BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA CÁC GEN DAPK VÀ APC TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ UNG THƢ CỔ TỬ CUNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SHPT GVHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS TRƢƠNG KIM PHƢỢNG SVTH: Nguyễn Tấn Liêm MSSV: 1153010395 Khóa: 2011 – 2015 TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA CÁC GEN DAPK VÀ APC TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ UNG THƢ CỔ TỬ CUNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SHPT GVHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS.TRƢƠNG KIM PHƢỢNG SVTH: Nguyễn Tấn Liêm MSSV: 1153010395 Khóa: 2011 – 2015 GVHD ký xác nhận TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp đánh dấu cho bước ngoặc quan trọng quãng đời sinh viên để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp em nhận nhiều hướng dẫn giúp đỡ nhiệt tình, lời động viên chân thành từ Thầy, Cô, gia đình bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn đến tất quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh tâm huyết, tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức để giúp em làm sở cho chuyên đề khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến Cô PGS TS Lê Huyền Ái Thúy Cô ThS Trƣơng Kim Phƣợng tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt suốt thời gian thực đề tài Bên cạnh đó, xin cảm ơn bạn tôi, bạn sinh viên phòng thí nghiệm sinh học phân tử quan tâm, giúp đỡ tận tình suốt trình thực đề tài Cuối xin cảm ơn Ba, Mẹ, cảm ơn gia đình bên con, ủng hộ cho con, tạo điều kiện tốt để hoàn thành việc học Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất người Thầy, người Cô đáng kính khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh, xin chúc Thầy Cô ngày gặt hái nhiều thành công Tôi xin chúc bạn hoàn thành tốt công việc học tập trường thành công sống Xin chân thành cảm ơn Sinh viên thực Nguyễn Tấn Liêm ii MỤC LỤC Phần I Tổng quan I.1 Tổng quan ung thư I.1.1 Khái niệm ung thư I.1.2 Phân loại ung thư I.1.3 Ung thư cổ tử cung I.1.4 Các nguyên nhân dẫn đến ung thư cổ tử cung I.1.4.1 Thuốc I.1.4.2 Thuốc I.1.4.3 Virus HPV (Human Papiloma virus) I.1.4.4 Độ tuổi I.1.4.5 Yếu tố di truyền chủng tộc I.2 Tình hình mắc bệnh ung thư cổ tử cung giới Việt Nam I.2.1 Tình hình ung thư cổ tử cung giới I.2.2 Tình hình ung thư cổ tử cung Việt Nam I.3 Tổng quan Epigenetics methyl hóa I.3.1 Epigenetics I.3.2 Sự methyl hóa DNA I.3.3 Đảo CpG I.3.4 Sự biến đổi Histone 10 I.3.5 microRNA 10 I.4 Gen DAPK (Death-associated protein kinase) 11 I.4.1 Định nghĩa 11 iii I.4.2 Cơ chế hoạt động chức protein DAPK 11 I.4.3 Tình hình nghiên cứu methyl hóa gen DAPK ung thư 13 I.5 Gen APC (Adenomatous polyposis coli) 15 I.5.1 Định nghĩa 15 I.5.2 Cơ chế hoạt động chức protein APC 15 I.5.3 Tình hình nghiên cứu methyl hóa gen APC 17 I.5.4 Phương pháp nghiên cứu methyl hóa 19 I.5.4.1 Phương pháp MSP (Methylation Specific PCR) 19 I.5.4.2 Phương pháp Nested MSP 20 Phần II Vật liệu phương pháp 21 II.1 Vật liệu 21 II.2 Phương pháp 21 II.2.1 Khai thác liệu 21 II.2.2 Khảo sát in silico 21 II.2.2.1 Thu thập trình tự gen mục tiêu, xác định vị trí vùng cần tìm 21 II.2.2.2 Phương pháp đánh giá, thiết kế mồi 21 II.2.3 Khảo sát in vitro 22 II.2.3.1 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm Pap’smear 22 II.2.3.2 Xác định nồng độ độ tinh DNA sau tách chiết 24 II.2.3.3 Biến đổi DNA sodium bisulfite với kit Zymo Research 24 II.2.3.4 Thực phản ứng MSP 25 II.2.3.5 Điện di gel agarose 27 II.2.3.6 Giải trình tự 28 Phần III Kết Quả Và Thảo Luận 29 iv III.1 Khai thác liệu 29 III.1.1 Bộ liệu tần suất methyl hóa vùng promoter gen DAPK loại ung thư ung thư cổ tử cung 30 III.1.2 Bộ liệu tần suất methyl hóa vùng promoter gen APC loại ung thư ung thư cổ tử cung 38 III.2 Khảo sát in sillico 45 III.2.1 Thu thập trình tự gen DAPK, gen APC 45 III.2.1.1 Thu thập trình tự gen DAPK 45 III.2.1.2 Thu thập trình tự gen APC 46 III.2.2 Khảo sát vùng promoter gen DAPK (Death associated protein kinase), APC (Human adenomatous polysis coli) 47 III.2.2.1 Khảo sát vùng promoter gen DAPK 47 III.2.2.2 Khảo sát vùng promoter gen APC 48 III.2.3 Thu thập hệ mồi cho phản ứng MSP 49 III.2.3.1 Thu thập hệ mồi cho phản ứng MSP gen DAPK 49 III.2.3.2 Thu thập hệ mồi cho phản ứng MSP gen APC 51 III.2.4 Tìm hiểu thông số vật lý mồi tham khảo 51 III.2.4.1 Thông số vật lý cặp mồi gen DAPK 53 III.2.4.2 Thông số vật lý cặp mồi gen APC 55 III.3 Khảo sát in vitro 57 III.3.1 Tách chiết DNA kiểm tra DNA gen sau tách chiết 57 III.3.2 Kết phản ứng MSP mẫu bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu gen DAPK, APC 58 III.3.2.1 Kết phản ứng MSP mẫu bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu gen DAPK 58 v III.3.2.2 Kết phản ứng MSP mẫu bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu gen APC 60 III.3.3 Kết qủa giải trình tự sản phẩm MSP gen DAPK 62 Phần IV Kết Luận Đề Nghị 65 IV.1 Kết luận 65 IV.2 Đề Nghị 65 Phần V Tài Liệu Tham Khảo 66 Phần VI Phụ lục 89 vi MỤC LỤC HÌNH VÀ BẢNG Hình I Quá trình khởi phát diễn tiến ung thư .1 Hình I Số bệnh nhân nhiễm tử vong ung thư cổ tử cung gây Thế giới .5 Hình I Các trình biến đổi Epigenetics Hình I Quá trình methyl hóa DNA .7 Hình I Quá trình methyl hóa Hình I Methyl hóa DNA tế bào bình thường tế bào ung thư Hình I Định vị gen DAPK nhiễm sắc thể số 11 Hình I Con đường chu trình chết tế bào 13 Hình I Định vị gen APC nhiễm sắc thể số 15 Hình I 10 Con đường điều hòa tín hiệu Wnt màng nguyên sinh chất phức hợp tế bào chất 17 Hình I 11 Nguyên tắc phản ứng MSP .19 Hình II Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi DAPK-MR, DAPK-MF, DAPK-UR, APC-MR, APC-MF, APC-UR, APC-UF 27 Hình III Tần suất methyl hóa gen DAPK loại ung thư 35 Hình III Phương pháp sử dụng nghiên cứu methyl hóa DNA gen DAPK loại ung thư 36 Hình III Mẫu sử dụng nghiên cứu methyl hóa DNA gen DAPK loại ung thư 36 Hình III Tần suất methyl hóa gen APC loại ung thư .42 Hình III Phương pháp sử dụng nghiên cứu methyl hóa gen APC loại ung thư 42 vii Hình III Mẫu sử dụng nghiên cứu methyl hóa gen APC loại ung thư 43 Hình III Định vị gen DAPK nhiễm sắc thể số 47 Hình III Định vị đảo CpG vùng promoter gen DAPK .48 Hình III Định vị gen APC nhiễm sắc thể số 48 Hình III 10 Định vị đảo CpG vùng promoter gen APC 49 Hình III 11 Cấu trúc vùng promoter gen DAPK .54 Hình III 12 Vị trí CpG trình tự nhận biết nhân tố phiên mã vùng promoter gen DAPK 55 Hình III 13 Cấu trúc vùng promoter gen APC 56 Hình III 14 Vị trí CpG trình tự nhận biết nhân tố phiên mã vùng promoter gen APC 57 Hình III 15 Kết điện di sản phẩm MSP mẫu CD 58 Hình III 16 Kết điện di sản phẩm MSP mẫu CA 61 Hình III 17 Kết giải trình tự mẫu CD1-A với cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR 63 Bảng II Thành phần phản ứng PCR cho cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR, APCMF, APC-MR 26 Bảng II Thành phần phản ứng PCR cho cặp mồi DAPK-UF, DAPK-UR, APCUF, APC-UR 26 Bảng III Các công trình nghiên cứu khoa học thu thập NCBI 29 Bảng III Tần suất methyl hóa vùng promoter gen DAPK loại ung thư 31 Bảng III Tần suất methyl hóa vùng promoter gen DAPK giai đoạn ung thư cổ tử cung khác phương pháp xác định tính chất methyl hóa khác 37 viii Bảng III Tần số methyl hóa trung bình có trọng số gen DAPK ung thư cổ tử cung tế bào bình thường 38 Bảng III Tần suất methyl hóa vùng promoter gen APC loại ung thư 40 Bảng III Tần suất methyl hóa vùng promoter gen APC giai đoạn ung thư cổ tử cung khác phương pháp xác định tính chất methyl hóa khác 44 Bảng III Tần số methyl hóa trung bình có trọng số gen APC ung thư cổ tử cung tế bào bình thường 45 Bảng III Trình tự gen DAPK thu thập ngân hàng gen 45 Bảng III Trình tự gen APC thu thập ngân hàng gen .46 Bảng III 10 Thông tin cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR, DAPK-UF DAPK-UR cho phản ứng MSP 50 Bảng III 11 Thông tin cặp mồi APC-MF, APC-MR, APC-UF, APC-UR cho phản ứng MSP 51 Bảng III 12 Khảo sát thông số vật lý mồi DAPK-MF, DAPK-MR, DAPKUF, DAPK-UR 53 Bảng III 13 Khảo sát thông số vật lý mồi APC-MF, APC-MR, APC-UF, APC-UR 55 Bảng III 14 Tính chất methyl hóa đảo CpG vùng promoter gen DAPK mẫu CD .59 Bảng III 15 Tính chất methyl hóa đảo CpG vùng promoter gen APC mẫu CA .61 ix Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 3: Kết kiểm tra khả bắt cặp bổ sung cặp mồi methyl trình tự promoter gen DAPK biến đổi bisulfite Phụ lục 4: Kết kiểm tra khả bắt cặp bổ sung cặp mồi unmethyl trình tự promoter SVTH: Nguyễn Tấn Liêm gen DAPK biến đổi Trang 99 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp bisulfite Phụ lục 5: Tần suất methyl hóa trung bình có trọng số gen DAPK loại ung thư Ung thư Trung bình trọng số tần suất methyl hóa (%) Ung thư cổ tử cung 45,1 Ung thư bạch cầu 44,2 Ung thư dày 52,3 Ung thư phổi 29 SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 100 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Ung thư vòm họng 42,4 Ung thư khác 44,3 Phụ lục 6: Các loại mẫu dùng phân tích methyl hóa DNA vùng promoter gen DAPK loại ung thư Loại Các loại ung thư mẫu Máu Huyết tương Huyết Mô Tần suất (%) CER GAS LEU LUN 0 0 0 0 0 17 6 10 25 23,2 8,5 13,4 8,5 12,2 34,1 SVTH: Nguyễn Tấn Liêm NAS Other Trang 101 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Phục lục 7: Các phương pháp dùng phân tích methyl hóa DNA vùng promoter gen DAPK loại ung thư Các loại ung thư Loại mẫu CER GAS LEU LUN NAS Other 0 0 0 0 MSP 14 11 10 23 QMSP 0 Tần suất (%) 23,2 8,5 13,4 8,5 12,2 34,1 Methylight PCR MS-HRM (Methylationsesentive hight resolution melting) Phụ lục 8: Các công trình nghiên cứu methyl hóa DNA vùng promoter gen APC Tên ung thư Ung thư vú Tên ung Tần suất thư viết methyl tắt hóa (%) BRE 55 SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Tổng Loại mẫu mẫu 51 Mô Tài liệu Phương pháp tham khảo MSP [12] Trang 102 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Ung thư vú Ung thư vú BRE 17 93 Mô QMSP [60] BRE 19 Mô MSP [45] CER 26 30 Mô QMSP [110] MSP [38] Ung thư cổ tử cung Ung thư cổ tử CER 32 53 Mô cung Ung thư cổ tử CER 8,3 109 Mô Pyrosequencing [88] COL 35,2 125 Mô MSP [116] COL 27 110 Mô Pyrosequencing [103] COL 25 120 Mô Methylight [130] COL 18 48 Mô MSP [45] COL 28 118 Mô MSP [11] cung Ung thư ruột kết Ung thư ruột kết Ung thư ruột kết Ung thư ruột kết Ung thư ruột kết SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 103 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Ung thư ruột kết Ung thư ruột kết Ung thư ruột kết Ung thư ruột kết Ung thư ruột kết Ung thư dày Ung thư dày Ung thư dày Ung thư gan Ung thư gan Ung thư gan COL 41,67 24 Mô Methylight [24] COL 18 38 Mô Methylight [24] COL 53,8 52 Mô MSP [36] COL 44,9 49 Mô MSP [36] COL 65 Mô MSP [144] GAS 57,3 75 Mô MSP [86] GAS 30,67 75 MSP [86] GAS 34 38 Mô MSP [45] LIV 78,95 57 Mô QMSP [14] LIV 33 18 Mô MSP [45] LIV 78,6 42 Mô MSP [104] SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Huyết Trang 104 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Ung thư phổi Ung thư phổi Ung thư phổi Ung thư phổi LUN 96 99 LUN 47 89 LUN 95 91 LUN 58 other Mô QMSP [130] QMSP [130] Mô QMSP [17] 40 Mô QMSP [123] 51 43 mô MSP [14] Other 97 33 Mô MSP [14] Other 10 19 Mô MSP [45] Other 59,5 210 Mô MSP [42] Other 14 27 Mô MSP [45] Huyết Ung thư bàng quang Ung thư bàng quang Ung thư bàng quang Ung thư bàng quang Ung thư thực quản SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 105 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Ung thư thực Other 92 52 Mô Methylight [73] Other 50 32 Mô Methylight [73] Other 25 52 Methylight [73] Other 6,3 32 Methylight [73] other 50 48 Mô Nested MSP [54] Other 33 18 Mô MSP [45] Other 60 27 Mô MSP [148] Other 64,1 170 Mô MSP [44] quản Ung thư thực quản Ung thư thực quản Ung thư thực quản Ung thư tụy Ung thư Huyết tương Huyết tương Ung thư tuyến tiền liệt Ung thư tuyến tiền liện SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 106 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Ung thư tuyến Other 27 101 Mô MSP [91] Other 58,2 110 Mô MSP [18] Other 45 96 Mô MSP [102] Other 60 10 Mô MSP [76] tiền liệt Ung thư biểu mô Ung thư biểu mô Ung thư tủy Phụ lục 9: Kết blast trình tự promoter gen APC có mã số Acssession: U02509.1 SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 107 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 108 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 10: Kết kiểm tra khả bắt cặp bổ sung cặp mồi methyl trình tự promoter gen APC biến đổi bisulfite SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 109 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Phụ lục 11: Kết kiểm tra khả bắt cặp bổ sung cặp mồi methyl trình tự promoter gen APC biến đổi bisulfite Phụ lục 12: Tần suất methyl hóa trung bình có trọng số gen APC loại ung thư Ung thư Trung bình trọng số tần suất methyl hóa (%) Ung thư vú 27,5 Ung thư cổ tử cung 29,1 Ung thư ruột kết SVTH: Nguyễn Tấn Liêm 29 Trang 110 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Ung thư dày 42 Ung thư gan 71,8 Ung thư phổi 77,3 Ung thư khác 51,8 Phụ lục 13: Các loại mẫu dùng phân tích methyl hóa DNA vùng promoter gen APC loại ung thư Loại Các loại ung thư mẫu Huyết tương Huyết Mô BRE CER COL GAS LIV LUN Other 0 0 0 0 1 3 10 3 15 7 23,3 7 9,3 39,5 Tần suất (%) SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 111 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Phục lục 14: Các phương pháp dùng phân tích methyl hóa DNA vùng promoter gen APC loại ung thư Các loại ung thư Loại mẫu BRE CER COL GAS LIV LUN Other METHYLIGHT 0 0 MSP 11 Nested MSP 0 0 0 PYROSEQUENCING 1 0 0 QMSP 1 0 Tần suất (%) 7 23,3 7 9,3 42,1 Phụ lục 15: Kết blast trình tự mẫu CD1-A ngân hàng gen NCBI SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 112 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 113 ... Cancer) I.1.3 Ung thƣ cổ tử cung Ung thư cổ tử cung loại ung thư ác tính, bắt đầu tăng sinh bất thư ng tế bào xung quanh tử cung vùng cấu trúc tử cung [53] Các dạng ung thư cổ tử cung: ung thư biểu... nghiệp: " KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA CÁC GEN DAPK VÀ APC TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ UNG THƢ CỔ TỬ CUNG" Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA vùng promoter. .. bệnh ung thƣ cổ tử cung giới Việt Nam I.2.1 Tình hình ung thƣ cổ tử cung giới Hình I Số bệnh nhân nhiễm tử vong ung thƣ cổ tử cung gây Thế giới (WHO, 2012) Ung thư cổ tử cung nguy n nhân thứ bệnh