Sử dụng phần mềm IDT analyzer trực tuyến, phân tích thông số vật lý của cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR, DAPK-UF, DAPK-UR, APC-MF, APC-MR, APC- UF, APC-UR, kết quả thể hiện trong Bảng III. 12, Bảng III. 13. Các thông số vật lý cần chú ý khi khảo sát tính đặc hiệu của mồi:
− Tỉ lệ thành phần các nucleotide A, T, G, C là thông số cần phải chú ý khi thiết kế mồi vì ảnh huởng rất lớn đến phản ứng PCR, nó ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA, nhiệt độ bắt cặp của mồi vào DNA. Cặp mồi methyl và
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 52
unmethyl có thể tỉ lệ A,T, G, C không nằm trong khoảng tối ưu như các mồi chuẩn dành cho phản ứng PCR vì mồi thiết kế cho phản ứng MSP sẽ có nhiều cytosine tự do và phải có ít nhất một CpG nằm ở vị trí đầu 3’ của mồi. Các cytosine sẽ bị biến đổi thành thymine sau quá trình biến đổi với sodium bisulfate. Sự thay đổi này khác nhau tùy từng loại mồi. Đối với mồi methyl thì toàn bộ cytosine biến đổi thành thymine, trừ cytosine bị methyl hóa là không biến đổi. Còn đối với mồi unmethyl thì toàn bộ cytosine bị biến đổi thành thymine. Bên cạnh đó, hàm lượng GC cũng ảnh hưởng đến chất lượng của mồi, thông thường thì hàm lượng GC vào khoảng 50-60%. Tuy nhiên, mồi thiết kế cho MSP thì tỉ lệ GC thường nằm ngoài ngưỡng tối ưu. Đối với hai cặp mồi (MF-MR; UF-UR) có %GC thấp, nằm trong khoảng 30-40%
− Đối với tiêu chí chiều dài mồi, đây là một yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, chiều dài thường dao động trong khoảng từ 18-25 bp. Tuy nhiên trong các trường hợp cụ thể thì chiều dài mồi có thể thay đổi dài hay ngắn hơn chiều dài chuẩn, dao động từ 15-30 bp. Thông thường thì cặp unmethyl dài hơn cặp mồi methyl.
− Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm) cũng là một thông số rất quan trọng. Tm được tính bằng công thức Tm= 69,3+0,41(%C+G). Dựa vào nhiệt độ nóng chảy mà ta có thể đưa ra nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng PCR phù hợp. Nhiệt độ nóng chảy của hai mồi càng giống nhau càng tốt tuy nhiên không nên khác nhau quá 5oC. Từ sự thay thế các Cytosine bị methyl hóa bằng Thymine trong cặp mồi unmethyl dẫn đến thành phần GC thấp hơn, vì vậy mà Tm thấp hơn khi so sánh với cặp mồi methyl nếu cặp mồi methyl và unmethyl có kích thước bằng nhau.
− Cấu trúc thứ cấp: khả năng liên kết tạo cấu trúc thứ cấp của mồi cũng là một trong những tiêu chí quan trọng để đánh giá mồi. Cấu trúc thứ cấp gồm có (1) hairpin loop (khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc của mồi), (2) homo dimer (khả năng tự bắt cặp, tức mồi xuôi bắt cặp với mồi xuôi và mồi ngược tự bắt cặp với mồi ngược), (3) hetero dimer (khả năng mồi xuôi với mồi bắt cặp với
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 53
nhau). Nếu các cấu trúc này càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR càng thấp vì nó ngăn cản mồi bắt cặp vào trình tự DNA đích.
− Để xác định độ bền vững của cấu trúc thứ cấp, người ta dùng một khái niệm
G: sự biến đổi năng lượng tự do (Gibs free energy), kcal/mole. Giá trị ∆G được dùng để đánh giá mức độ bền vững của các cấu trúc trên. ∆G lớn hơn -9 kcal/mole thì sẽ không ảnh hưởng đến phản ứng PCR, vì vậy các giá trị ∆G nhỏ hơn -9 kcal/mole cần phải được lưu ý. Để xác định độ đặc hiệu và vị trí bắt cặp của bộ mồi (MR-MF; UR-UF) chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb, kết quả ghi nhận (Hình III.11 và III. 13).
III.2.4.1. Thông số vật lý của cặp mồi gen DAPK
Bảng III. 12. Khảo sát các thông số vật lý của mồi DAPK-MF, DAPK-MR, DAPK-UF, DAPK-UR
Tên
mồi Trình tự (5’-3’) Chiều dài
% GC
Tm
(oC) (1) (2) (3)
DAPK- MF
GGATAGTCGGATC
GAGTTAACGTC 24 50 56,5 -0,41 -7,53 -8,26
DAPK- MR
CATAAACGCCAAC
GCCGAAAA 21 47,6 56,9 -0,96 -3,61 -8,26
DAPK- UF
GGAGGATAGTTGG ATTGAGTTAATGT
T 27 37 54,8 0,15 -4,85 -8,31
DAPK- UR
CCATAAACACCAA
CACCAAAAA 22 36,4 52,1 -1,47 -8,31
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 54
Chú thích: (1) Cấu trúc kẹp tóc ΔG (kcal/mole), (2) Cấu trúc homo dimer ΔG (kcal/mole), (3) Cấu trúc hetero dimer ΔG (kcal/mole).
Từ kết quả phân tích hai cặp mồi của gen DAPK, chúng tôi nhận thấy các thông số vật lý như: chiều dài, % GC và Tm của các mồi đều phù hợp. Giá trị tuyệt đối của G (Giá trị năng lượng tự do hình thành cấu trúc thứ cấp: cấu trúc kẹp tóc, cấu trúc tự bắt cặp,…) đều nhỏ hơn 9, phù hợp với hướng dẫn sử dụng của hãng IDT. Tóm lại, từ các kết quả khảo sát đặc tính, độ đặc hiệu của mồi đã thu nhận chúng tôi quyết định chọn bộ mồi này cho phản ứng MSP để khảo sát sự methyl hóa của các gen DAPK ở ung thư cổ tử cung.
Hình III. 11. Cấu trúc vùng promoter của gen DAPK
Chú thích: phần khung gạch xéo là các đảo CpG, MF: mồi xuôi methyl hóa, MR: mồi ngược methyl hóa, UF: mồi xuôi không có sự methyl hóa, UR: mồi ngược không có sự methyl hóa, dấu mũi tên thể hiện hướng khuếch đại của mồi, kích thước sản phẩm ở giữa 2 mồi, dấu gạch đứng: nhân tố phiên mã, hình tam giác:
nhân tố phiên mã có chứa vị trí CpG
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 55
Hình III. 12. Vị trí CpG và trình tự nhận biết của các nhân tố phiên mã trên vùng promoter của gen DAPK
Chú thích: Các cặp dinucleotide CG được tô màu đỏ. Các trình tự liên kết với nhân tố phiên mã quan trọng được đóng khung và tô màu xanh. Trình tự bắt cặp của mồi được gạch dưới.
III.2.4.2. Thông số vật lý của cặp mồi gen APC
Bảng III. 13. Khảo sát các thông số vật lý của mồi APC-MF, APC-MR, APC- UF, APC-UR
Tên
mồi Trình tự Chiều
dài %GC Tm
(oC) (1) (2) (3) APC
-MF
TATTGCGGAGTGCGG
GTC 18 61,1 57,8 -1,3 -3,61 -9,75
APC -MR
TCGACGAACTCCCGA
CGA 18 61,1 58,2 -1,9 -6,76 -9,75
APC GTGTTTTATTGTGGA 24 41,7 55,9 2,15 -1,47 -8,09
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 56
-UF GTGTGGGTT
APC -UR
CCAATCAACAAACTC
CCAACAA 22 40,9 54 -1,47 -8,09
Chú thích: (1) Cấu trúc kẹp tóc ΔG (kcal/mole), (2) Cấu trúc homo dimer ΔG (kcal/mole), (3) Cấu trúc hetero dimer ΔG (kcal/mole).
Từ kết quả phân tích hai cặp mồi của gen APC, chúng tôi nhận thấy các thông số vật lý như: chiều dài, % GC và Tm của các mồi đều phù hợp. Giá trị tuyệt đối của
G (Giá trị năng lượng tự do hình thành cấu trúc thứ cấp: cấu trúc kẹp tóc, cấu trúc tự bắt cặp,…) đều nhỏ hơn 9, phù hợp với hướng dẫn sử dụng của hãng IDT. Tóm lại, từ các kết quả khảo sát đặc tính, độ đặc hiệu của mồi đã thu nhận chúng tôi quyết định chọn bộ mồi này cho phản ứng MSP để khảo sát sự methyl hóa của các gen APC.
Hình III. 13. Cấu trúc vùng promoter gen APC
Chú thích: phần khung gạch xéo là các đảo CpG, MF: mồi xuôi methyl hóa, MR: mồi ngược methyl hóa, UF: mồi xuôi không có sự methyl hóa, UR: mồi ngược không có sự methyl hóa, dấu mũi tên thể hiện hướng khuếch đại của mồi, kích thước sản phẩm ở giữa 2 mồi, dấu gạch đứng: nhân tố phiên mã, hình tam giác:
nhân tố phiên mã có chứa vị trí CpG
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 57
Hình III. 14. Vị trí CpG và trình tự nhận biết của các nhân tố phiên mã trên vùng promoter của gen APC
Chú thích: Các cặp dinucleotide CG được tô màu đỏ. Các trình tự liên kết với nhân tố phiên mã quan trọng được đóng khung và tô màu xanh. Trình tự bắt cặp của mồi được gạch dưới.