I.1. Tổng quan ung thư
I.1.4. Các nguyên nhân dẫn đến ung thư cổ tử cung
I.1.4.5. Yếu tố di truyền và chủng tộc
Ung thư cổ tử cung biểu mô hình vảy có nguy cơ xảy ra 74-80%, ung thư tuyến 39-69% ở những phụ nữ là con đầu lòng của người bệnh (mẹ, chị và con gái) [61]. Bên cạnh đó, còn có nhiều yếu tố được coi là nguyên nhân gây ung thư cổ tử cung: thai sản, suy giảm miễn dịch và HIV,….
I.2. Tình hình mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam I.2.1. Tình hình ung thƣ cổ tử cung trên thế giới
Hình I. 2. Số bệnh nhân nhiễm và tử vong do ung thƣ cổ tử cung gây ra trên Thế giới (WHO, 2012)
Ung thư cổ tử cung là nguyên nhân thứ 2 trong các bệnh ung thư ở phụ nữ gây tử vong trên thế giới và có 500.000 người bệnh mới được chẩn đoán trên thế giới [62]. Ở Mỹ, có khoảng 128.000 người bệnh ung thư mới phát hiện mỗi năm và 4.600 người phụ nữ chết trong năm 2000. Theo Iida M. và cộng sự (2014) cho thấy rằng ở Nhật Bản, các giai đoạn ung thư cổ tử cung sớm gia tăng ở các độ tuổi của người phụ nữ (20-40 tuổi), chẩn đoán và điều trị ở các bệnh nhân này thì rất quan trọng [62].
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 6
Theo WHO 2002, ung thư cổ tử cung là loại ung thư tử vong đứng thứ hai trên thế giới ước tính khoảng 493.243 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh ung thư cổ tử cung và 273.505 người chết vì ung thư cổ tử cung mỗi năm (WHO, 2002).
Ước tính có khoảng 1,4.106 người phụ nữ trên thế giới đang sống với ung thư cổ tử cung và ở Ấn Độ có khoảng một phần tư trong tổng số được báo cáo gần đây có 132.000 người nhiễm bệnh (ACCP, 2004).
Theo WHO 2012, thế giới có 528.000 bệnh nhân mới phát hiện bị ung thư cổ tử cung, 266.000 người tử vong trên thế giới, chiếm 12% trong các bệnh ung thư ở phụ nữ trên thế giới. Ung thư cổ tử cung là một loại bệnh phổ biến nhất ở phụ nữ miền Đông và miền Trung của Châu phi, chiếm tần số gây bệnh cao trên Thế Giới độ tuổi từ 15 đến 44 tuổi (WHO, 2012).
I.2.2. Tình hình ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam
Tại Việt Nam, ước tính cứ 100.000 phụ nữ thì có khoảng 20 trường hợp mắc bệnh và 11 trường hợp tử vong. Trong năm 2010, có 5.664 phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung, tỷ lệ mắc là 13,6/100.000 phụ nữ. Một trong những lý do dẫn đến tình trạng này là phụ nữ chưa được sàng lọc định kỳ và có hệ thống để phát hiện sớm ung thư qua các xét nghiệm thích hợp, dễ tiếp cận [155, 157]. Theo WHO 2012, Việt Nam có 5.146 người mới phát hiện bệnh ung thư cổ tử cung và 2.423 người tử vong (WHO, 2012).
I.3. Tổng quan về Epigenetics và sự methyl hóa I.3.1. Epigenetics
Thuật ngữ Epigenetics được Waddington C. H. định nghĩa vào năm 1940, là quá trình thay đổi cơ chế di truyền trong sự biểu hiện của gen mà không có sự thay đổi trình tự nucleotide [132]. Epigenetics gồm có sự methyl hóa DNA, sự biến đổi các histone và các microRNA [19]. Sự biến đổi Epigenetics liên quan đến sự biểu hiện gen thông qua những cơ chế riêng biệt ảnh hưởng đến sự ổn định, gấp cuộn, định vị và tổ chức của DNA [66].
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 7
Hình I. 3. Các quá trình biến đổi Epigenetics[157]
I.3.2. Sự methyl hóa DNA
Sự methyl hóa DNA có tính chất di truyền phân tử, là quá trình gắn nhóm CH3 vào vị trí cytosine liên kết phosphodiester với guanine [92]. Sự methyl hóa DNA được xúc tác bởi nhóm enzyme DNA methyltransferase (DNMT), chuyển nhóm methyl từ S-adenyl methione (SAM) vào đầu cacbon số 5 của cytosine để hình 5mC [68, 99, 133]. Họ DNA methyltransferase (DNMT) gồm có DNMT3a, DNMT3b và DNMT1 [99, 133]. Ở các loài động vật có vú, sự methyl hóa DNA xảy ra tại các vị trí CpG [92].
Hình I. 4. Quá trình methyl hóa DNA [99]
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 8
Hình I. 5. Quá trình methyl hóa[99]
Chú thích: DNA methyltransferase: DNMT 3a, DNMT3b và DNMT1 I.3.3. Đảo CpG
CpG là cặp dinucleotide gồm có cytosine liên kết phosphodiester với guanine (CpG, trong đó "p" chỉ ra sự liên kết posphodiester giữa nucleotide cytosine và guanine), tập trung trong các đảo CpG [92, 99].
Đảo CpG là các chuỗi DNA có chiều dài 0,5 kilobase đến một vài kilobase,
%GC chiếm hơn 50% thành phần nucleotide [15, 92]. Các đảo CpG thường được tìm thấy ở vùng 5’-promoter kéo dài đến exon đầu tiên của nhiều gen giữ nhà (house-keeping gene) và gen đặc trưng cho mô (tissue-specific genes) [92]. Có khoảng 70% các promoter thuộc gen của sinh vật Eukaryote có sự hiện diện của các đảo CpG [99, 120]. Đặc biệt là các đảo CpG liên kết với các vùng promoter của gen người và chuột có trình tự bảo tồn cao. Các đảo CpG được bảo tồn trong suốt quá trình tiến hóa nhằm giúp vùng promoter của gen biểu hiện cơ chế điều hòa cấu trúc nhiễm sắc thể và các yếu tố liên kết phiên mã [66, 99].
Sự methyl hóa của các đảo CpG giúp điều hòa sự biểu hiện gen trong suốt các quá trình phát triển và biệt hóa [49, 93, 98, 122, 134]. Ở tế bào lành, sự methyl hóa DNA bình thường diễn ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các gen đè nén khối u, gen điều hòa chu trình tế bào và chương trình chết tế bào [133]. Tuy nhiên khi có sự methyl hóa bất thường, bao gồm methyl hóa vượt mức (hypermethylation)
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 9
xảy ra trên nhóm gen đè nén khối u, làm chức năng các gen có lợi này bị bất hoạt hay giải methyl hóa vượt mức (hypomethylation) xảy ra trên nhóm oncogene, kích hoạt chức năng các gen bất lợi, là các cơ chế chính gây ung thư đã được ghi nhận [133, 140].
Sự methyl hóa DNA vượt mức trên các đảo CpG của các vùng promoter gen ức chế khối u đều dẫn đến sự biến đổi DNA trong suốt quá trình phát triển của tế bào ung thư [68].
Hypermethylation: tính chất methyl hóa DNA vượt mức của các đảo CpG trong vùng promoter và hypomethylation tính chất giải methyl hóa DNA vượt mức trên cả bộ gen người thông qua quá trình giảm số lượng các cặp dinucleotide CpG bị methyl hóa trong các vùng trình tự lặp lại và các vùng trình tự chèn, được chia thành ba dạng khác nhau: dạng A, B, C (Hình I. 6) [75].
Hình I. 6. Methyl hóa DNA trong tế bào bình thường và tế bào ung thư [75]
Chú thích [75]:
- Dạng A: DNA bộ gen người có tính chất methyl hóa DNA vượt mức tại các vùng promoter và tính chất methyl hóa DNA trên cả bộ gen người.
- Dạng B: DNA bộ gen người có tính chất không bị methyl hóa tại các vùng promoter và có tính chất methyl hóa DNA trên cả bộ gen người.
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 10
- Dạng C: DNA bộ gen người có tính chất methyl hóa DNA vượt mức tại các vùng promoter và tính chất giải methyl hóa DNA trên cả bộ gen.
Sự methyl hóa DNA của các gen gây ung thư có tiềm năng như một dấu chứng sinh học trong việc ứng dụng chẩn đoán lâm sàng như nguy cơ rủi ro, chẩn đoán, phân loại và sự tiến triển của ung thư [89, 96].
Tính chất methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của các oncogen MGMT, RARβ2, RASSF1A, p16INK4A, CCNA, FHIT, p73, HIC-1, CADM1, Htert, DcR1, DcR2, DAPK1, APC, SYK dẫn đến ung thư cổ tử cung [68].
I.3.4. Sự biến đổi Histone
Nucleosome là đơn vị cơ sở cấu tạo nên cấu trúc nhiễm sắc thể, bao gồm các chuỗi DNA được cuộn xung quanh 8 phân tử protein lõi: histone 2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4 và 1 phân tử histone nối (H1) [114].
Histone có vai trò đảm bảo ổn định cấu trúc nhiễm sắc thể thông qua các tương tác tĩnh điện và điều hòa sự sao chép, phiên mã. Sự biến đổi Histone dẫn đến thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể (giải nén), tác động đến sự biểu hiện gen [149].
Cơ chế biến đổi histone bao gồm sự methyl hóa, acetyl hóa, ubiquitin hóa và sự phosphoryl hóa histone. Các dạng biến đổi này ảnh hưởng đến sự gấp cuộn của các chuỗi DNA cũng như ảnh hưởng đến hoạt động phiên mã [99].
Những sự biến đổi này được thực hiện bởi các enzyme điều hòa histone acetyltransferase (HATs) và deacetylases (HDACs): di chuyển nhóm acetyl, histone methylstranferase (HMTs) và demethyl (HDMs): di chuyển nhóm methyl [114]
Trong suốt quá trình sinh ung, các tế bào có thể chịu sự biến đổi histone làm thay đổi khả năng nhận biết trình tự mạch khuôn của các yếu tố phiên mã, chính vì thế dẫn đến sự biểu hiện hoặc im lặng bất thường của gen [149].
I.3.5. microRNA
microRNA (miRNA) là phân tử RNA không mã hóa (noncoding), có kích thước khoảng 22-25 nucleotide. miRNA có tính chất bảo tồn và đặc trưng trong các mô, có vai trò kiểm soát sự biểu hiện của gen [66].
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 11
microRNA tương tác với trình tự mRNA (RNA thông tin), mRNA thường ở vùng 3’ không dịch mã (Untranslation), làm ngăn cản quá trình dịch mã, có thể làm thoái hóa, dẫn đến sự im lặng bất thường của gen [29, 66].
I.4. Gen DAPK (Death-associated protein kinase) I.4.1. Định nghĩa
Gen DAPK nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (9q21.33), có kích thước là 211.407 bp (Gencard).
Hình I. 7. Định vị của gen DAPK trên nhiễm sắc thể số 9
Gen DAPK mã hóa protein ức chế quá trình tạo u và sự di căn, được điều hòa bởi Ca2+/calmodulin, có chức năng tín hiệu trung gian trong kiểm soát sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào [70].
Sự methyl hóa vượt mức ở các đảo CpG trên gen DAPK dẫn đến ức chế biểu hiện của protein DAPK là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và diễn tiến của quá trình sinh ung và di căn [70]. Sự bất hoạt của gen DAPK dẫn đến sự bất hoạt của protein DAPK làm giảm đi sự cảm ứng của p19ARF/p53, kết quả dẫn đến sự bất hoạt chương trình chết của tế bào phụ thuộc p53 [128].
I.4.2. Cơ chế hoạt động và chức năng của protein DAPK
DAPK (120 kDa) là protein lớn nhất trong họ protein DAPK, được điều hòa bởi Ca2+/Calmodulin [52]. Protein DAPK gồm nhiều cấu trúc domain có chức năng khác nhau: kinase, miền chết (death domain) và vùng lặp lại ankyrin gián tiếp tương tác với các protein khác [52].
Protein DAPK là protein thực hiện nhiều chức năng bên trong tế bào: sự chết theo chương trình (Apotosis), sự tự tiêu của tế bào (Autophagy), sự di cư của tế bào, hình thành các bóng màng (membrane blebbing),…[52, 154]. Cơ chế chết theo chương trình tế bào và sự tự tiêu của tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế sự hình thành và di căn khối u [52]. Protein DAPK có vai trò kích thích sự khởi
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 12
đầu của một số cytokines (INFγ, TNFα, Fas,..), sự bong tróc của các chất nền bên trong tế bào, các oncogen [33].
Trong tế bào bình thường, sự phosphoryl hóa protein ERK2 dẫn đến sự tăng hoạt động của protein DAPK và làm tăng hoạt tính thúc đẩy chương trình chết của tế bào [52]. Protein DAPK thúc đẩy sự giữ protein ERK1/2 trong tế bào chất, gây trở ngại hoạt động của protein ERK trong nhân, là nhóm Elk-1. Protein có mối quan hệ trong sự thúc đẩy sự tồn tại và tăng sinh của tế bào [52]. Khi protein ERK1/2 tồn tại trong tế bào chất, kích thích sự khởi đầu các tín hiệu chết của tế bào bằng con đường làm tăng nhanh các protein DAPK dẫn đến sự loại trừ các tế bào. Các protein ERK2 bị phosphoryl hóa sẽ hoạt động tại bộ máy Golgi, tương tác của protein GAIP với Gα dẫn đến sự tự tiêu của tế bào. Các con đường Ras/Raf/ERK thể hiện sự điều hòa tự tiêu (autophagy) của tế bào thông qua sự điều hòa phosphoryl hóa GAIP. Nói tóm lại, sự tồn tại các protein ERK1/2 trong tế bào chất bởi protein DAPK, gây nên sự tự tiêu của tế bào và thúc đẩy hoạt động ức chế khối u của protein DAPK [52].
Bên cạnh đó, protein DAPK sẽ kích thích quá trình phiên mã của các gen p53 trong con đường phụ thuộc vào protein p19ARF. ARF làm ổn định các protein p53 bởi sự bất hoạt cơ chế điều hòa âm tính protein Mdm2 [52]. Các protein p53 ổn định sẽ kích thích sự chết theo chương trình tế bào (Apotosis) hoặc gây ra sự tự tiêu (Autophagy) thông qua sự ức chế các hoạt động của protein mTor trong con đường phụ thuộc phức hợp AMPK và TSC1/2 [52].
Các oncogen như Ras, Myc hoặc E2F-1 có mối quan hệ chặt chẽ với các con đường chết/suy yếu của tế bào, hình thành nên các điểm kiểm tra (Checkpoint) sự chết hoặc suy yếu của tế bào, phụ thuộc vào các cấp độ điều hòa chống lại sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào [52]. Protein DAPK đồng biểu biện với các oncogen như MyC và Ras hoặc E1A và Ras, ức chế hoạt động của các oncogen trong cơ chế sinh u.
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 13
Hình I. 8. Con đường chu trình chết của tế bào[52]
I.4.3. Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa của gen DAPK trong ung thƣ
Cohen O. và cộng sự (2001) chứng minh rằng sự methyl hóa DNA của gen DAPK như một tín hiệu liên quan đến cơ chế sinh u và sự phát triển của khối u ác tính ở người [33].
Narayan G. và cộng sự (2003) khảo sát tần suất methyl hóa DNA của vùng promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 90 mẫu mô ung thư thân tử cung của các bệnh nhân ở Colombia, Đức, Tây Ban Nha. Kết quả nghiên cứu, xác định được 51,1% (46/90) mẫu ung thư thân cổ tử cung bị methyl hóa DNA trên gen DAPK [101].
Một công trình nghiên cứu của Dulaimi E. và cộng sự (2004) khảo sát tần suất methyl hóa DNA của vùng promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 34 mẫu mô ung thư vú thu nhận từ trung tâm ngân hàng khối u ung thư Fox Chase (Fox chase Cancer Center Tumor Bank). Nhóm tác giả xác định được 50% (17/34) mẫu mô vú bị methyl hóa DNA tại vùng promoter gen DAPK, với tính chất đặc trưng cho từng loại tế bào khối u, hiện diện trong tất cả các giại đoạn và các cấp độ của ung thư vú [39].
Tiếp theo, công trình nghiên cứu của Li J. và cộng sự (2005) khảo sát tần suất methyl hóa DNA trên vùng promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 60
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 14
mẫu mô ung thư vòm họng thu nhận từ Đại Học Y Dược Thượng Hải. Kết quả nghiên cứu ghi nhận tỉ lệ methyl hóa DNA là 27% (16/60) mẫu mô. Từ đó cho thấy sự methyl hóa DNA trên vùng promoter của gen DAPK xuất hiện phổ biến trong ung thư vòm họng và ảnh hưởng đến sự tiến triển của ung thư vòm họng [84].
Gozuacik D. và cộng sự (2006) chứng minh rằng sự methyl hóa DNA trên vùng promoter của gen DAPK được tìm thấy nhiều hơn trong 20 loại ung thư: ung thư bạch huyết, bạch cầu, phổi, vú, ruột kết, tử cung, dạ dày và khối u não,… Kết quả nghiên cứu cho thấy sự mất đi biểu hiện của gen DAPK trong ung thư được đặc trưng bởi tính chất methyl hóa DNA bất thường ở các tế bào ung thư, chức năng của gen DAPK trong cơ chế đè nén u [52].
Liu Y. và cộng sự (2007) khảo sát tần suất methyl hóa của vùng promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 122 bệnh nhân ung thư phổi ở phía tây của Pennsyvania. Kết quả nghiên cứu ghi nhận được 32,8% (40/122) mẫu mô phổi bị methyl hóa DNA. Nhóm tác giả nhận định tỉ lệ mắc bệnh do sự biến đổi của gen DAPK không có liên quan đến tình trạng hút thuốc của bệnh nhân hay các đột biến diễn ra ở các gen K-ras, gen p53 và gen EGFR [87].
Zhao X. và cộng sự (2008) khảo sát sự methyl hóa bất thường của vùng promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 52 mẫu mô ung thư biểu mô cổ tử cung và 60 mẫu mô có sự tạo u trong biểu mô cổ tử cung của các bệnh nhân ở Đại Học Zhenzhou. Nhóm tác giả xác định 65,4% (34/52) mẫu bị methyl hóa DNA trong ung thư biểu mô cổ tử cung, 18,3% (11/60) mẫu bị methyl hóa DNA trong biểu mô cổ tử cung có sự tạo u [152]. Sự methyl hóa bất thường của vùng promoter gen DAPK ở mẫu mô ung thư cổ tử cung cao hơn nhiều so với các mẫu mô có sự tạo u bên trong biểu mô cổ tử cung. Sự methyl hóa DNA trên vùng promoter của gen DAPK có mối quan hệ nghịch với sự biểu hiện của protein DAPK. Sự methyl hóa DNA trên vùng promoter là nguyên nhân dẫn đến sự bất hoạt của gen DAPK, có mối quan hệ với sự tạo u của ung thư cổ tử cung [152].
Fendri A. và cộng sự (2009) khảo sát tần suất methyl hóa DNA trên vùng promoter của gen DAPK bằng phương pháp MSP của 68 mẫu mô ung thư vòm họng tại bệnh viện Đại Học Sfax, phía nam của Tunisia. Kết quả nghiên cứu xác
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 15
định được 91% (62/68) mẫu mô methyl hóa DNA. Đây là kết quả nghiên cứu phản ánh tính chất methyl hóa DNA vượt mức của vùng promoter trên gen DAPK là chìa khóa quan trọng dẫn đến cơ chế sinh u, có thể là dấu chứng sinh học trong chẩn đoán bệnh ung thư [46].
Đồng thời vào năm 2010, Wu L. và cộng sự đã tiến hành khảo sát tần suất methyl hóa của vùng promoter gen DAPK bằng phương pháp MSP của 65 mẫu mô ung thư gan ở các bệnh nhân Hàn Quốc. Công trình nghiên cứu xác định được 52%
(34/65) mẫu mô bị methyl hóa DNA và nhóm tác giả ghi nhận sự methyl hóa bất thường tại vùng promter của gen DAPK có thể coi như một dấu chứng sinh học (biomarker) để chẩn đoán, dự báo trước nguy cơ mắc bệnh ung thư gan [142].
Năm 2014, Xiong J. và cộng sự đã chứng minh rằng sự methyl hóa DNA của vùng promoter gen DAPK có mối quan hệ chặt chẽ với ung thư cổ tử cung. Sự methyl hóa vùng promoter của gen DAPK1 được coi như một dấu chứng sinh học (Biomarker) trong ung thư biểu mô cổ tử cung để chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung [143].
I.5. Gen APC (Adenomatous polyposis coli) I.5.1. Định nghĩa
Gen APC nằm trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21.22), có kích thước là 138.742 bp (Gencard).
Hình I. 9. Định vị của gen APC trên nhiễm sắc thể số 5
Gen APC thuộc họ gen đè nén khối u, mã hóa cho protein APC có nhiều chức năng tác động đến con đường tín hiệu Wnt/β catein [24, 36, 43 ].
I.5.2. Cơ chế hoạt động và chức năng của protein APC
Protein APC có kích thước 2.843 acid amin, trọng lượng 310 kDa, chứa nhiều vùng domain liên kết với các protein khác giúp protein APC thực hiện nhiều chức năng bên trong tế bào [43]. Protein APC còn có các chức năng như hình thành