III. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG LÊN
2. Tuyển chọn các chủng phân lập vi khuẩn lactic
2.2. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
Có nhiều phương pháp được sử dụng để sàng lọc hoạt tính kháng sinh vi sinh vật của vi khuẩn lactic như spot on lawn assay, disc diffusion assay, well diffusion assay hoặc phương pháp đo độ đục (turbidimetric method). Phương pháp cuối cùng đơn giản, độ nhạy cao, mang tính định tính và cả định lượng, nên được sử dụng để sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập nhằm xác định khả năng kháng vi sinh vật của chúng. Phương pháp này chủ yếu khảo sát sự ảnh hưởng của chất trong quá trình trao đổi chất của chủng vi khuẩn với vi sinh vật chỉ thị.
Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức:
Nghiệm thức 1: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn E. coli và Salmonella bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB.
Nghiệm thức 2: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế của vi khuẩn E. coli và Salmonella bằng các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB nhưng đã được loại bỏ các yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa bằng dung dịch NaOH 1N.
Chuẩn bị:
Dịch nuôi cấy E. coli và Salmonella (ủ 21 giờ, 370C) pha loãng 10-2 tương ứng nồng độ tế bào 105 tế bào/ml.
Dịch nuôi cấy LAB trong MRS broth ủ kị khí 18-24h, ở 370C, mang một nửa đi trung hòa về pH 6 bằng NaOH 1N, thanh trùng ở 800C trong 10 phút, sau đó ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 giây, loại bỏ sinh khối.
Cách thực hiện:
Ống thí nghiệm: gồm 1 ml dịch nuối cấy E. coli và Salmonella nồng độ 105 tế bào/ml với 1ml dịch ly tâm LAB (trung hòa hoặc không trung hòa), bổ sung 8 ml môi trường cao thịt-pepton. Ủ hiếu khí 370C, 24 giờ.
Ống đối chứng: giống ống thí nghiệm, nhưng 1 ml dịch ly tâm LAB được thay bằng 1ml MRS broth đã tiệt trùng.
Ống trắng: gồm 9 ml môi trường cao thịt-pepton và 1 ml MRS broth đã tiệt trùng
Tiến hành đo độ đục của tất cả các ống bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 610nm.
Hình 3.21: Thí nghiệm ủ E.coli và Salmonella với dịch nuôi cấy LAB ly tâm (Ống 1: mẫu trắng là môi trường cao thịt-pepton không cấy vi sinh vật; Ống 2:
ống đối chứng E. coli; Ống 3: ống thí nghiệm kháng E. coli nghiệm thức không trung hòa nuôi cấy LAB ly tâm; Ống 4: ống thí nghiệm kháng E. coli nghiệm thức
có trung hòa; Ống 5: ống đối chứng Salmonella; Ống 6: ống thí nghiệm kháng Salmonella nghiệm thức không trung hòa; Ống 7: ống thí nghiệm kháng
Salmonella nghiệm thức có trung hòa.)
Cuối cùng sẽ có được kết quả kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn E. coli và vi khuẩn Salmonella của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và sau khi trung hòa. Xác định được những chủng vi khuẩn nào có khả năng kháng được hai vi khuẩn trên cao nhất và thấp nhất. Và có thể kết luận khả năng kháng E.coli và Salmonella của các chủng vi khuẩn vẫn do hàm lượng acid lactic sinh ra là chủ yếu hay không.
2.2.2. Khả năng chịu acid và muối mật
Để kiểm tra khả năng chịu acid vi khuẩn được cấy vào các môi trường MRS broth có giá trị pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và kiểm tra tính chịu muối mật với nồng độ muối mật trong môi trường MRS broth là 0.3% vì ở nồng độ này sự phát triển của vi khuẩn đã bị ức chế nhưng mỗi chủng có khả năng chịu đựng khác nhau và có giá trị cũng gần với nồng độ muối mật trong hệ tiêu hóa. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần với 2 ống nghiệm, mang ủ 24 giờ, sau đó tiến hành đo mật độ sinh khối.
Ống đối chứng là ống có nuối cấy chủng vi khuẩn trong MRS broth có pH=7 và không chứa muối mật, được dùng làm đối chứng cho cả 1 thí nghiệm kiểm tra chịu acid và chịu muối mật.
Sau đó đưa ra bảng kết quả kiểm tra khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn. Ta xác định được có một số chủng có khả năng chịu muối mật cao. Khi một lượng vi khuẩn này được đưa vào môi trường có muối mật thì sau 24 giờ khả năng phát triển của chúng còn 50% so với bình thường. Từ đó ta có suy ra được chúng vẫn có khả năng sống sót khi trong đường tiêu hóa khoảng 15 phút đến 3 giờ và phần sống sót này sẽ được đưa tới ruột để tiếp tục phát triển.
Tóm lại, từ bảng kết quả ta sẽ biết trong môi trường chứa 0.3% muối mật khả năng phát triển của các chủng vi khuẩn kiểm tra chỉ bị giảm chứ không hoàn toàn bị ức chế nên kết luận chúng vẫn có khả năng chịu được muối mật ở nồng độ 0.3% hay không.
Hình 3.22: Thử nghiệm khả năng chịu acid
Dựa và độ đục của các ống thí nghiệm trong hình 3.22 ta thấy khả năng phát triển của vi khuẩn tăng theo sự tăng của pH môi trường, trong đó môi trường có pH = 2 là vi khuẩn phát triển yếu nhất.
Còn đối với kết quả khả năng chịu acid của các chủng. Sau khi ủ 24 giờ trong các môi trường có độ pH khác nhau, các chủng vi khuẩn kiểm tra coi có khả năng sống
sót và coi khả năng phát triển giảm dần theo sự giảm của pH. Rồi từ đó ta có thể chứng tỏ nồng độ acid trong môi trường ban đầu có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của chúng hay không.
2.2.3. Năng lực phân giải protein
Những chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn được nuôi cấy trên môi trường MRS dịch thể trong 72h/37oC sau đó ly tâm thu lấy dịch trong. Việc xác định hoạt tính phân giải cazein và gelatin được tiến hành theo phương pháp khoan lỗ thạch (phương pháp định lượng). Sau khi ủ 48 giờ trong tủ ấm 37o C, các đĩa peptri được lấy ra để đo đường kính vòng phân giải (Hình 3.23).
Hình 3.23: Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp bán định lượng Cuối cùng ta có được kết quả năng lực phân giải protein của các chủng. Xem các chủng đều có khả năng phân giải protein hay không và chủng nào thể hiện hoạt tính phân giải mạnh nhất.
2.2.4. Tốc độ lên men
Các chủng vi khuẩn được cấy vào các môi trường chứa các loại đường khác nhau và được ủ 24 giờ sau đó tiến hành đọc kết quả thông qua các đặc điểm sau:
Nếu ống nghiệm chứa môi trường bị đục chứng tỏ có hiện diện của sinh khối và vi khuẩn có khả năng sử dụng loại đường đó.
Khi cho thuốc thử xanh bromophenol vào nếu thuốc thử đổi màu đỏ, chứng tỏ vi khuẩn có khả năng lên men đường tạo acid. Nếu thuốc thử không đổi màu, điều này chứng tỏ vi khuẩn không lên men đường (Hình 3.24).
Nếu vi khuẩn đó có khả năng lên men đường và trong ống durham có bọt khí tạo ra, đó chính là khí CO2. Ngoài ra đối với những ống không có bọt khí trong ống durham, ta khẳng định lại bằng việc nung đỏ que cấy và đặt sát phía trên bề mặt môi trường, nhưng không chạm vào dung dịch nếu có những bọt khí li ti nổi lên thì ta vẫn kết luận đó là lên nem dị hình. Nếu không có bọt khí tạo ra thì dó là lên men đồng hình. Kết hợp với phản ứng sử dụng thuộc thử Uffelmann, ta có thể kết luận đây là những chủng có khả năng lên men loại đường đó tạo acid lactic.
Hình 3.24: Thử nghiệm khả năng lên men đường
(Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường; Ống 2: Vi khuẩn lên men đồng hình; Ống 3:
Vi khuẩn lên men dị hình)
` Khi có được kết quả thì ta biết được tốc độ lên men của chủng vi khuẩn từ đó suy ra được chủng vi khuẩn có được lên men ức chế hay không.