Khóa luận xây dựng quy trình phân tích một số đa hình gen n acetyltransferase 2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid ở người bệnh lao

T Ổ NG QUAN TÀI LI Ệ U

T ổ ng quan v ề enzym N-Acetyltransferase 2 (NAT2)

Hiệu lực của thuốc và các chất ngoại lai phụ thuộc vào cơ chế dược lực học và dược động học Sự acetyl hóa bởi enzym N-Acetyltransferase (NAT) đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa và thải trừ thuốc, giúp cơ thể tránh phản ứng quá khích với thuốc và chất độc NAT chuyển đổi nhiều loại thuốc và hóa chất thành các chất không độc, bao gồm cả những chất có khả năng gây ung thư, từ đó loại bỏ chúng khỏi cơ thể Enzym NAT xúc tác phản ứng acetyl hóa, chuyển đổi chất độc thành chất ít độc hơn hoặc không độc.

NAT xúc tác phản ứng gồm N-Acetyl hóa, O-Acetyl hóa và N,O-Acetyl hóa, trong đó

N-acetyl hóa (Hình 1.1) được chỉ ra là con đường hiệu quả nhất thực hiện biến đổi sinh học các hợp chất amin thơm, hydralazin và một số chất gây ung thư [14] NAT ở người bao gồm 2 loại là N-Acetyltransferase 1 (NAT1) và N-Acetyltransferase 2

(NAT2) Enzym NAT1 có vai trò trong sự chuyển hóa các hợp chất folat, trong khi đó

NAT2 có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa các hợp chất amin thơm và dị vòng, bao gồm isoniazid (thuốc chống lao), hydralazin và endralazin (thuốc điều trị tăng huyết áp), procainamid (thuốc điều trị loạn nhịp tim), aminoglutethimid (chất ức chế tổng hợp hormon tuyến thượng thận), nitrazepam (thuốc an thần) và dapson (thuốc điều trị bệnh phong).

NAT2 chủ yếu tập trung ở gan, với một phần nhỏ ở ruột non và đại tràng, trong khi NAT1 có mặt ở hầu hết các mô trong cơ thể Các gen mã hóa cho cả hai protein này đều nằm trên nhánh ngắn (vùng 22) của nhiễm sắc thể số 8 và có khung đọc mở dài 870 bp.

Các biến thể di truyền trên gen NAT1 và NAT2 ảnh hưởng đến kiểu hình acetyl hóa của mỗi cá thể, từ đó tác động đến đáp ứng với thuốc và nguy cơ mắc bệnh ung thư Trình tự nucleotid trên gen NAT2 phân chia cá thể thành ba nhóm acetyl hóa: nhanh, trung bình và chậm Mối liên hệ giữa kiểu hình acetyl hóa do NAT2 quyết định và nguy cơ mắc các bệnh đã được nghiên cứu và báo cáo từ nhiều năm trước, bắt đầu từ những năm 1960 với sự phát hiện các đa hình.

NAT2 đã được nghiên cứu liên quan đến chuyển hóa isoniazid, và các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng NAT2 còn liên quan đến nhiều loại thuốc khác Điều này càng khẳng định tầm quan trọng của NAT trong cơ chế giải độc của cơ thể.

@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Hình 1 1 Một số phản ứng chuyển hóa được xúc tác bởi NAT2 [14]

Bảng 1 1 Ảnh hưởng của kiểu hình acetyl hóa tới chuyển hóa một số thuốc [24]

Tên thuốc Kiểu hình acetyl hóa Ảnh hưởng

Dapson Chậm Gây độc hệ thần kinh

Sulphamethoxazol Chậm Tăng mẫn cảm

Liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống Giảm hiệu quả điều trị

Isoniazid Chậm Ảnh hưởng đến phenytoin và rifampicin

Ctrimoxazol Chậm Tăng các phản ứng không mong muốn

Sulphasalazin Chậm Gây độc với gan, gây buồn nôn, nôn

Procainamid Chậm Liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống

Phenelzin Nhanh Giảm đáp ứng điều trị p- Phenylenediamin Chậm Gây viêm da tiếp xúc

Sự tiếp xúc với các chất độc hại từ thực phẩm và môi trường, như khói thuốc lá và hóa chất chứa benzen, làm tăng nguy cơ mắc bệnh, đặc biệt là ung thư Kiểu hình acetyl hóa có thể ảnh hưởng đến nguy cơ ung thư ở những người có phơi nhiễm, với sự khác biệt giữa các kiểu hình.

Tại Trường Y Dược, ĐHQG, nghiên cứu về acetyl hóa nhanh và chậm đã chỉ ra mối liên hệ với một số bệnh lý như ung thư bàng quang, ung thư đại tràng, ung thư vú, lupus ban đỏ hệ thống, Parkinson và Alzheimer Đặc biệt, tính đa hình di truyền của enzyme NAT2 lần đầu tiên được phát hiện ở bệnh nhân lao đang điều trị bằng isoniazid.

Nghiên cứu đã chỉ ra mối liên hệ giữa kiểu hình acetyl hóa và chuyển hóa isoniazid, từ đó giúp xây dựng các phác đồ điều trị phù hợp cho từng kiểu hình, nhằm giảm thiểu tác động tiêu cực của isoniazid đối với sức khỏe.

T ổ ng quan v ề gen N-Acetyltransferase 2

1.2.1 V ị trí, c ấ u trúc và vai trò c ủ a gen NAT2

The NAT2 gene, located on the short arm of chromosome 8 (8p22), encodes the enzyme arylamine N-acetyltransferase 2 This gene comprises two exons, with the first exon being non-coding and measuring 100 base pairs, situated 8 kilobases upstream of the transcription start site, while the second exon is responsible for coding the protein.

(mã hóa protein) là một khung đọc mở dài 870 bp như mô tả ở Hình 1.2 [54]

Hình 1 2 Cấu trúc và vị trí gen NAT2 trên nhiễm sắc thể số 8[16]

Việc xác định các đa hình của gen NAT2 rất quan trọng trong dược lý học, đặc biệt là trong việc hiểu rõ cách thức chuyển hóa thuốc, với isoniazid là một ví dụ điển hình Enzym NAT2 đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa thuốc này, do đó, những biến đổi bất thường trên gen NAT2 có thể ảnh hưởng đáng kể đến khả năng đáp ứng thuốc của cá nhân, dẫn đến tác dụng không mong muốn và làm gia tăng tỷ lệ mắc một số bệnh khi tiếp xúc với các yếu tố phơi nhiễm.

Dự án giải trình tự hệ gen người hoàn thành vào năm 2004 đã chỉ ra rằng DNA của hơn 7,5 tỷ người khác biệt chủ yếu do đa hình thay thế đơn nucleotit (SNP), một loại đột biến điểm có thể ảnh hưởng đến axit amin SNP rất quan trọng vì là biến dị di truyền phổ biến và ổn định, ảnh hưởng lớn đến phản ứng của mỗi người đối với bệnh tật và các yếu tố môi trường.

Sự tiến bộ trong nghiên cứu di truyền học và dược lý học đã chỉ ra rằng sự khác biệt trong đáp ứng thuốc và yếu tố môi trường như độc tố phụ thuộc vào di truyền SNP đóng vai trò quan trọng trong việc giải thích sự biến đổi hoạt động của enzym, ảnh hưởng đến khả năng thanh thải thuốc và đáp ứng điều trị Mặc dù tác động của từng SNP là yếu, nhưng sự kết hợp của chúng có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh Kỹ thuật sinh học phân tử hiện nay cho phép xác định nhanh kiểu gen, từ đó dự đoán hiệu quả đáp ứng thuốc của từng cá nhân Đặc biệt, đa hình NAT2 đã mở ra hướng nghiên cứu mới trong dược lý học, liên quan đến hiệu quả lâm sàng của thuốc chống lao isoniazid Nghiên cứu đã xác định ba kiểu hình acetyl hóa và alen kiểu dại NAT2*4, giúp hiểu rõ hơn về các biến thể di truyền và tác động của chúng đến khả năng chuyển hóa thuốc.

Tại Trường Đại học Y Dược, VNU, các nhà nghiên cứu đã phát hiện tổng cộng 108 halotype, trong đó nhiều halotype được chứng minh có ảnh hưởng đến kiểu hình acetyl hóa Một ví dụ tiêu biểu là alen NAT2*5, được xác định bởi sự thay thế axit amin isoleucin thành threonin tại vị trí c.341T>C Halotype NAT2*5A được xác định khi có hai vị trí thay thế axit amin là c.341T>C và c.481C>T Ngoài alen kiểu dại NAT2*4, còn có các halotype khác như NAT2*12A-C, *13A, *18 liên quan đến kiểu hình acetyl hóa nhanh, và các halotype NAT2*5A-J, *6A-E, *7, *12D, *14A-G, *17, *19 liên quan đến kiểu hình acetyl hóa chậm.

Bảng 1 2 Một số SNP phổ biến ở gen NAT2 [31, 38, 56]

Alen Mã tra cứu Vị trí Axit amin thay thế

Kiểu hình acetyl hóa Ảnh hưởng chức năng

NAT2*5 rs1801280 341T>C Ile114Thr Chậm Giảm hoạt tính

NAT2*6 rs1799930 590G>A Arg197Gln Chậm Giảm độ bền NAT2

NAT2*7 rs1799931 857G>A Gly286Glu Chậm Giảm hoạt tính

NAT2*11 rs1799929 481C>T Leu161Leu Nhanh Không gây biến đổi

NAT2*12 rs1208 803A>G Arg268Lys Nhanh Không gây biến đổi

NAT2*13 rs1041983 282C>T Tyr94Tyr Nhanh Không gây biến đổi

Các đa hình gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm chủ yếu liên quan đến ba alen NAT2*5, *6, và *7, được nghiên cứu nhiều nhất do tỷ lệ đột biến cao ở ba vị trí này Sự ảnh hưởng của ba SNP này cũng rõ ràng hơn so với các vị trí khác.

Nghiên cứu cho thấy rằng 6 alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu, đặc biệt là khi áp dụng phương pháp giải trình tự (Bảng 1.2) [5, 41] Đối với kiểu hình dựa trên 3 SNP, các nhóm cá thể có kiểu hình acetyl hóa nhanh thường mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại tại cả 3 vị trí SNP (T341C, G590A).

Các cá thể có kiểu hình acetyl hóa trung bình mang kiểu gen dị hợp tử về alen đột biến tại một trong ba vị trí NAT2*5, *6 hoặc *7 Những người acetyl hóa chậm sở hữu ít nhất một alen đột biến trong ba SNP này Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa khác nhau giữa các quốc gia và vùng địa lý Đối với kiểu hình 6 SNP, việc xác định kiểu hình acetyl hóa được coi là chính xác hơn Từ năm 2009, ứng dụng trên web đã được phát triển để hỗ trợ trong việc này.

NAT2PRED, được phát triển bởi tác giả Igor B Kuznetsov, cho phép xác định kiểu hình acetyl hóa dựa trên kiểu gen tại 6 vị trí NAT2 (*5, *6, *7, *11, *12, *13) Bài báo công bố trên trang web NAT2PRED đã chỉ ra sự khác biệt tỷ lệ giữa kiểu hình dựa trên 3 SNP và 6 SNP.

Tại Trường Y Dược, ĐHQG, sự khác biệt này tuy không lớn, nhưng việc xác định kiểu hình dựa trên 6 SNP được ưu tiên hơn.

Một số vị trí đột biến thay thế gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm được biểu thi ở

Hình 1.3 Alen đột biến NAT2*5 (c.341T>C) làm thay thế isoleucin ở vị trí 114 thành threonin gây giảm hoạt tính enzym, tuy nhiên đột biến này không thể xác định bằng

RFLP là một phương pháp thường được sử dụng để phân tích alen c.481C>T, một đột biến câm liên quan đến c.341, và được xem là biến thể đại diện cho NAT2*5 Khi đột biến xảy ra ở vị trí c.481, điều này cũng đồng nghĩa với việc xảy ra đột biến ở NAT2*5 và ngược lại.

Hình 1 3 Ảnh hưởng ở mức độ phân tử của các SNP NAT2 [56] Hình 3D của

NAT2 và các SNP phổ biến như NAT2*5 (Ile114Thr, vị trí số 2), NAT2*6 (Arg197Gln, vị trí số 7), và NAT2*7 (Gly286Glu, vị trí số 10) đóng vai trò quan trọng trong việc xác định kiểu hình acetyl hóa.

Đột biến NAT2*12 (Arg268lys) và các alen NAT2*6 (c.590G>A) cùng NAT2*7 (c.857G>A) ảnh hưởng đến độ bền và hoạt tính của enzym NAT2 Cụ thể, NAT2*6 làm thay thế axit amin Arginin bằng Glycin, dẫn đến giảm độ bền của enzym, trong khi NAT2*7 biến đổi cấu hình tại trung tâm xúc tác, làm giảm hoạt tính enzym Những SNP này gây ra sự thay đổi về hoạt độ, độ ổn định và ái lực của NAT2 với cơ chất, từ đó làm tăng nồng độ các hợp chất có hại trong cơ thể và gây ra các biểu hiện lâm sàng.

Các kiểu hình acetyl hóa nhanh NAT2*11A, NAT2*12A và NAT2*13A không ảnh hưởng đến hoạt tính enzym NAT2, nhưng sự hiện diện của các alen nhanh này có thể liên quan đến sự biến đổi nồng độ của một số chất chuyển hóa thuốc khác.

Các nghiên cứu trước đây về đặc điểm chức năng của đa hình NAT2 đã chỉ ra rằng các cơ chế phân tử khác nhau liên quan đến kiểu hình acetyl hóa chậm đều dẫn đến sự giảm biểu hiện.

@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU hiện protein mRNA và protein NAT2 Đặc biệt là khi có sự hiện diện của NAT2*5B,

Đặc điể m chung v ề b ệ nh lao và vai trò c ủa isoniazid trong điề u tr ị lao

1.3.1 Đặc điểm chung về bệnh lao

Bệnh lao ở người được gây ra bởi vi khuẩn kháng cồn kháng axit, chủ yếu là vi khuẩn lao người (Acid fast bacilli, AFB).

(Mycobacterium tuberculosis hominis) Đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới [2] Thêm vào đó, sự xuất hiện của đại dịch

HIV/AIDS (Human Immuno-deficiency Virus/ Acquired Immuno Deficiency

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người do virus gây ra đã dẫn đến sự bùng phát trở lại của bệnh lao, với mức độ nghiêm trọng gia tăng, đặc biệt trong những năm cuối thế kỷ.

Tỷ lệ mắc và tử vong do bệnh lao đã gia tăng đáng kể, dẫn đến việc WHO tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu về bệnh lao vào năm 1993 Theo báo cáo của WHO năm 2017, có 10 triệu người mắc lao và hơn 1,3 triệu người đã tử vong, với một số khu vực, đặc biệt là Châu Phi, có tỷ lệ mắc bệnh cao.

Trong số các ca tử vong năm 2017, có khoảng 1,3 triệu người âm tính với HIV và

Việt Nam hiện có khoảng 300.000 người dương tính với HIV Trong năm 2017, quốc gia này ghi nhận 124.000 ca mắc lao mới và 12.840 trường hợp tử vong do bệnh này Hiện tại, Việt Nam đứng thứ 16 trong số 30 quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao nhất thế giới và thứ 13 trong số 30 quốc gia có gánh nặng lao đa kháng thuốc.

Hình 1 4 Tỉ lệ mắc bệnh lao tại một số khu vực trên thế giới năm 2017 [64]

Bệnh lao trải qua hai giai đoạn chính: nhiễm lao và lao bệnh Vi khuẩn lao có khả năng tấn công mọi bộ phận trong cơ thể con người, nhưng lao phổi là dạng phổ biến nhất.

Giai đoạn nhiễm lao xảy ra khi vi khuẩn lao lần đầu tiên xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp, gây tổn thương viêm phế nang Sau khoảng 3 tuần đến 3 tháng, cơ thể hình thành kháng thể và miễn dịch với vi khuẩn lao, dẫn đến phản ứng Tuberculin dương tính Khoảng 80% - 90% người nhiễm lao chỉ ở tình trạng nhiễm mà không chuyển sang bệnh lao, trong khi 10% - 20% có nguy cơ phát triển bệnh lao khi sức đề kháng giảm và vi khuẩn tăng độc tính, đặc biệt ở những người có hệ miễn dịch suy giảm như HIV/AIDS hoặc các bệnh mạn tính khác.

Vi khuẩn lao gây ra triệu chứng tùy thuộc vào cơ quan bị ảnh hưởng, nhưng thường khó phát hiện ở giai đoạn sớm Bệnh thường chỉ được phát hiện khi có các biểu hiện rõ ràng như da xanh xao, mệt mỏi, ăn kém, gầy sút cân, ho kéo dài, sốt nhẹ vào chiều kèm theo ra mồ hôi ban đêm Do các triệu chứng này có thể mơ hồ và dễ nhầm lẫn với bệnh khác, chẩn đoán bệnh lao được xác định khi phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm như đờm, dịch dạ dày hoặc dịch phế quản.

Các kĩ thuật xác định vi khuẩn lao gồm 2 nhóm chính là kĩ thuật cổ điển và hiện đại

Các kỹ thuật cổ điển trong chẩn đoán vi khuẩn bao gồm nhuộm soi trực tiếp Ziehl - Neelsen (hay còn gọi là nhuộm AFB), phương pháp nuôi cấy và tiêm truyền súc vật Bên cạnh đó, nhóm các kỹ thuật hiện đại hiện nay bao gồm phản ứng chuỗi polymerase (PCR), giúp nâng cao độ chính xác trong việc phát hiện vi khuẩn.

PCR), phương pháp khuếch đại trực tiếp (Amplified direct test), phản ứng miễn dịch gắn men (Enzym Linked Immunosorbent Assay – ELISA), Xpert/MTB và nhiều kĩ thuật khác [2, 3]

1.3.2 Điều trị và dự phòng lao Điều trị lao: Mỗi nước trên thế giới đều có một phác đồ điều trị lao riêng, nhưng đều có đặc điểm chung là đều dựa vào chiến lược chống lao do WHO khuyến cáo là chiến lược DOTS (Directly Observed Treatment Short Course) điều trị hóa trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp Dựa trên DOTS, Chương trình Chống lao Quốc gia Việt Nam đã đưa ra phác đồ điều trị cho các loại bệnh lao Trong đó lao mới mắc sử dụng phác đồ I gồm các thuốc chống lao hàng 1 là isoniazid, rifampicin, streptomycin, pyrazinamid, ethambutol Phác đồ cụ thể là sử dụng 4 loại thuốc

At the School of Medicine and Pharmacy, VNU, the recommended treatment for adults includes a daily regimen of streptomycin, isoniazid, rifampicin, and pyrazinamide for the first two months, followed by a continuation phase of six months using rifampicin, isoniazid, and pyrazinamide For children, the treatment protocol consists of rifampicin, isoniazid, and pyrazinamide administered daily for the same initial two-month period.

Đối với người lớn, điều trị bệnh lao thường sử dụng hai loại thuốc isoniazid và ethambutol, trong khi trẻ em thường được kê đơn rifampicin và isoniazid hàng ngày Việc theo dõi tình trạng lâm sàng và các tác dụng phụ của thuốc là rất quan trọng để điều chỉnh phác đồ điều trị kịp thời Đối với những bệnh nhân lao có kết quả AFB dương tính, việc xét nghiệm đờm sẽ được thực hiện vào tháng thứ 2, tháng thứ 5 và tháng thứ 7 Nếu kết quả AFB vẫn dương tính từ tháng thứ 5 trở đi, điều trị sẽ được coi là thất bại.

Dự phòng lao có thể được thực hiện bằng cách sử dụng vaccin BCG cho những người chưa nhiễm lao Đối với những bệnh nhân đã nhiễm lao, việc sử dụng thuốc INH trong thời gian từ 6 tháng đến 1 năm sẽ giúp giảm nguy cơ chuyển sang giai đoạn bệnh lao.

1.3.3 Isoniazid trong điề u tr ị lao

1.3.3.1 Dược lý, chuyển hóa của isoniazid

Isoniazid (còn gọi là isonicotinylhydrazid, viết tắt là INH), là một thuốc chính trong điều trị bệnh lao Hóa chất này được tổng hợp ởPraha năm 1912 nhưng đến năm

Năm 1952, INH được phát hiện có tác dụng hiệu quả đối với vi khuẩn lao, giúp kìm hãm sự sinh trưởng và tiêu diệt chúng cả bên trong và bên ngoài tế bào Cơ chế hoạt động của thuốc này là ức chế quá trình hình thành axit mycolic trong thành tế bào của trực khuẩn lao.

INH được hấp thu qua ruột vào máu, với 40% ở dạng tự do và một phần kết hợp với axit amin trong máu thành hydrazol Cả INH ở dạng tự do và hydrazol đều có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn lao, trong khi phần dư thừa được chuyển hóa tại gan thành các hợp chất không có tác dụng với vi khuẩn này Tại gan, từ 50% đến 90% INH được acetyl hóa bởi enzym NAT2.

Hình 1.5 tạo thành acetyl isoniazid, sản phẩm tiếp tục bị thủy phân tạo thành acetyl hydrazin

Một con đường khác là INH có thể bị thủy phân trực tiếp tạo ra hydrazin [28]

NAT2 xúc tác quá trình acetyl hóa hydrazin, tạo ra acetyl hydrazin và diacetyl hydrazin Cả acetyl hydrazin và hydrazin đều có thể bị oxi hóa bởi Cytochrom P450 2E1, dẫn đến hình thành các hợp chất trung gian độc hại cho cơ thể Hydrazin là một chất độc hại đối với tế bào gan, có khả năng gây hoại tử tế bào.

Các nghiên c ứ u v ề đa hình di truyề n NAT2 liên quan đến đáp ứng điề u tr ị isoniazid ở ngườ i b ệ nh lao

INH đã được sử dụng để điều trị lao từ năm 1952 Đến năm 1954, các nhà khoa học phát hiện rằng kiểu hình acetyl hóa chậm có liên quan đến việc gia tăng các tác dụng phụ về thần kinh, đặc biệt là bệnh lý thần kinh ngoại biên, ở bệnh nhân lao được điều trị bằng INH.

Sau đó sự liên quan của INH với các đa hình NAT2 được báo cáo lần đầu tiên bởi

Vào năm 1960, Evans và cộng sự đã xác định hai nhóm kiểu hình acetyl hóa nhanh và chậm, đánh dấu một trong những nghiên cứu đầu tiên về dược động học trong chuyển hóa thuốc Mặc dù các nhà di truyền học đã chứng minh sự nhiễm độc gan do INH, nhưng mối liên hệ giữa đa hình di truyền NAT2 và đáp ứng INH vẫn chưa rõ ràng Acetyl hóa chậm đã được xác định là có nguy cơ gia tăng tác dụng phụ INH, đặc biệt là độc tính đối với hệ thần kinh Tuy nhiên, việc tiến hành xét nghiệm di truyền để dự đoán tác dụng phụ này không cần thiết, vì có thể ngăn chặn bằng cách sử dụng pyridoxine, một phương pháp an toàn và tiết kiệm.

Năm 1985, Weber WW và Hein DW đã công bố các báo cáo chi tiết về dược động học của quá trình acetyl hóa isoniazid Đến năm 1991, việc nhân bản thành công gen NAT2 đã cho phép xác định hai alen đầu tiên liên quan đến kiểu hình acetyl hóa chậm, và đến năm 1995, theo danh pháp quốc tế, hai alen này được gọi là NAT2.

Nhiều nghiên cứu đã xác định tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa trong các quần thể người khác nhau, đồng thời cũng chỉ ra mối liên quan giữa kiểu hình acetyl hóa và các tác dụng phụ của thuốc INH (Isoniazid).

Nghiên cứu tại Việt Nam trên 100 bệnh nhân được thu thập ngẫu nhiên từ các bệnh viện ở Hà Nội đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP, cho thấy tỷ lệ 3 alen.

NAT2*5, *6, *7 lần lượt là 2%, 12,5% và 25% [34] Một nghiên cứu khác của cùng tác giả sử dụng phương pháp realtime PCR cho kết quả tần số các alen đột biến

NAT2*5A, *6A, *7A lần lượt là 8%, 29% và 29% [33]

Năm 2005, Kinzig - Schipper đã công bố nghiên cứu về sự biến đổi dược động học của INH ở những người tình nguyện khỏe mạnh sau khi sử dụng liều chuẩn, đồng thời phân tích mối quan hệ với các biến thể di truyền của NAT2 và các đặc điểm nhân khẩu học Kết quả cho thấy nồng độ INH huyết tương tăng lên ở những cá thể có những đặc điểm di truyền nhất định.

Tại Trường Y Dược, VNU, kiểu hình acetyl hóa chậm làm giảm hoạt tính của enzyme NAT2 Nghiên cứu của Parkin và cộng sự cho thấy nồng độ isoniazid trong huyết tương của bệnh nhân lao cao gấp 4-6 lần ở những người acetyl hóa chậm so với acetyl hóa nhanh, trong khoảng thời gian từ 2 đến 6 giờ sau khi uống thuốc Các tác giả đã đề xuất cần có phác đồ liều isoniazid riêng biệt cho từng kiểu hình acetyl hóa.

51] Như vậy, các nghiên cứu đều chỉ ra rằng việc xác định các đa hình di truyền

NAT2 hỗ trợ bác sĩ lâm sàng trong việc ngăn ngừa tình trạng nhiễm độc gan nặng bằng cách điều chỉnh liều điều trị phù hợp với từng cá nhân, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ không mong muốn.

Nghiên cứu về vai trò của enzym NAT2 không chỉ liên quan đến isoniazid (INH) mà còn mở rộng ra mối liên hệ giữa kiểu hình acetyl hóa và các bệnh như ung thư, Alzheimer, Parkinson, và lupus ban đỏ hệ thống Enzym NAT2 có vai trò quan trọng trong chuyển hóa các hợp chất amin thơm và dị vòng, cũng như trong việc giải độc các chất gây ung thư và hóa chất độc hại Qua hơn 50 năm nghiên cứu, việc xác định kiểu hình acetyl hóa đã chứng minh giá trị của nó trong việc điều trị bệnh lao và các cá nhân tiếp xúc với tác nhân ung thư Việt Nam hiện đứng thứ 16 trong số 30 quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao nhất thế giới, do đó, việc xác định kiểu hình acetyl hóa có thể hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng trong việc điều chỉnh liều lượng isoniazid cho từng bệnh nhân trong quá trình điều trị lao.

Các phương pháp phân tích đa hình NAT2

Hiện nay, có nhiều phương pháp phân tích SNP được sử dụng, một số phương pháp điển hình được nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn gồm:

1.5.1 Phương pháp đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length

Phương pháp PCR-RFLP được ưa chuộng bởi độ chính xác cao, chi phí thấp và tốc độ nhanh trong việc phân tích DNA Kỹ thuật này dựa trên tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, cho phép nhận diện sự khác biệt về kích thước các đoạn DNA khi bị cắt bởi các enzym cắt hạn chế Nguyên lý hoạt động của PCR-RFLP dựa vào độ đặc hiệu của các enzym đối với các vị trí nhận biết trên DNA Sau khi DNA được cắt, các đoạn sẽ được chạy điện di qua gel agarose và lai với mẫu dò DNA đánh dấu phóng xạ tại các locus đặc biệt Sự khác biệt trong vị trí cắt giữa các cá thể dẫn đến sự hình thành các phân đoạn cắt khác nhau Với sự phát triển của công nghệ PCR, kỹ thuật PCR-RFLP ngày càng trở nên đơn giản và tiện lợi hơn, cho phép sử dụng một cặp mồi oligonucleotid để khuếch đại vùng DNA mong muốn.

Trường Đại học Y Dược, VNU tiến hành khảo sát, sau đó DNA được khuếch đại, cắt bằng enzym giới hạn, và phân tích qua điện di trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc nitrat.

1.5.2 Phương pháp giải trình tự

Phần lớn các phương pháp sàng lọc đột biến điểm/SNP hiện nay đều cần giải trình tự để xác định chính xác Nguyên tắc của các phương pháp giải trình tự hiện đại chủ yếu dựa trên phương pháp dideoxyribonucleotide (ddNTP) do Sanger công bố năm 1977 Mặc dù phương pháp cổ điển chỉ có thể giải trình tự các đoạn gen nhỏ khoảng 300 bp và yêu cầu kỹ thuật cao, nhưng các phương pháp hiện nay đã phát triển và cho phép giải trình tự nhanh chóng và chính xác các đoạn gen lớn Phương pháp này sử dụng ddNTP gắn chất phát quang, giúp ngừng phản ứng sao chép khi liên kết vào mạch DNA đang kéo dài Với cấu trúc phát quang phát ra ánh sáng khác nhau cho mỗi ddNTP, máy cảm biến tín hiệu kết hợp với máy tính xử lý và mã hóa để chuyển đổi thành trình tự DNA Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đặc biệt với các đoạn DNA từ 30 bp đến 1000 bp, nhưng không đọc được các trình tự ngắn dưới 30 bp và có sai số khi giải trình tự các đoạn trên 1000 bp, do đó cần xác định lại độ chính xác bằng các phương pháp thủ công khác.

1.5.3 Phương pháp phản ứng nối chuỗi (Ligase Chain Reaction, viết tắt là LCR)

Kỹ thuật phát hiện sự thay thế một đôi base với độ chính xác và tin cậy cao nhờ vào quá trình khuếch đại, sử dụng enzym ligase để kết nối hai đầu của cặp mồi liền kề Enzym ligase chỉ có thể nối hai chuỗi oligonucleotid khi chúng liên kết bổ sung hoàn toàn (100%), do đó, sự thay thế một đôi base sẽ ngăn cản sự hình thành liên kết nối Phương pháp LCR thường được áp dụng trong lĩnh vực pháp y.

Kỹ thuật sử dụng đầu dò oligonucleotid có khả năng lai với vị trí nội phân tử của gen đích, được gắn với chất phát màu huỳnh quang, cho phép xác định số lượng sản phẩm đặc hiệu tỷ lệ thuận với mức độ tín hiệu huỳnh quang Các đột biến điểm của DNA khuôn sẽ làm giảm sự bền vững của liên kết giữa đầu dò và đoạn DNA đích, ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp này.

Khi có đột biến, tín hiệu huỳnh quang sẽ giảm nhanh chóng so với DNA đích nguyên vẹn Kết quả khuếch đại DNA đích có thể được quan sát ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, giúp người làm thí nghiệm không cần thực hiện thêm các bước để đọc và phân tích kết quả xác định sản phẩm khuếch đại.

(như PCR) Do khả năng phân tích kết quả sau mỗi chu kì phản ứng, Realtime – PCR

Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN nổi bật với khả năng cung cấp kết quả nhanh chóng và chính xác, giúp tiết kiệm thời gian cho người sử dụng Tuy nhiên, phương pháp này cần đầu tư chi phí cao cho hóa chất và yêu cầu hệ thống máy Realtime với tiêu chuẩn khắt khe.

–PCR cũng như trình độ của người làm thí nghiệm [6]

1.5.5 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance liquid chromatography - DHPLC) Đây là phương pháp phân tích DNA dị sợi kép Thay vì sử dụng gel và phân tách DNA bằng điện di, DNA được phân tách bằng sắc ký DHPLC Các mạch DNA được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ, chúng liên kết với nhau và hình thành DNA dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác so với sợi kép bình thường DHPLC là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động [48] Với những tiến bộ gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt

1.5.6 Kỹ thuật phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn (single strand DNA conformational polymorphism, viết tắt là SSCP)

Sự thay thế một cặp base trong bộ gen có thể gây ra thay đổi cấu trúc và ảnh hưởng đến khả năng di chuyển của DNA Phương pháp SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) giúp phát hiện cấu trúc đa hình của các đoạn nucleotide thông qua sự thay đổi khả năng di chuyển của DNA chuỗi đơn Quá trình này bao gồm hai bước: khuếch đại đoạn DNA đích bằng PCR và sau đó phân đoạn sản phẩm PCR bằng điện di trên gel polyacrylamid ở điều kiện không biến tính Các đoạn DNA có đột biến điểm sẽ có cấu trúc khác biệt so với sợi DNA đối chứng và có thể được phân biệt nhờ gel polyacrylamid Phương pháp này yêu cầu điều kiện khắt khe về nhiệt độ, nồng độ gel, nồng độ mồi và thường mang lại kết quả tốt nhất với các phân đoạn DNA có kích thước khoảng 150 đôi base, không nên áp dụng cho các phân đoạn lớn hơn 200 đôi base.

Trong số các phương pháp phân tích đa hình gen NAT2, Realtime PCR, PCR-RFLP, DHPLC và giải trình tự là những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất.

Việt Nam, mới chỉ có phương pháp phân tích đa hình NAT2 dựa trên Realtime PCR và

Nghiên cứu của Đinh Đoàn Long và cộng sự sử dụng phương pháp PCR-RFLP để xác định các SNP có vai trò dược lý quan trọng ở người bệnh không mắc lao, trong khi chưa có báo cáo về đa hình di truyền NAT2 ở bệnh nhân lao qua phương pháp giải trình tự Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc lao vẫn cao và tác dụng phụ do isoniazid chưa được chú ý đúng mức Do đó, nhóm nghiên cứu thực hiện xây dựng quy trình chuẩn để phân tích kiểu gen, nhằm xác định kiểu hình của từng cá thể Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị bệnh lao trong thực tế lâm sàng tại Việt Nam.

ĐỔ I TƯỢ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U

V ậ t li ệ u nghiên c ứ u

100 người bệnh từ Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện 74 Trung Ương và

Bệnh viện Phổi Hà Nội tham gia nghiên cứu với các tiêu chí: bệnh nhân lao phổi có AFB dương tính (mới hoặc tái trị), được điều trị bằng thuốc chống lao hàng 1 theo phác đồ của Chương trình Chống lao Quốc gia Việt Nam năm 2017, và bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu.

Tiêu chuẩn loại trừ gồm có: Phụ nữ có thai và cho con bú; người bệnh nuôi cấy không mọc khuẩn lạc đểxác định các thông sốdược động học

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 6 năm 2017 đến tháng 9 năm 2018 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Hóa chất dùng cho tách DNA tổng số: E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega-Biotek)

Hóa chất dùng cho điện di: Ethylene Diamine Tetra Acetic Axit (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix), TAE 1X, 5X DNA loading dye (hãng

ThermoScientific), Oˈ GeneRuler 50bp DNA Ladder (hãng ThermoScientific),

Oˈ GeneRuler 1kb DNA Ladder (hãng ThermoScientific), Lambda DNA/HindIII

Marker (hãng ThermoScientific), Tris base (hãng Bio basic), axit acetic (hãng Merck)

Hóa chất cho PCR bao gồm cặp mồi được tổng hợp bởi hãng Phusa-biochem tại Việt Nam, với trình tự mồi đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu trước đây, cụ thể là 5'-GGA ACA.

AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3' [18, 34], nước khử ion (hãng Omega Biotek), Kapa2G T M Robust HotStart ReadyMix (2X) (hãng

Hóa chất dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR: E.Z.N.A.® CyclePure Kit (hãng Omega-biotek)

Hóa chất dùng cho PCR-RFLP: nước khử ion (hãng Omega Biotek), enzym cắt FastDigest KpnI, FastDigest BamHI, FastDigest TaqI (hãng ThermoScientific)

Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It - Mỹ), hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd

- Mỹ), máy PCR (Prime Thermal Cycler - Anh), tủ an toàn sinh học (ESCO - Đức),

The School of Medicine and Pharmacy at VNU is equipped with advanced laboratory instruments, including the EBA 21 centrifuge from Hettich Zentrifugen (Europe), the VELP shaker from Scientifica (Europe), the NP80 spectrophotometer from Nanophotometer (Germany), and the Fiocchetti flake ice machine.

- Anh), tủấm (Panasonic - Nhật bản), tủ lạnh sâu -30 o C (Panasonic - Nhật Bản), tủ mát

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện qua 6 bước chính: (1) thu thập mẫu sinh phẩm, (2) tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số, (3) nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR, (4) tinh sạch sản phẩm PCR, (5) xác định kiểu gen bằng phương pháp PCR-RFLP hoặc giải trình tự, và (6) phân tích kết quả.

Hình 2 1 Các bước tiến hành nghiên cứu

Tách chiết DNA tổng số

PCR nhân dòng đoạn gen NAT2

Xác định kiểu gen thông qua RFLP và giải trình tự tự

Thu thập100 mẫu máu BN lao

Tinh sạch sản phẩm PCR

Mỗi người bệnh cung cấp 2mL mẫu máu toàn phần lưu trong ống có chứa EDTA, bảo quản ở - 20 o C cho đến khi sử dụng

Kí hiệu mẫu là thông tin quan trọng về mẫu máu của người bệnh, bao gồm tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.

Tách DNA tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng

Phương pháp tách chiết axit nucleic dựa vào sự hấp thụ chọn lọc vào màng silica-gel, bao gồm bốn bước chính: ly giải mẫu, gắn DNA vào màng silica, rửa sạch tạp chất và cuối cùng là giải phóng, thu hồi DNA.

Quá trình ly giải là bước đầu tiên trong việc phá vỡ tế bào để giải phóng DNA, sử dụng dung dịch chất ly giải với nồng độ cao các muối hoạt động bề mặt giúp mất ổn định các liên kết hydro và tương tác kị nước, tạo điều kiện cho DNA chuyển lên màng silica Tiếp theo, DNA gắn vào màng silica gel nhờ sự hỗ trợ của các muối hoạt động bề mặt và cồn như ethanol hoặc isopropanol Bước rửa giúp loại bỏ tạp chất trên màng silica gel bằng dung dịch chứa muối hoạt động bề mặt cao, sau đó sử dụng ethanol để loại bỏ muối, đảm bảo chỉ còn DNA gắn trên màng Cuối cùng, quá trình giải phóng và thu DNA diễn ra, hoàn tất quy trình tách chiết DNA hiệu quả.

Bằng cách sử dụng dung dịch muối phù hợp, thường là Tris 10 mM ở pH 8 hoặc 9,

DNA sẽ hòa tan vào muối Cuối cùng sau khi chắc chắn DNA đã hòa tan, các cột sẽ được li tâm để thu DNA [27]

Hình 2 2 Nguyên lý tách DNA tổng số bằng kit [33]

(1) Ly gi ả i (2) G ắ n DNA vào màng (3) Rửa s ạch t ạ p ch ấ t (4) Gi ả i phóng và thu DNA

DNA tổng số thu được được điện di trên gel agarose 1,2%, đệm TAE 1X Trộn

Để phân tích DNA, trộn 4 µL DNA với 1 µL 5X DNA loading Dye có chứa Ethidium bromide (50 µg/mL) trước khi đưa vào mẫu Quá trình điện di được thực hiện ở hiệu điện thế 84 volt trong 40 phút, sử dụng thang chuẩn DNA λ/HindIII ladder, và các băng DNA sẽ hiện hình dưới ánh sáng UV Để xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết, đo mật độ hấp thụ quang tại bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) DNA được coi là có độ tinh sạch cao khi tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.

Phương pháp đo mật độ quang dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng của axit nucleic, với phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm nhờ sự hiện diện của base purin và pyrimidin Để xác định nồng độ DNA, cần đo giá trị mật độ quang ở OD 260, với 1 đơn vị OD 260 tương ứng với nồng độ 50 ng/ml cho dung dịch DNA sợi đôi Ngoài ra, việc đo ở bước sóng OD 280 giúp đánh giá mức độ hấp thụ của protein, từ đó sử dụng tỷ lệ OD 260/OD 280 để kiểm tra độ tinh khiết của DNA Các mẫu cần được đo ít nhất hai lần ở cả hai bước sóng 260 và 280 nm, và giá trị trung bình sẽ được sử dụng để xác định nồng độ DNA của mẫu.

2.2.3 Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR

Dựa vào dữ liệu từ NCBI, gen NAT2 kiểu dại có độ dài 1093 bp đã được khuếch đại thông qua phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với trình tự lý thuyết như được thể hiện trong Hình 2.3 [62].

1 GGAACAAATT GGACTTGGAA ACATTAACTG ACATTCTTGA GCACCAGATC CGGGCTGTTC CCTTTGAGAA CCTTAACATG

81 CATTGTGGGC AAGCCATGGA GTTGGGCTTA GAGGCTATTT TTGATCACAT TGTAAGAAGA AACCGGGGTG GGTGGTGTCT

161 CCAGGTCAAT CAACTTCTGT ACTGGGCTCT GACCACAATC GGTTTTCAGA CCACAATGTT AGGAGGGTAT TTTTACATCC

241 CTCCAGTTAA CAAATACAGC ACTGGCATGG TTCACCTTCT CCTGCAGGTG ACCATTGACG GCAGGAATTA CATTG TCGAT

321 GCTGGGTCTG GAAGCTCCTC CCAGATGTGG CAGCCTCTAG AATTAATTTC TGGGAAGGAT CAGCCTCAGG TGCCTTGCAT

401 TTTCTGCTTG ACAGAAGAGA GAGGAATCTG GTACCTGGAC CAAATCAGGA GAGAGCAGTA TATTACAAAC AAAGAATTTC

481 TTAATTCTCA TCTCCTGCCA AAGAAGAAAC ACCAAAAAAT ATACTTATTT ACGCTTGAAC CTCGAACAAT TGAAGATTTT

561 GAGTCTATGA ATACATACCT GCAGACGTCT CCAACATCTT CATTTATAAC CACATCATTT TGTTCCTTGC AGACCCCAGA

641 AGGGGTTTAC TGTTTGGTGG GCTTCATCCT CACCTATAGA AAATTCAATT ATAAAGACAA TACAGATCTG GTCGAGTTTA

721 AAACTCTCAC TGAGGAAGAG GTTGAAGAAG TGCTGAGAAA TATATTTAAG ATTTCCTTGG GGAGAAATCT CGTGCCCAAA

801 CCTGGTGATG GATCCCTTAC TATTTAGAAT AAGGAACAAA ATAAACCCTT GTGTATGTAT CACCCAACTC ACTAATTATC

881 AACTTATGTG CTATCAGATA TCCTCTCTAC CCTCACGTTA TTTTGAAGAA AATCCTAAAC ATCAAATACT TTCATCCATA

961 AAAATGTCAG CATTTATTAA AAAACAATAA CTTTTTAAAG AAACATAAGG ACACATTTTC AAATTAATAA AAATAAAGGC

1041 ATTTTAAGGA TGGCCTGTGA TTATCTTGGG AAGCAGAGTG ATTCATGCTA GA

Để xác định kiểu alen của đoạn gen NAT2, chúng tôi đã nhân dòng trình tự gen này thông qua quy trình tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng bằng cách sử dụng gel agarose 1,5% và thang chuẩn O’ GeneRuler DNA.

Ladder để xác định kích thước sản phẩm Tất cả các phản ứng đều sử dụng đối chứng âm đểđảm bảo mẫu không bị ngoại nhiễm

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng E.Z.N.A.® CyclePure Kit theo quy trình khuyến cáo, giúp loại bỏ mồi, muối và tạp chất từ mẫu DNA Phương pháp này sử dụng cột có màng silica gel, tương tự như nguyên lý tách chiết DNA đã được mô tả trước đó.

2.2.5 Xác đị nh ki ể u gen NAT2 b ằ ng PCR-RFLP

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được pha loãng đến nồng độ 100 ng/µL để sử dụng cho phản ứng cắt Để thực hiện phản ứng cắt, chúng tôi áp dụng enzym FastDigest KpnI.

FastDigest TaqI và FastDigest BamI được sử dụng để cắt ba alen NAT2*5, *6, *7 Dựa vào vị trí cắt của enzym trên gen NAT2, kích thước các băng điện di tương ứng với từng kiểu gen đã được dự kiến.

2.4 mô tả Alen NAT2*5 (c.341T > C) không có vị trí nhận biết của enzym cắt, tuy nhiên lại liên kết chặt chẽ với c.481C > T có vị trí nhận biết của KpnI Chính vì vậy, kiểu gen NAT2*5 được xác định thông qua kiểu gen của c.481C > T Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2 1 Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt

Thành phần Thể tích 1 phản ứng (10 àL) Điều kiện cắt Đệm 10X 1 àL Ủ 5 phút ở 37 ˚C, bất hoạt

Nước khử ion 4,5 àL DNA khuụn 100 ng/àL 3,5 àL

Kết quả dự kiến cho việc cắt alen NAT2*5, NAT2*6 và NAT2*7 cho thấy các kiểu gen khác nhau: đồng hợp tử kiểu dại (TT), dị hợp tử (CT), đồng hợp tử đột biến (CC), đồng hợp tử kiểu dại (GG), dị hợp tử (AG) và đồng hợp tử đột biến (AA).

Chiều dài đoạn gen sau khi cắt alen NAT2*5 và NAT2*7 ước tính lớn hơn 200bp, với các đoạn gen có sự khác biệt về chiều dài cũng trên 200bp Do đó, quá trình cắt sản phẩm gen diễn ra với hai đoạn khác nhau.

Tại Trường Y Dược, VNU, sản phẩm được điện di trên gel agarose 2% với thang chuẩn O’ GeneRuler 1kb DNA ladder (ThermoScientific) và hiển thị dưới ánh sáng UV qua máy soi gel Chiều dài ước tính của sản phẩm cắt NAT2*6 nhỏ hơn 400 bp, trong khi các đoạn gen cách nhau ít nhất 15 bp, do đó chúng tôi đã điện di trên gel acrylamide 10% và sử dụng thang chuẩn O’ GeneRuler 50bp DNA ladder để thu được hình ảnh cắt rõ nhất, sau đó áp dụng phương pháp nhuộm bạc để hiện hình sản phẩm.

2.2.6 Xác đị nh ki ể u gen NAT2 b ằng phương pháp gi ả i trình t ự

Đạo đứ c nghiên c ứ u

Nghiên cứu lâm sàng phải tuân thủ các quy định đạo đức của Bộ Y tế, đảm bảo người bệnh được thông báo đầy đủ về mục đích, lợi ích và rủi ro của nghiên cứu Người tham gia sẽ ký bản đồng thuận và có quyền rút lui bất cứ lúc nào Thông tin cá nhân của người bệnh được bảo mật tuyệt đối và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu.

Nghiên cứu đã được thông qua tại Hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học

Trước khi triển khai nghiên cứu, Quốc gia Hà Nội đã thu thập đầy đủ mẫu bệnh án và phiếu xác nhận tự nguyện tham gia của người bệnh.

K Ế T QU Ả NGHIÊN C Ứ U

Tách chi ế t DNA t ổ ng s ố

Mẫu máu từ 100 bệnh nhân đã được tách DNA bằng bộ kit của Omega, sử dụng phương pháp tách chiết điện di trên gel agarose 1,2% Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách chiết đạt yêu cầu.

Kết quả phân tích DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (Hình 3.1) cho thấy tất cả các sản phẩm DNA đều hiển thị một băng DNA rõ nét và đạt tiêu chuẩn chất lượng.

DNA từ các mẫu khác nhau cho thấy sự đồng đều và ổn định, được thể hiện qua các băng điện di sáng rõ, tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn.

Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở 260 nm cho thấy nồng độ DNA tổng số dao động từ 20 - 230 ng/µL, với chỉ số OD260/OD280 chủ yếu nằm trong khoảng 1,6 đến 2,2 Các kết quả chi tiết của từng mẫu được trình bày trong Phụ lục 2.

DNA tổng số thu được có độ bền cao, ít bị đứt gãy và chỉ xuất hiện dưới dạng một băng duy nhất Điều này đảm bảo rằng DNA này tinh sạch và đủ tiêu chuẩn để thực hiện các phản ứng nhân dòng tiếp theo.

Hình 3 1 Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2% Làn M1: thang chuẩn

DNA λ/HindIII; Làn 1 – 12: sản phẩm DNA tổng số của 12 mẫu nghiên cứu.

Nhân dòng đoạ n gen NAT2 b ằ ng PCR

3.2.1 T ối ưu quy trình PCR

Trong quá trình thực hiện PCR, việc tối ưu nhiệt độ gắn mồi là rất quan trọng để đạt hiệu suất cao nhất Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm PCR ở 10 nhiệt độ khác nhau, nằm trong khoảng từ 51,1 o C đến 59,9 o C Đồng thời, nồng độ DNA nhân dòng tối ưu được xác định từ các mức nồng độ 25, 50, 84, 150, 200 và 250 ng/µL.

Kết quả điện di trong Hình 3.2A cho thấy tại nhiệt độ gắn mồi từ 57,8 o C đến 58,9 o C, sản phẩm PCR tạo ra băng đặc hiệu, rõ ràng và có kích thước tương ứng với lý thuyết.

(1093 bp).Tuy nhiên, tại nhiệt độ gắn mồi 52,6 o C đến 55,8 o C có xuất hiện băng phụ, còn tại nhiệt độ 52,6 o C; 53,6 o C; 59,5 o C và 59,9 o C các băng xuất hiện mờ, không rõ nét

Nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 58 o C, giúp tạo ra băng sáng nhất, rõ nét và không có băng phụ, do đó được chọn cho các phản ứng tiếp theo Kết quả cho thấy nồng độ tối ưu đạt được hiệu quả cao nhất.

Kết quả từ Hình 3.2B cho thấy rằng PCR đạt hiệu quả tốt nhất ở nồng độ 200 ng/µL, với băng sáng rõ nét và không có băng phụ Trong khi đó, nồng độ 150 ng/µL và 250 ng/µL chỉ tạo ra băng sẫm mờ Do đó, nồng độ 200 ng/µL được chọn làm nồng độ tối ưu cho quá trình PCR.

Hình 3.2 trình bày kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 trên gel agarose 1,5% Phần (A) cho thấy kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi, trong khi phần (B) thể hiện kết quả tối ưu nồng độ DNA Làn M đại diện cho thang chuẩn kích thước DNA 1kb, và làn (-) là đối chứng âm.

3.3.2 Nhân dòng gen NAT2 c ủ a 100 m ẫ u nghiên c ứ u

Nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc nhân dòng 100 sản phẩm gen NAT2 bằng cách tối ưu hóa các thành phần và chu trình nhiệt, như trình bày trong Bảng 3.1 Kết quả điện di của 10 mẫu đầu tiên, thể hiện qua Hình 3.3, cho thấy băng sáng rõ nét, chứng tỏ phản ứng PCR đạt hiệu suất và độ đặc hiệu cao, phù hợp cho các phản ứng tiếp theo Thí nghiệm luôn sử dụng đối chứng âm và cho kết quả âm tính, khẳng định không có nhiễm DNA ngoại lai trong quá trình thao tác Kích thước băng so với thang chuẩn đạt khoảng 1093 bp, phù hợp với kích thước lý thuyết.

Bảng 3 1 Thành phần và điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2

N ồng độ ho ạt độ ng

Nước khử ion 3,4 -Biến tínhban đầu:

DNA khuụn 200 ng/àL 1 -Kộo dài cuối:

Hình 3 3 Kết quả nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu Làn M: thang chuẩn kích thước DNA 1kb; Làn (-): đối chứng âm.

Xác đị nh ki ể u gen NAT2 b ằ ng PCR-RFLP

Xác định kiểu gen NAT2*5 bằng phương pháp FastDigest KpnI cho thấy kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại CC tạo ra hai băng có kích thước 659 bp và 434 bp Trong khi đó, kiểu gen dị hợp tử CT sẽ cho ba băng với kích thước lần lượt là 1093 bp, 659 bp và 434 bp Kiểu gen đồng hợp tử đột biến cũng được phân tích trong nghiên cứu này.

TT không bị cắt cho một băng với kích thước 1093 bp (Hình 3.4A)

Phân tích kiểu gen NAT2 được thực hiện qua phương pháp PCR-RFLP, trong đó (A) các kiểu gen NAT2*5 và *7 được điện di trên gel agarose 2%, với M1 là thang chuẩn kích thước DNA 1kb (B) Các kiểu gen NAT2*6 được điện di trên gel acrylamide 10%, với M2 là thang chuẩn kích thước.

DNA 50bp; Làn (-): đối chứng âm

Xác định kiểu gen NAT2*6 bằng phương pháp FastDigest TaqI cho thấy kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG sẽ tạo ra 4 băng điện di có kích thước 316 bp sau khi cắt bằng enzym giới hạn.

226, 170 và 381 bp Kiểu gen dị hợp tử GA cho 5 băng điện di với kích thước 396,

381, 316, 226 và 170 bp Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA sẽ cho 3 băng điện di với kích thước 396, 381 và 316 bp (Hình 3.4B)

Xác định kiểu gen NAT2*7 bằng phương pháp FastDigest BamHI cho thấy kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG sẽ tạo ra hai băng có kích thước 810 bp và 283 bp, trong khi kiểu gen dị hợp GA sẽ cho ba băng.

Tại Trường Y Dược, VNU, kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA được xác định bằng băng có kích thước 1093 bp, 810 bp và 283 bp, trong đó chỉ có một băng duy nhất với kích thước 1093 bp (Hình 3.4A).

Xác đị nh ki ể u gen NAT2 b ằ ng gi ả i trình t ự

SNP Đồng hợp tử kiểu dại Dị hợp Đồng hợp tử đột biến

Hình 3 5 Kết quả xác định các kiểu gen NAT2 trên BioEdit version 7.1.9

Hình 3.5 hiển thị các kiểu gen của 6 alen NAT2*5 được phân tích qua phần mềm BioEdit 7.1.9 Kết quả giải trình tự cho thấy sự đa dạng trong các kiểu gen này.

*6, *7, *11, *12, *13 đều xuất hiện trong mẫu nghiên cứu của chúng tôi.

K ế t qu ả phân b ố t ầ n s ố alen và t ỷ l ệ ki ể u gen, ki ể u hình NAT2

Kết quả phân tích trên 100 mẫu nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ 6 alen NAT2*5, *6,

Tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa dựa trên 3 SNP và 6 SNP cho kết quả giống nhau, với tỷ lệ acetyl hóa nhanh, trung bình và chậm lần lượt là 25%, 38% và 37% (Bảng 3.3) Các tỷ lệ này được thể hiện qua các giá trị 6%, 32%, 12%, 6%, 7% và 49% (Bảng 3.2).

Bảng 3 2 Kết quả phân tích kiểu gen và tần số của đa hình NAT2

Tần số alen p - value χ 2 Đồng hợp tử kiểu dại

Dị hợp tử Đồng hợp tử đột biến

Bảng 3 3 Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trên 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam

Kiểu hình Nhanh Trung bình Chậm Tổng

BÀN LUẬN

Định dạng
Số trang	62
Dung lượng	1,05 MB