Nem chua là một sản phẩm lên men truyền thống rất phổ biến và là một đặc sản của dân tộc Việt Nam, được ưa thích bởi vị chua tự nhiên và cấu trúc giòn, dai đặc trưng. Đây là mẫu sản phẩm lên men lactic thịt sống. Tuy nhiên, vấn đề chất lượng sản phẩm này hiện nay vẫn chưa được ổn định đang là mối quan tâm hàng đầu của người tiêu dùng lẫn người sản xuất nem chua. Bởi vì vi sinh vật trong lên men nem chua chủ yếu là hệ vi sinh vật tự nhiên, quy trình thực hiện vẫn chưa được tối ưu hóa.
TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
Khái quát về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic đã được sử dụng từ lâu trong nhiều loại thực phẩm lên men từ động vật và thực vật nhờ vào những lợi ích về dinh dưỡng, cảm quan và khả năng cải thiện tuổi thọ của sản phẩm.
Vi khuẩn lactic, thuộc họ Lactobacillaceae, được phân loại thành bốn giống chính: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc Hiện nay, nhóm vi khuẩn lactic còn được mở rộng để bao gồm cả Bifidobacterium Mặc dù các chủng vi khuẩn này có đặc điểm sinh thái khác nhau, nhưng chúng đều có những đặc tính sinh lý tương đối giống nhau.
Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn Gram dương, không di động và không sinh bào tử, có khả năng hô hấp kỵ khí hoặc kỵ khí tùy ý Chúng thực hiện quá trình lên men để chuyển hóa đường thành rượu và các sản phẩm khác trong điều kiện thiếu oxy LAB có khả năng tổng hợp các hợp chất cần thiết cho sự sống rất yếu, do đó chúng là sinh vật đa khuyết dưỡng đối với acid amin, nucleic bazơ và vitamin Chúng không có men hô hấp như xitocrom và catalaza, sinh sản bằng cách phân đôi tế bào Vi khuẩn lactic ưa ấm phát triển tốt ở 25-37°C, trong khi các loại ưa nhiệt thích hợp ở 50-65°C và nhóm ưa lạnh có thể phát triển ở 5°C hoặc thấp hơn LAB cũng có khả năng chịu nồng độ muối cao, với pH tối ưu gần điểm trung tính (pH=7).
Vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn quan trọng, trong đó acid lactic và acid acetic đóng vai trò chủ chốt Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn lactic còn tạo ra các phân tử có hoạt tính sinh học như ethanol, acid formic, các acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin và reutericyclin.
Một số vi khuẩn lactic trong nem chua
Có dạng túi cầu thường đính với nhau thành một cặp đôi hoặc bốn, phát triển từ
Vi khuẩn phát triển tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 20-30°C và không thể phát triển ở 45°C Chúng thực hiện quá trình trao đổi chất thông qua lên men đồng hình và là những vi khuẩn yếm khí tùy ý, có khả năng phát triển trên môi trường rắn có không khí Chủng vi khuẩn này yêu cầu dinh dưỡng rất cao từ môi trường, vì chúng không thể tự tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển Các loài Pediococcus khác nhau có mức độ chịu nhiệt, chịu axit và chịu NaCl khác nhau.
2.2 Lactobacillus Đây là những trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có thể lên men đồng hình hoặc dị hình Kích thức tế bào phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, các vi khuẩn dài từ 7-10àm Chỳng cú khả năng thủy phân đường saccaroza mạnh, nhiệt độ phát triển tối thích là 30-35 o C Lactobacillus có khả năng chịu được nồng độ muối cao hơn một số loại vi khuẩn khác Lượng lactobacillus có thể đạt tới 10 8 tế bào/g sản phẩm
Lactobacillus đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các hợp chất acid, chủ yếu là acid lactic, giúp acid hóa môi trường Quá trình này không chỉ dẫn đến sự đông tụ protein và ức chế vi khuẩn gây bệnh mà còn tạo màu sắc hấp dẫn cho sản phẩm Hơn nữa, lactobacillus còn góp phần vào việc hình thành hương vị đặc trưng của thịt lên men.
2.2 Miuscrococc Đây là các cầu khuẩn Gram dương, có hoạt tính catalaza, hiếu khí bắt buộc và có thể phát triển trong môi trường 5% NaCl Chủng này có khả năng khử Nitrat thành
Nitric đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện màu sắc cho sản phẩm thực phẩm Do đó, nó thường được bổ sung cùng với các chủng vi khuẩn sinh axit trong quá trình lên men thịt, nhằm thay thế cho các hóa chất tạo màu có thể gây hại cho sức khỏe con người.
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG LÊN
Phân lập
Nem được lấy ra sau 4 ngày lên men của 4 cơ sở:
Bà Chín ở Thủ Đức, Ninh Hòa tại Nha Trang, Giáo Thơ ở Lai Vung, Đồng Tháp và Vissan tại Tp Hồ Chí Minh là những địa chỉ nổi tiếng với sản phẩm nem Trong đó, nem Bá Chín và nem Ninh Hòa được chế biến qua quá trình lên men tự nhiên, trong khi nem Giáo Thơ và Vissan sử dụng giống khởi động để lên men.
1.2.1 Môi trường nuôi cấy và phân lập
- Thạch và canh MRS (Merck, pH= 5,7 ± 0,2) để phân lập, tăng sinh và giữ giống vi sinh vật.
- Môi trường MRS broth để tăng sinh.
- Môi trường MRD dùng để pha loãng.
- Môi trường carbohydrat dùng khảo sát khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn lactic phân lập.
Sử dụng các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thông dụng trong việc phân lập và xác định các đặc điểm sinh học của vi khuẩn lactic.
Sau khi tiệt trùng dao bằng cồn, dao được hơ trên ngọn lửa để loại bỏ hơi cồn và để nguội Tiếp theo, cắt nhỏ mẫu nem và lấy khoảng 10g cho vào bao PE vô trùng Sau đó, thêm dung dịch MRD vào bao theo tỉ lệ 9 MRD:1 nem Quá trình đồng nhất mẫu được thực hiện bằng máy Stomacher trong 2 phút, tạo ra huyền phù mẹ (S1).
1.2.2.2 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic
Pha loãng mẫu và cấy đĩa
Tiến hành pha loãng mẫu đến nồng độ 10^-7 bằng dung dịch MRD Sử dụng micropipet để hút 0,1ml dung dịch có nồng độ 10^-5, 10^-6 và 10^-7, sau đó cho vào đĩa petri Dùng que cấy đã khử trùng để trải đều dung dịch lên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô Lặp lại quy trình này hai lần cho mỗi nồng độ pha loãng.
Trình tự các thao tác được trình bày qua hình 3.1
Hình 3.1: Trình tự pha loãng cho việc đếm vi khuẩn lactic
Sau khi cấy xong, các đĩa petri sẽ được ủ kị khí ở 30ºC trong 48 giờ Quá trình ủ kị khí được thực hiện bằng cách đặt các đĩa petri vào trong bình hút ẩm, kèm theo ngọn đèn cồn đã thắp sáng và đậy nắp kín Khi ngọn đèn cồn tắt, điều này cho thấy oxy trong bình đã được tiêu thụ hoàn toàn.
Sau khi ủ ở 30ºC trong 48 giờ, quan sát đĩa petri bằng mắt thường để phát hiện vi khuẩn với các khuẩn lạc màu trắng nhỏ Việc phân loại khuẩn lạc dựa trên màu sắc, hình dạng và kích thước Kết quả ghi nhận về các dạng khuẩn lạc trong nem chua sau 4 ngày ở 4 cơ sở cho thấy tổng số dạng khuẩn lạc được phát hiện trong các mẫu nem khảo sát Dưới đây là các dạng khuẩn thường thấy trong nem chua.
Dạng I: Khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, có viền sáng xung quanh, rìa gọn, kích thước thay đổi từ 1-2 mm.
Dạng II: Khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, kích thước thay đổi từ 1-2 mm.
Hình 3.3: Khuẩn lạc dạng II
Dạng III: Khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, viền sáng, rìa không gọn, kích thước thay đổi từ 1-2mm.
Hình 3.4: Khuẩn lạc dạng III
Dạng IV: Khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng đục, trong, kích thước 2mm.
Hình 3.5: Khuẩn lạc dạng IV
Dạng V: khuẩn lạc tròn, vun cao,màu trắng sữa, kích thước 1mm.
Dạng VI: Khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng đục, rìa sáng, kích thước 2mm.
Hình 3.7: Khuẩn lạc dạng VI
Dạng VII: Khuẩn lạc tròn, vun cao, màu trắng hơi vàng, kích thước 2mm.
Hình 3.8: Khuẩn lạc dạng VII
1.2.5 Các chủng vi khuẩn phân lập
Sau khi quan sát bằng mắt thường, các dạng khuẩn lạc được ghi nhận dựa trên hình dạng và kích thước Mỗi dạng khuẩn lạc được cấy chuyền vào ống eppendorf vô trùng chứa 1ml canh MRS và ủ ở 37ºC trong 24 giờ Tiếp theo, cấy chuyền lên môi trường thạch MRS và ủ ở 37ºC trong 48 giờ để thực hiện các phản ứng sinh hóa Các ống eppendorf được bổ sung glycerol tiệt trùng với thể tích 10% dịch khuẩn và bảo quản đông lạnh để giữ giống Qua việc chọn các vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng nhỏ trên thạch, ta đã nuôi cấy được 20 chủng vi khuẩn lactic đồng nhất.
Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập
Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân lập
Nem Bà Chín Na1, Na2, Na3, Na4, Na5
Nem Ninh Hòa Nb1, Nb2, Nb3, Nb4, Nb5
Nem Giáo Thơ Nc1, Nc2, Nc3, Nc4, Nc5
Nem Vissan Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5
1.3 Định danh các chủng phân lập
Sau khi thu thập các chủng vi khuẩn đồng nhất, bước tiếp theo là xác định danh tính của các chủng này bằng phương pháp cổ điển, bao gồm việc khảo sát hình thái, sinh lý và hóa sinh.
Vi khuẩn lactic là loại vi khuẩn Gram dương, do đó, để xác định chúng, bước đầu tiên là thực hiện nhuộm Gram cho các tế bào non, thường là trong khoảng thời gian 24 giờ nuôi cấy Cần lưu ý rằng khi vi khuẩn lactic trưởng thành, chúng sẽ chuyển sang trạng thái Gram âm.
Khi tiến hành nhuộm Gram, trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương (Hình 3.9) và vi khuẩn E.coli Gram âm (Hình
3.10) có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng Sau đó tiến hành nhuộm Gram 20 chủng đã phân lập và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận
Sau khi ủ ở 37ºC trong 48 giờ, các chủng vi khuẩn được phân lập và nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100X Quá trình này cung cấp thông tin ban đầu về hình thái tế bào vi sinh vật, bao gồm khả năng bắt màu (Gram (+) hay Gram (-)), hình dạng vi khuẩn (hình que, cầu hay hình trứng) và cách sắp xếp của chúng (xếp chuỗi, bắt cặp hay riêng lẽ).
Hình thái tế bào của khuẩn lạc tiêu biểu có trong nem chua ở các dạng (Mục 1.2.4):
Hình 3.9: Vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 3.10: Vi khuẩn E.coli
Gram dương bắt màu tím Gram âm bắt màu đỏ
Hình 3.11: Trực khuẩn dạng I Hình 3.12: Trực khuẩn dạng II
Hình 3.13: Trực khuẩn dạng III Hình 3.14: Trực khuẩn dạng IV
Hình 3.15: Cầu khuẩn dạng V Hình 3.16: Trực khuẩn dạng VI
Hình 3.17: Trực khuẩn dạng VII
Trong số 20 chủng phân lập, một số chủng thể hiện Gram âm, trong khi các chủng Gram dương có hình thái và kích thước tế bào tương tự với các chủng khác cùng nguồn, dẫn đến sự giảm số lượng chủng Gram dương Qua quá trình nhuộm Gram, chúng ta đã nâng cao tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được chọn bằng cách loại bỏ một số chủng vi khuẩn gây bệnh Gram âm, chẳng hạn như vi khuẩn E.coli.
Thông qua nhuộm Gram, không chỉ xác định vi khuẩn là Gram âm hay Gram dương, mà còn có thể quan sát và mô tả hình thái của vi khuẩn Điều này cho phép phân loại các chủng Gram dương thành các dạng hình que và hình cầu, từ đó xác định số lượng các chủng khác nhau.
Sự khác biệt về dạng khuẩn lạc ở các cơ sở sản xuất có thể xuất phát từ hệ vi sinh vật trong thịt ban đầu, nguyên phụ liệu như đường và lá gói, cũng như các thao tác sản xuất và điều kiện môi trường chế biến Tại các cơ sở lên men định hướng, số lượng dạng khuẩn lạc thường ít hơn so với cơ sở lên men tự nhiên, do việc bổ sung vi sinh vật mong muốn ngay từ đầu giúp chúng phát triển mạnh và chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật, từ đó tạo ra sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong bột thịt.
Sau khi thực hiện nhuộm Gram, chúng ta đã thu được các chủng vi khuẩn với hình thái khuẩn lạc và tế bào khác nhau Một số chủng có hình thái khuẩn lạc tương tự nhưng lại khác nhau về hình dạng tế bào và nguồn phân lập Dựa vào kết quả nhuộm Gram và mô tả hình thái vi khuẩn, chúng ta đã xác định được một số chủng có khả năng là vi khuẩn lactic Tuy nhiên, vẫn tồn tại một số chủng Gram dương không phải là vi khuẩn lactic, do đó cần tiến hành các bước kiểm tra tiếp theo để sàng lọc những chủng có đặc điểm của vi khuẩn lactic theo mô tả trong Berger’s manual.
1.3.2 Phản ứng catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển H2O2 thành H2O và CO2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi bọt khí, sử dụng vi khuẩn Bacillus sb Có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương (Hình 3.19) Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính Đồng thời nhờ vào phản ứng catalase ta còn loại được một số vi khuẩn gây bệnh có thể có mặt trong sản phẩm thực phẩm làm nguồn phân lập, chúng có catalase dương tính như Staphyococcus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm;
Micrococcus, Corynebacterium spp là các vi khuẩn gây nhiễm trùng và cả E.coli gây tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa.
Khi thử nghiệm với H2O2 trên sinh khối của từng chủng vi khuẩn, chúng tôi quan sát thấy rằng một số chủng không tạo ra bong bóng (O2), điều này cho thấy sự thiếu hụt enzyme catalase Do đó, những chủng này đều được xác định là có kết quả catalase âm tính.
1.3.3 Khảo sát khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm
Tuyển chọn các chủng phân lập vi khuẩn lactic
2.1 Tiêu chí để tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
2.1.1 Khả năng kháng E.coli và Salmonnella
E.coli và Salmonnella là 2 vi khuẩn Gram âm, và cũng là các tác nhân gây nhiễm của vi sinh vật trong thực phẩm, là tác nhân gây bệnh cho cả người và động vật thông qua con đường tiêu hóa, chúng đồng thời cũng là vi khuẩn có hại trong đường ruột, gây ra các bệnh như tiêu chảy và đường ruột…Việc loại trừ các vi khuẩn này trong quá trình len men thịt được quan tâm nhằm đảm bảo chất lượng vi sinh lên men Nhiều nguyên cứu cho thấy vi khuẩn lactic thường ức chế các vi khuẩn gây bệnh theo nhiều cơ chế, chủ yếu là do các acid hữu cơ tạo thành và khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men và bacteriocin.
2.1.2 Khả năng kháng acid và muối mật
Các vi khuẩn ức chế có giá trị bệnh lý khi chúng có khả năng sống sót qua đường tiêu hóa, bao gồm khả năng chịu acid và muối mật, kháng vi sinh vật gây bệnh, và duy trì hoạt động tại ruột non và ruột già Vi khuẩn lactic, mặc dù thường sinh acid, lại không chịu được acid mạnh và phát triển tốt ở pH từ 4 đến 6,5 Khi lượng acid sinh ra quá nhiều, sự phát triển của vi khuẩn lactic sẽ bị ức chế Khả năng kháng acid và muối mật giúp vi khuẩn lactic tồn tại trong môi trường khắc nghiệt, cho phép chúng sống sót qua dạ dày và phát triển ở ruột, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe tại vùng ruột.
2.1.3 Khả năng phân giải protein
Hoạt tính protease của LAB, mặc dù thấp, đóng vai trò quan trọng trong việc giúp LAB thích nghi với môi trường thịt, cho phép chúng tự sản xuất yếu tố tăng trưởng Trong nguyên liệu nem chua có chứa các cơ chất tự nhiên của enzyme protease, giúp phân giải protein, từ đó đảm bảo quá trình lên men diễn ra hoàn toàn và nâng cao chất lượng nem chua.
Tốc độ lên men của vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng nem chua, ảnh hưởng đến cả vệ sinh an toàn thực phẩm và cảm quan Khi quá trình lên men diễn ra nhanh, các vi khuẩn có hại trong thịt sẽ bị ức chế, giúp sản phẩm an toàn hơn Ngược lại, nếu vi khuẩn lactic lên men chậm, các vi khuẩn gây bệnh có thể phát triển, làm giảm chất lượng và an toàn của thực phẩm, không đáp ứng được yêu cầu về cảm quan.
2.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
2.2.1 Khả năng kháng E coli và Salmonella
Có nhiều phương pháp để sàng lọc hoạt tính kháng sinh của vi khuẩn lactic, bao gồm spot on lawn assay, disc diffusion assay, well diffusion assay và phương pháp đo độ đục Trong số đó, phương pháp đo độ đục nổi bật nhờ tính đơn giản, độ nhạy cao và khả năng cung cấp cả kết quả định tính lẫn định lượng Phương pháp này được sử dụng để khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập, thông qua việc đánh giá ảnh hưởng của chất trong quá trình trao đổi chất của chúng với vi sinh vật chỉ thị.
Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức:
Nghiệm thức 1: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn E coli và
Salmonella bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB.
Nghiệm thức 2: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế của vi khuẩn E coli và
Salmonella bằng các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng
LAB nhưng đã được loại bỏ các yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa bằng dung dịch NaOH 1N.
Dịch nuôi cấy E coli và Salmonella (ủ 21 giờ, 37 0 C) pha loãng 10 -2 tương ứng nồng độ tế bào 10 5 tế bào/ml.
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS broth ủ kị khí 18-24h, ở 37 0 C, mang một nửa đi trung hòa về pH 6 bằng NaOH 1N, thanh trùng ở 80 0 C trong 10 phút, sau đó ly tâm
4000 vòng/ phút trong 15 giây, loại bỏ sinh khối.
Để thực hiện thí nghiệm, chuẩn bị ống thí nghiệm với 1 ml dịch nuôi cấy E coli và Salmonella nồng độ 10^5 tế bào/ml kết hợp với 1 ml dịch ly tâm LAB (có thể trung hòa hoặc không trung hòa), sau đó bổ sung 8 ml môi trường cao thịt-pepton và ủ ở 37°C trong 24 giờ Ống đối chứng sẽ có thành phần giống ống thí nghiệm, nhưng thay 1 ml dịch ly tâm LAB bằng 1 ml MRS broth đã tiệt trùng Cuối cùng, ống trắng bao gồm 9 ml môi trường cao thịt-pepton và 1 ml MRS broth đã tiệt trùng.
Tiến hành đo độ đục của tất cả các ống bằng máy quang phổ kế ở bước sóng610nm.
Hình 3.21: Thí nghiệm ủ E.coli và Salmonella với dịch nuôi cấy LAB ly tâm
Trong thí nghiệm, ống 1 chứa môi trường cao thịt-pepton không có vi sinh vật, trong khi ống 2 là ống đối chứng với E coli Ống 3 được sử dụng để thử nghiệm khả năng kháng E coli trong điều kiện không trung hòa với việc nuôi cấy LAB ly tâm Ngược lại, ống 4 là thí nghiệm kháng E coli có trung hòa Cuối cùng, ống 5 là ống đối chứng với Salmonella, và ống 6 được dành cho thí nghiệm kháng.
Salmonella nghiệm thức không trung hòa; Ống 7: ống thí nghiệm kháng
Salmonella nghiệm thức có trung hòa.)
Kết quả kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn E coli và Salmonella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các chủng vi khuẩn không trung hòa và đã trung hòa Nghiên cứu xác định được các chủng vi khuẩn có khả năng kháng hai loại vi khuẩn này cao nhất và thấp nhất Kết luận cho thấy khả năng kháng E coli và Salmonella của các chủng vi khuẩn chủ yếu phụ thuộc vào hàm lượng acid lactic được sinh ra.
2.2.2 Khả năng chịu acid và muối mật Để kiểm tra khả năng chịu acid vi khuẩn được cấy vào các môi trường MRS broth có giá trị pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và kiểm tra tính chịu muối mật với nồng độ muối mật trong môi trường MRS broth là 0.3% vì ở nồng độ này sự phát triển của vi khuẩn đã bị ức chế nhưng mỗi chủng có khả năng chịu đựng khác nhau và có giá trị cũng gần với nồng độ muối mật trong hệ tiêu hóa Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần với 2 ống nghiệm, mang ủ 24 giờ, sau đó tiến hành đo mật độ sinh khối. Ống đối chứng là ống có nuối cấy chủng vi khuẩn trong MRS broth có pH=7 và không chứa muối mật, được dùng làm đối chứng cho cả 1 thí nghiệm kiểm tra chịu acid và chịu muối mật.
Bảng kết quả kiểm tra khả năng chịu muối mật cho thấy một số chủng vi khuẩn có khả năng chịu muối mật cao Khi đưa một lượng vi khuẩn này vào môi trường có muối mật, sau 24 giờ, khả năng phát triển của chúng giảm còn 50% so với mức bình thường Điều này cho thấy chúng vẫn có khả năng sống sót trong đường tiêu hóa từ 15 phút đến 3 giờ, và phần sống sót này sẽ được đưa tới ruột để tiếp tục phát triển.
Trong môi trường chứa 0.3% muối mật, khả năng phát triển của các chủng vi khuẩn kiểm tra chỉ bị giảm, không hoàn toàn bị ức chế Điều này cho thấy các chủng vi khuẩn này vẫn có khả năng chịu đựng muối mật ở nồng độ 0.3%.
Hình 3.22: Thử nghiệm khả năng chịu acid
Dựa vào độ đục của các ống thí nghiệm, có thể thấy rằng khả năng phát triển của vi khuẩn tăng lên khi pH môi trường tăng Cụ thể, môi trường có pH 2 cho thấy sự phát triển yếu nhất của vi khuẩn.
Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng chịu acid của các chủng vi khuẩn phụ thuộc vào môi trường pH Sau 24 giờ ủ trong các môi trường có độ pH khác nhau, khả năng sống sót và phát triển của các chủng vi khuẩn giảm dần theo sự giảm của pH Điều này chứng tỏ rằng nồng độ acid trong môi trường ban đầu có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của chúng.
2.2.3 Năng lực phân giải protein
Các chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS dịch thể ở nhiệt độ 37°C trong 72 giờ, sau đó ly tâm để thu dịch trong Hoạt tính phân giải cazein và gelatin được xác định bằng phương pháp khoan lỗ thạch, với thời gian ủ 48 giờ ở 37°C Kết quả được ghi nhận bằng cách đo đường kính vòng phân giải trên các đĩa petri.
Hình 3.23: Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp bán định lượng
Kết quả cho thấy khả năng phân giải protein của các chủng được nghiên cứu Chúng tôi đã xác định xem tất cả các chủng có khả năng phân giải protein hay không, đồng thời xác định chủng nào có hoạt tính phân giải mạnh nhất.