháp Khả năng tổng hợp tối đa, dựa trên 1000 lần lặp lại bên cạnh các nhánh, và được đo bằng số lượng thay thế trên mỗi vị trí Phân tích này sử dụng 9 trình tự nucleotide, bao gồm các vị trí mã hóa 1, 2, 3 và không mã hóa, trong đó tất cả các vị trí không rõ ràng đã bị loại bỏ cho từng cặp trình tự Dữ liệu cuối cùng bao gồm tổng cộng 709 nucleotide, và các phân tích tiến hóa được thực hiện trong MEGA phiên bản X.

According to Figure 3.10, the tree splits into two major branches within the Hedera genus The first branch includes H nepalensis, H rhombea, N1, H azorica, H algeriensis, and N2, while the second branch consists of N2 and H helix, with a bootstrap value of 64% The first branch further divides into two sub-branches: the first sub-branch contains H nepalensis, H rhombea, and N1, with a bootstrap value of 65%, indicating moderate reliability; the second sub-branch includes H azorica and H algeriensis, which have a high reliability bootstrap value of 100%, along with N2, which has a bootstrap value of 40%.

BÀN LUẬN

Kết quả xây dựng quy trình phân tích đoạn gen matK

4.1.1 Tách chiết DNA tổng số

Tất cả 43 mẫu được tách DNA thành công bằng quy trình Kit Gene Jet, cho băng điện di sáng rõ và không bị đứt đoạn Việc sử dụng Kit Gene Jet trong tách chiết DNA tổng số mang lại nhiều lợi ích, bao gồm khả năng tách chiết chỉ từ một lượng nhỏ mẫu lá (dưới 20 mg) và đảm bảo hiệu suất cao trong phản ứng PCR với 43/43 mẫu đều thành công Điều này nhờ vào độ tinh sạch của DNA đã được loại bỏ các hợp chất gây ức chế như protein, tanin, polysaccharide và RNA Hơn nữa, quy trình này tiết kiệm thời gian hơn so với các phương pháp tách chiết thủ công, thường mất đến 2 ngày, và giảm thiểu nguy cơ nhiễm chéo khi để tủa DNA khô Cuối cùng, Kit Gene Jet cung cấp sự an toàn và tiện lợi hơn cho người thực hiện thí nghiệm, tránh tiếp xúc với các hóa chất độc hại như chloroform và β-mercaptoethanol.

Việc tách DNA bằng kit GeneJet có một số hạn chế, bao gồm nồng độ DNA thấp (trung bình 15,50 ng/µL) và OD của một số mẫu vượt ngoài khoảng 1,8 - 2,2 Dù vậy, các mẫu này vẫn cho kết quả nhân dòng gen matK 100%, với băng điện di sáng rõ và đặc hiệu, đủ điều kiện cho các phân tích gen tiếp theo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit của Thermo Scientific là một giải pháp hiệu quả để tách chiết DNA từ mẫu lá khô Dây thường xuân cho phân tích với chỉ thị matK Theo khuyến cáo từ các nghiên cứu, việc tách DNA từ mẫu mô tươi và non sẽ cho độ tinh khiết cao hơn, vì mẫu mô trưởng thành thường chứa nhiều polysaccharide, polyphenol và các chất chuyển hóa thứ cấp khác.

4.1.2 Khuếch đại đoạn gen matK

Tối ưu phản ứng PCR là bước quan trọng đầu tiên để đạt hiệu suất nhân dòng gen cao nhất, giúp chuẩn hóa điều kiện phản ứng và tiết kiệm thời gian thí nghiệm Ba yếu tố cần tối ưu là nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA khuôn và nồng độ mồi Đối với gen matK, Cuénoud và cộng sự đã chọn nhiệt độ gắn mồi 48 ºC cho cặp mồi 390F/1326R khi phân tích mẫu thuộc bộ Caryophyllales Sự khác biệt về nhiệt độ gắn mồi giữa các nghiên cứu có thể do sự khác nhau về DNA polymerase và thiết bị sử dụng Do đó, tối ưu nhiệt độ gắn mồi là cần thiết để đảm bảo quy trình PCR ổn định, vì đây là yếu tố quyết định sự thành công trong việc bắt cặp giữa mồi và DNA Đối với mẫu thực vật, nồng độ DNA khuôn cao có thể ức chế phản ứng nhân dòng do tạp chất còn tồn tại cùng DNA khuôn.

Qua quá trình thực nghiệm, chúng tôi ghi nhận rằng việc nhân dòng gen matK đạt hiệu suất cao với tỷ lệ khuếch đại thành công là 100% Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các băng DNA rõ nét và đồng đều về kích thước, không có băng phụ, chứng tỏ phản ứng nhân dòng là đặc hiệu Điều này có thể do mức độ đa hình giữa các loài trong đoạn trình tự không cao, cho phép khuếch đại với một cặp mồi đặc hiệu Tuy nhiên, một số mẫu cần thực hiện PCR nhiều lần (2-3 lần) do ảnh hưởng của các chất chuyển hóa trong mẫu DNA tổng số và kỹ thuật thực hiện.

Cặp mồi 390F/1326R đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu trước đây và được khuyến nghị làm mã vạch cho việc phân loại thực vật Nghiên cứu của Lei và cộng sự (2014) đã áp dụng cặp mồi này trên 27 loài thực vật có độc.

Tại Trung Quốc, 22 chi và 17 họ đã được xác định hiệu quả cao trong việc phân loại loài nhờ vào cặp mồi đặc biệt Sun và các cộng sự đã thành công trong việc nhân lên đoạn gen matK dài 907 bp, giúp phân biệt chi Helleborus với các chi khác Năm 2002, Cuénoud đã sử dụng cặp mồi 390F/1326R để khuếch đại khoảng 930 bp trình tự matK, phục vụ cho việc phân loại trong bộ Caryophyllales.

390F/1326R của các nghiên cứu trên khá tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi

4.1.3 Giải trình tự và so sánh độ tương đồng

Tất cả 43 mẫu đã được giải trình tự thành công đoạn gen matK, tuy nhiên một số mẫu gặp phải vấn đề nhiễu và cần thực hiện lại phản ứng PCR Phần lớn sản phẩm PCR được giải trình tự theo chiều mồi xuôi (390F), nhưng một số mẫu phải sử dụng chiều mồi ngược (1326R) do kết quả bị nhiễu Nguyên nhân có thể do độ dài lớn của gen matK và sự biến thiên cao trong một số đoạn trình tự, dẫn đến nhầm lẫn trong quá trình bắt cặp và gắn thêm base nitơ Tất cả các mẫu đều được đối chiếu với trình tự trên Genbank để tìm loài tương đồng và đảm bảo rằng đoạn gen được nhân lên đúng vùng quan tâm Cụ thể, haplotype N1 có trình tự tương đồng 100% với GQ434260.1 H nepalensis var sinensis, trong khi haplotype N2 có trình tự tương đồng 99,88% với cùng trình tự này.

Trình tự AJ319073.1 của H helix cho thấy rằng ba mẫu H3, H48 và H52 thu thập tại Việt Nam hoàn toàn giống với trình tự đối chứng HH từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc Các trình tự này được khuếch đại bằng cặp mồi 390F/1326R với độ dài khoảng 920 bp, thuộc vùng gen matK Kết quả giải trình tự, sau khi so sánh độ tương đồng qua chương trình BLAST, đủ điều kiện để sử dụng làm dữ liệu cho việc xây dựng cây phát sinh loài, nhằm phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân ở miền Bắc Việt Nam.

Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân sử dụng mã vạch matK

Bảng khoảng cách di truyền cho thấy mối quan hệ tiến hóa giữa các haplotype của trình tự gen matK của H nepalensis và các loài khác Nhóm N1 không có vị trí sai khác so với H nepalensis đối chứng, trong khi nhóm N2 có 01 vị trí sai khác Nhóm N3 không khác biệt với H helix đối chứng Nhóm N1 và N3 khác nhau ở 2 vị trí, trong đó nhóm N2 khác với nhóm N1 và N3 ở 1 vị trí mỗi nhóm Đột biến ở vị trí 606 là dị hoán và ở vị trí 782 là đồng hoán, cho thấy xu hướng nghiêng về đột biến đồng hoán trong các đột biến thay thế base.

Tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu phát sinh loài là 2 đồng hoán : 1 dị hoán, cho thấy đột biến dị hoán có trọng số cao hơn Các đột biến này đã tạo ra 3 haplotype trong chi Hedera tại Việt Nam Đoạn gen matK dài 792 nucleotide, với 790 nucleotide bảo tồn, cho thấy tỷ lệ đột biến chỉ 0,25% Tuy nhiên, từ bảng khoảng cách di truyền và cây phát sinh chủng loại, hai vị trí đa hình mang lại thông tin quan trọng cho việc phân loại loài.

Haplotype N2 chỉ tồn tại ở Lào Cai và Lào Cai là tỉnh duy nhất xuất hiện cả

Lào Cai là địa phương có điều kiện môi trường và địa lý thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của hai haplotype Dây thường xuân (N2) và Thường xuân (N3) Chỉ thị matK đóng vai trò quan trọng trong việc phân biệt haplotype N2 với các haplotype khác, đồng thời hỗ trợ định danh haplotype này tại Lào Cai Haplotype N3 bao gồm bốn mẫu: H3, HH, H48, và H52.

Ba mẫu H3, H48, H52 thuộc loài H helix được thu thập tại Việt Nam đều là các mẫu nhập trồng và đã hoang dại hóa, không phải loài bản địa, theo điều tra của Viện Dược liệu Mẫu N3 chỉ xuất hiện tại Sa Pa (Lào Cai) và Đà Lạt (Lâm Đồng), cho thấy hai địa phương này có điều kiện khí hậu và địa lý thuận lợi cho sự sinh trưởng của H helix Do đó, nếu muốn trồng Thường xuân để bảo tồn giống và làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc, nên xem xét hai vùng này Haplotype N1 là phổ biến nhất với 32/43 mẫu, chủ yếu ở ba tỉnh miền núi phía Bắc: Lai Châu, Hà Giang, Lạng Sơn N1 thuộc loài H nepalensis var.sinensis và các mẫu này sống trong môi trường tự nhiên, chứng minh rằng H nepalensis dễ sinh trưởng và phát triển tại các tỉnh miền núi phía Bắc.

4.2.2 Phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân ở miền Bắc Việt Nam

Chúng tôi đã chọn hai phương pháp UPGMA và Maximum Likelihood để xây dựng cây phát sinh loài UPGMA hoạt động dựa trên nguyên lý xây dựng ma trận khoảng cách không có trọng số, so sánh sự tương đồng giữa các trình tự Các trình tự được ghép cặp dựa trên mức độ tương đồng, với ưu điểm là cho kết quả nhanh chóng, phù hợp với lượng dữ liệu lớn và cung cấp thông tin về khoảng cách di truyền tương đối giữa các loài Tuy nhiên, phương pháp UPGMA không phản ánh chính xác sự tiến hóa của gen do không xem xét đến các đột biến.

Để khắc phục nhược điểm của phương pháp UPGMA, chúng tôi áp dụng phương pháp Maximum Likelihood (ML), sử dụng tất cả thông tin tiến hóa đã biết, bao gồm các thay thế riêng lẻ trong chuỗi Phương pháp này đánh giá và cho điểm tất cả các cây có thể dựa trên số lượng thay đổi tiến hóa cần thiết để tạo ra sự thay đổi trình tự quan sát ML tính toán khả năng cho mỗi cây và xác định cây tiến hóa có xác suất xảy ra cao nhất, do đó cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn so với các phương pháp khác Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm chứng lại các cây phân loài đã được xây dựng từ các phương pháp khác, nhưng nhược điểm là tốc độ xử lý thông tin chậm và không khả thi khi phân tích lượng dữ liệu lớn.

Cả hai cây phân loại sử dụng phương pháp UPGMA và Maximum Likelihood cho thấy sự đồng thuận trong việc phân nhánh các mẫu, chứng tỏ tính tin cậy của các nhánh Chỉ thị matK có khả năng phân biệt các loài khác chi trong họ Araliaceae, với T papyrifer (GQ434267.1) được sử dụng làm nhóm ngoại trong nghiên cứu này Kết quả cho thấy T papyrifer tách nhánh rõ rệt, trở thành một nhánh riêng biệt so với các loài thuộc chi Hedera Điều này khẳng định matK là một mã vạch phân tử hiệu quả để phân biệt và xác định các loài khác chi, khác họ, phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây.

Nhóm N3, bao gồm 4 mẫu H helix (H3, HH, H48, H52), cho giá trị bootstrap lớn hơn 65% ở cả hai cây phân loài, thể hiện sự ủng hộ cao Nhóm N1 với 32 mẫu có mối quan hệ chặt chẽ với H nepalensis var sinensis đạt mức độ tin cậy trung bình trong cây Maximum Likelihood Trong khi đó, 7 mẫu nhóm N2 có quan hệ gần gũi với N1 và H nepalensis var sinensis nhưng chỉ đạt độ tin cậy thấp Điều này cho thấy khả năng tách nhánh của N2 khỏi N1 và H nepalensis var sinensis là khá thấp Mặc dù các mẫu N2 được phân loại là H nepalensis var sinensis, nhưng các haplotype N2 không hoàn toàn tương đồng với trình tự tham chiếu Sự khác biệt này có thể do biến đổi nucleotide do thay đổi môi trường địa lý và khí hậu Mặc dù chỉ số bootstrap không cao (52% ở cây UPGMA và 28% ở cây Maximum Likelihood), nhưng cây được chọn có khả năng xuất hiện cao nhất trong tất cả các cây có thể tạo thành, cho phép kết luận rằng haplotype N2 thuộc loài H nepalensis Kết quả phân loài của cây chủng loại tương đồng với phân loại dựa trên đặc điểm hình thái (N1, N2: H nepalensis).

Mã vạch matK cho thấy khả năng phân loại giữa H nepalensis var sinensis và H helix Để nâng cao độ tin cậy trong việc xác định các loài Dây thường xuân, chúng tôi khuyến nghị kết hợp matK với các chỉ thị tiến hóa nhanh hơn Việc sử dụng các cặp mồi chồng chéo để khuếch đại toàn bộ gen matK (khoảng 1500 bp) cũng có thể cung cấp thêm thông tin về các vị trí đa hình, hỗ trợ phân biệt các loài trong chi Hedera Trên toàn cầu, nhiều nghiên cứu đã áp dụng matK như một mã vạch phân tử để phân tích mối quan hệ di truyền và địa lý của chi Hedera.

Bảng 4.1 Trình tự các mồi của gen matK được sử dụng trong các nghiên cứu về chi Hedera trên thế giới

Khu vực thu mẫu Trình tự mồi TLTK Địa lý thực vật của cây thường xuân (Hedera sp.) ở châu Âu: phân biệt gen qua không gian và thời gian

K1: GGGTTGCCCGGGATTCGAAC [37] matK1: ATTAGGGCATCCCATTAGTA matK2: CTAGCACAAGAAAGTCGAAG matK3’: GTACTTGCTCATGATCATGG matK4: TGCATGAAAGGATCCTTGAA matK5: ATATTTATGCACTTGCTCAT matK5b: AAAGGAAATATTGAATGAAT matK6b: GGATTTCTAACCATCTTGTT matK6: CCATGATCATGAGCAAGTGC K2: CAACGGTAGAGTACTCGGCTTTTA

Phân tích phát sinh gen và địa sinh học của các loài thường xuân

Từ Hiệp hội Ivy Hoa Kỳ và Bắc

Mỹ matK5: TGTCATAACCTG CATTTTCC [36, 84] matK6: TGGGTTGCTAACTCAATGG

Năm 2002, Grivet D và R J Petit đã sử dụng 5 cặp mồi chồng chéo (K1/matK1, matK2/matK3’, matK4/matK5, matK5b/matK6b và matK6/K2) (Bảng

Để nhân dòng đoạn gen trnK (chứa matK) từ 27 quần thể của 4 loài H maroccana, H maderensis ssp Iberica, H hibernica, và H helix ssp helix, nghiên cứu đã chỉ ra rằng vùng intron trnK có 5 vị trí đa hình trên tổng số 2474 base Những vị trí này đều nằm trong exon matK, cho phép phân biệt giữa các haplotype G từ Tây Ban Nha (G1) và từ Balkans.

Nghiên cứu cho thấy năm vị trí đa hình đã xác định được sáu haplotype (AJ319066, AJ319068, AJ319059, AJ319070, AJ319072, AJ319074) giữa haplotype I từ Morocco (I1) và từ Balkans (I2) Mã vạch matK cũng đã giúp phân biệt haplotype N2 ở Lào Cai với hai haplotype còn lại, chứng minh khả năng xác định và phân biệt các haplotype của chỉ thị matK.

Năm 2011, Green và cộng sự đã nghiên cứu 27 mẫu thuộc 13 loài được công nhận trong chi Hedera và 5 loài khác làm nhóm ngoại, sử dụng vùng không mã hóa của gen matK và các vùng không mã hóa khác trong gen lục lạp để phân loại Nghiên cứu phát hiện 33 vị trí đa hình từ 12 vùng không mã hóa, trong đó có một vị trí ở gen matK Cây phân loại cho thấy sự khác biệt chủ yếu ở nhóm ngoài, với Fatsia và Trevesia là nhóm chị em của Hedera Các loài trong chi Hedera được chia thành hai nhánh: nhánh nhỏ hơn gồm các loài từ lưu vực phía tây Địa Trung Hải như H maroccana, H canariensis và H helix subsp Rhizomatifera McAllister, trong khi nhánh lớn hơn chứa các loài từ lưu vực trung tâm và phía đông Địa Trung Hải như H algeriensis.

H cypria, H helix subsp Caucasigena Kleop), miền bắc và trung tâm châu Âu (H.helix subsp helix, H hibernica), Macaronesia (H azorica, H maderensis K

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc kết hợp vùng không mã hóa của gen matK với 11 vùng không mã hóa khác trong gen lục lạp có thể phân loại các loài ở các vùng địa lý khác nhau Mặc dù gen matK có khả năng phân loại H nepalensis và H helix, nhưng vẫn chưa phân loại được một số loài trong chi Hedera như H rhombea Do đó, cần thiết phải kết hợp gen matK với các mã vạch DNA khác để nâng cao khả năng phân biệt loài ở các khu vực địa lý khác nhau.

Trong một nghiên cứu tại Trung Quốc, Sui Xue-yi và cộng sự (2011) đã sử dụng gen matK để phân loại 13 mẫu, bao gồm H nepalensis var sinensis và 12 loài khác, bằng cách áp dụng cặp mồi KIM 3F/KIM 1R Kết quả nghiên cứu đã cung cấp thông tin quan trọng về sự phân loại của các loài này.

Trong nghiên cứu, 11/13 mẫu PCR đã thành công, cho thấy cây phân loại dựa trên sự kết hợp giữa rbcL và matK có khả năng phân biệt H nepalensis var sinensis với các loài như Euonymus fortunei, Euonymus fortune, Sinomenium acutum, Cocculus trilobus và 6 loài thuộc chi Sabia.