Gen APC nằm trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21.22), có kích thước là 138.742 bp (Gencard).
Hình I. 9. Định vị của gen APC trên nhiễm sắc thể số 5
Gen APC thuộc họ gen đè nén khối u, mã hóa cho protein APC có nhiều chức năng tác động đến con đường tín hiệu Wnt/β catein [24, 36, 43 ].
I.5.2. Cơ chế hoạt động và chức năng của protein APC
Protein APC có kích thước 2.843 acid amin, trọng lượng 310 kDa, chứa nhiều vùng domain liên kết với các protein khác giúp protein APC thực hiện nhiều chức năng bên trong tế bào [43]. Protein APC còn có các chức năng như hình thành
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 16
khung xương tế bào, di cư tế bào và bám dính thông qua sự tương tác với các protein bộ khung tế bào như tubulin, actin, EB1,…[43].
Protein APC có đặc điểm nổi trội nhất là liên kết với β catein, làm thoái biến các phân tử β catein, có vai trò trong cơ chế điều hòa âm β-catein và con đường tín hiệu Wnt [36, 43]. Do protein APC liên kết với β catein và đồng kích hoạt GSK3 (glyocogen synthase kinase 3) nên protein APC được coi là “giàn khuôn” cho sự phosphoryl hóa của β catein [112].
Trong các tế bào bình thường, β catein nội sinh được tìm thấy trong sự kết dính với biểu mô của tế bào, nơi mà nó tương tác với E-cadherin và α catein để giúp đỡ sự bám dính bên trong tế bào [75].
β-catein mới tổng hợp trong tế bào chất là đích cho sự phân giải bởi: Axin, protein APC ức chế khối u, protein phosphat 2A, protein kinase GSK3b (Glycogen synthase Kinase 3) và CK1α (Casein Kinase 1α) [75]. Tiếp đó là sự phosphory hóa β catein với phức hợp, đầu tiên là Ser 45 của CK1α và sau đó là Ser 33, Ser 37 và Thr-41 bởi đích GSK3β, quá trình ubiquintin hóa tại vùng lặp lại chuyển đổi β trong protein ligase ubiquitin E3 (β-TrCP) và sự khử protein bởi proteosome [75].
Các ligand của Wnt tương tác với các phức hợp thụ thể Fzd nằm trên màng gồm 7 đoạn và protein LRP5/6 làm rối loạn cấu trúc phức hợp APC/Axin/GSK3β [75]. Phức hợp thụ thể ligand của Wnt có vai trò phosphory hóa domain LRP5/6 bên trong tế bào thông qua sự liên kết hoạt động của CK1α và GSK3β. Sự phosphoryl hóa vượt mức của vùng domain LRP5/6 liên kết với Axin dẫn đến phá hủy phức hợp này. Hệ quả này là Axin tự do di chuyển tới màng tham gia vào sự thoái biến β catein nhanh chống dừng lại [75]. Các LRP ở trạng thái bị bất hoạt (không liên kết với Axin) sau đó sẽ bị giải phosphoryl hóa và bị thoái biến bởi một cơ chế chưa được biết. Vì thế, sự ổn định của β catein bằng con đường tín hiệu Wnt được thực hiện thông qua sự phân tách phức hợp protein APC/Axin/GSK3β, hay chính là sự ức chế hoạt động của GSK3β [75].
Con đường tín hiệu Wnt còn phụ thuộc vào các protein Dishevelled (Dsh) trong tế bào chất, tương tự như Axin, được bổ sung tới các thụ thể con đường tín
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 17
hiệu Wnt. Hoạt động của Dsh liên kết với Axin, CK1, Par-1 và CK2, cho phép phân tách các thành phần của phức hợp APC/Axin/GSK3β [75].
Đáng chú ý khi xảy ra sự mất chức năng của gen APC kết quả dẫn đến sự tích lũy β catein, nguyên nhân dẫn đến hoạt động phiên mã vượt mức của các gen đích Wnt thông qua phức hợp β catein/ yếu tố tế bào T (T cell factor) là nguyên nhân khởi phát quá trình tạo u [36]. Mối quan hệ giữa sự bất hoạt gen APC với con đường tín hiệu Wnt được thể hiện bằng quá trình tích lũy β catein, là một trong những nguyên nhân hình thành ung thư . Sự methyl hóa DNA vượt mức được ghi nhận là sự khởi đầu của quá trình tạo u khi gen APC bất hoạt hoàn toàn [55].
Hình I. 10. Con đường điều hòa tín hiệu Wnt trong màng nguyên sinh chất và các phức hợp trong tế bào chất [75]
I.5.3. Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa của gen APC
Esteller M. và cộng sự (2000) chứng minh sự methyl hóa DNA vượt mức trên vùng promoter ở gen APC là cơ chế quan trọng làm suy yếu đi chức năng của gen APC, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư [45]. Đồng thời vào năm 2000, Kawakami K. và cộng sự đã ghi nhận vùng promoter của gen APC bị methyl hóa DNA vượt mức là yếu tố chính gây nên ung thư tuyến thực quản, các cấp độ methyl hóa DNA của gen APC trong huyết tương có tiềm năng như một dấu chứng sinh học cho quá trình xâm lấn và chẩn đoán ung thư thực quản [73].
Dong S. và cộng sự (2001) khảo sát tần xuất methyl hóa DNA trên vùng promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP 53 mẫu mô thân ung thư cổ tử cung
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 18
tại bệnh viện Samsung Cheil. Kết quả nghiên cứu xác định 32% (17/53) mẫu mô ung thư thân cổ tử cung bị methyl hóa DNA [38].
Toyooka S. và cộng sự (2004) khảo sát tần suất methyl hóa DNA của vùng promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP 351 mẫu mô ung thư phổi ở Nhật.
Nhóm tác giả xác định 37% (131/351) mẫu mô ung thư phổi bị methyl hóa DNA [127].
Một công trình nghiên cứu của Nomoto S. và cộng sự (2007) khảo sát tần suất methyl hóa DNA trên vùng promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP của 52 mẫu mô ung thư gan của Đại Học Y Dược Nagoya. Kết quả nghiên cứu xác định 78,6% (33/42) mẫu mô gan bị methyl hóa DNA [104].
Tiếp theo, công trình nghiên cứu của Yaqinuddin A. và cộng sự (2013) khảo sát tần suất methyl hóa DNA trên vùng promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP của 27 mẫu mô ung thư tuyến tiền liệt ở Pakistani. Kết quả nghiên cứu ghi nhận 88,2% (15/27) mẫu mô methyl hóa, sự methyl hóa DNA vượt mức của vùng promoter gen APC có tần suất methyl hóa cao ở người dân Pakistani, có tiềm năng như một dấu chứng sinh học (Biomarker) cho việc xác định ung thư tuyến tiền liệt [148]. Đồng thời vào năm 2013, Dimberg J. và cộng sự (2013) khảo sát tần suất methyl hóa của vùng promoter gen APC ở 52 mẫu mô ung thư ruột kết ở Thụy Điển, 59 mẫu mô ung thư ruột kết của bệnh nhân ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu xác định 53,8% (28/52) mẫu mô ung thư ruột kết ở Thụy Điển bị methyl hóa DNA, 44,9% (22/49) mẫu mô ung thư ruột kết ở Việt Nam bị methyl hóa DNA. Sự methyl hóa của vùng promoter gen APC được coi như là một công cụ trong chẩn đoán ung thư ruột kết [36].
Samaei N. M. và cộng sự (2014) khảo sát tần suất methyl hóa DNA trên vùng promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP của 125 mẫu mô ung thư ruột kết tại Đại Học Y Dược Golestan. Kết quả nghiên cứu ghi nhận 35,2% (44/125) mẫu methyl hóa. Tỉ lệ methyl hóa DNA trên vùng promoter của các gen tham gia điều hòa con đường Wnt chiếm tỉ lệ cao trong ung thư ruột kết. Sự methyl hóa DNA vượt mức có mối quan hệ với sự tăng biểu hiện của enzyme DNMT1 [116]. Đồng thời vào năm 2014, công trình nghiên cứu của Bilgrami S. M. và cộng sự (2014)
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 19
khảo sát tần suất methyl hóa DNA vượt mức trên vùng promoter ở gen APC bằng phương pháp MSP ở 76 mẫu mô ung thư bàng quang ở Đại Học Aga Khan. Kết quả nghiên cứu xác định 51% (22/43) mẫu mô bàng quang bị methyl hóa DNA cấp độ thấp, 97% (32/33) mẫu mô bàng quang bị methyl hóa ở cấp độ cao. Sự methyl hóa DNA trên vùng promoter ở gen APC có tiềm năng là công cụ đánh giá sự xâm nhiễm của ung thư bàng quang [14].
I.5.4. Phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa
I.5.4.1. Phương pháp MSP (Methylation Specific PCR)
Phân tích chính xác bản đồ về sự methyl hóa DNA ở các đảo CpG là một điều cần thiết để hiểu sâu hơn về các cơ chế sinh học như: các gen dấu vết điều hòa, sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X và sự im lặng của các gen ức chế khối u trong các bệnh nhân bị ung thư. Herman J. và cộng sự (1996) mô tả một phương pháp mới:
MSP (Methyltion Specific PCR) đánh giá tình trạng methyl hóa ở các vị trí CpG thuộc đảo CpG [58].
Herman J. và cộng sự (1996) đã chứng minh rằng phương pháp MSP có thể dùng để xác định sự thay đổi methyl hóa vượt mức của vùng promoter có mối quan hệ với sự bất hoạt các gen ức chế khối u trong các loại ung thư ở người [58].
Hình I. 11. Nguyên tắc của phản ứng MSP [166]
Chú thích: M: DNA bị methyl hóa, U: DNA không bị methyl hóa
Phương pháp MSP dựa vào sự biến đổi Bisulfite (Bisulfite modification) để làm khác biệt giữa allele bị methyl hóa và allele không có sự methyl hóa tại các đảo CpG và phản ứng PCR (Polymerase chain reaction) khuếch đại đoạn gen mục tiêu
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 20
với các cặp mồi đặc trưng cho allele có sự methyl hóa DNA (Methylated DNA) và allele không bị methyl hóa DNA (Unmethylated DNA) [37].
MSP được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự methyl hóa DNA tại các đảo CpG. Phương pháp MSP có thể thực hiện được ở số lượng DNA nhỏ, có độ nhạy xác định được 1 allele bị methyl hóa trên 1.000 allele không có sự methyl hóa.
Phương pháp MSP phù hợp với các mẫu DNA thu nhận từ các mẫu mô đúc parafin [37, 58].
I.5.4.2. Phương pháp Nested MSP
Palmisano và cộng sự (2000) đã phát triển kĩ thuật Nested MSP làm tăng tính nhạy của phương pháp MSP khoảng 50 lần. Giai đoạn đầu tiên, phản ứng PCR diễn ra với cặp mồi đặc hiệu cho các trình tự gen đích nhận diện các khuôn DNA sau khi biến đổi bisulfite nhưng không phân biệt sự khác nhau giữa allele có sự methyl hóa và không có sự methyl hóa. Trong giai đoạn tiếp theo, hai phản PCR diễn ra riêng biệt với từng cặp mồi đặc hiệu cho allele bị methyl hóa DNA (Methylated DNA) hoặc allele không bị methyl hóa (Unmethylated DNA). Kết quả phản ứng Nested MSP được phân tích dựa vào kĩ thuật điện di trên gel agarose [37].
Nested MSP được Divine K. K và cộng sự (2006) sử dụng rộng rãi trong việc xác định sự methyl hóa của các gen thu nhận từ các mẫu đờm của các bệnh nhân đã được chẩn đoán lâm sàng bị ung thư phổi [37].
SVTH: Nguyễn Tấn Liêm Trang 21