1.5. Các đột biến của gen CYP21A2 gây thiếu 21-OH
1.6.1. Phân tích các đột biến xóa đoạn và hoán vị lớn của gen
Có khuyến cáo cho rằng thuật ngữ hoán vị lớn của gen “large gene conversion” nên ngừng sử dụng bởi vì cả xóa đoạn lớn và hoán vị lớn của gen
đều xuất hiện do hậu quả của trao đổi chéo không cân xứng trong quá trình giảm phân [80].
Cả hoán vị và xóa đoạn lớn của gen là do sự trao đổi chéo không cân xứng và đã được phân tích bằng kỹ thuật Southern blotting. Kỹ thuật này được sử dụng trong một thời gian dài và được coi như không có kỹ thuật khác thay thế để đảm bảo có cùng tính chính xác [80],[81],[82]. Nhưng đây là một tiếp cận vất vả và tốn kém thời gian, không thích hợp cho các trường hợp cần có kết quả trả lời nhanh như chẩn đoán trước sinh, hơn nữa nhược điểm lớn của phương pháp này là cần sử dụng phóng xạ, yêu cầu có lượng lớn DNA có chất lượng cao. Mặc dù Southern blotting không sử dụng phóng xạ trong phân tích CYP21A2 đã khắc phục được nhược điểm nhưng chỉ được sử dụng ở quy trình tại labo nghiên cứu [79].
Các kỹ thuật khác đã được nghiên cứu để phát hiện số lượng các bản sao như “real-time quantitative PCR” [83], và đã góp phần rút ngắn thời gian phân tích, có thể xác định được số lượng các bản sao của gen và tình trạng tái tổ hợp giữa gen chức năng và giả gen một cách tin cậy. Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng không thích hợp để xác định một cách chi tiết các sắp xếp lại phức tạp của gen chẳng hạn khi có hơn 2 bản sao của gen/hoặc giả gen cũng như khi cân nhắc sự đa dạng của giả gen.
Các phương pháp “locus-specific PCR amplification” với sự kết hợp các primer khác nhau đã được nghiên cứu như một tiếp cận khác thay thế cho phân tích Southern blot [84],[85]. Tuy nhiên, phương pháp này không phải là tiếp cận thích hợp cho tất cả các labo [84],[86].
Một tiếp cận mới gần đây đã chứng tỏ có sự tiến bộ rõ rệt về mặt kỹ thuật để phát hiện các xóa đoạn/hoán vị gen, sắp xếp lại của gen và hợp nhất của gen là phương pháp khuếch đại đầu dò đa mồi dựa vào phản ứng nối (multiplex ligation-dependent probe amplification – MLPA) (www.mrc-
holland.com). Kỹ thuật này có những ưu điểm nổi bật là tiết kiệm thời gian để phân tích (48 giờ), chính xác, và thích hợp để phát hiện số lượng các bản sao của gen và chỉ cần lượng nhỏ DNA (25 - 250 ng). Các đầu dò đặc hiệu cho các vị trí khác nhau được cho vào mẫu bệnh phẩm DNA, sau đó được khuyếch đại và được lượng hóa và so sánh với mẫu DNA chuẩn. Khuếch đại PCR đầu dò phụ thuộc vào sự có mặt của trình tự mà đầu dò hướng tới của bệnh phẩm. Mỗi một đầu dò bao gồm 1 primer tổng hợp và một primer M13 chuẩn, mà sẽ lai với các vị trí sát ngay với trình tự mong muốn. Các primer đầu dò lai được nối và sau đó được khuyếch đại PCR. Sự khuếch đại kết hợp đồng thời cùng lúc bởi một cặp primer PCR được diễn ra thuận tiện bởi primer và trình tự đúng. Mỗi đầu dò sẽ cho ra sản phẩm khuếch đại có chiều dài nhất định mà có thể phân tích được trên máy sequencer tự động [87]. Kit thương mại cho locus của CYP21A2 bao gồm các đầu dò đặc hiệu cho 5‟
CYP21A2 và 3‟ CYP21A1P. Một thử nghiệm bao gồm 15 đầu dò đặc hiệu để phân tích locus của gen CYP21A2 với 5 đầu dò đặc hiệu cho gen CYP21A2 và 3 đầu dò đặc hiệu cho gen CYP21A1P. Cũng như một đầu dò cho mỗi C4 (A và B), 3 đầu dò cho TNXB và 1 đầu dò cho gen CREBL1. Các đầu dò cho CYP21A2 và CYP21A1P được thiết kế trên những điểm đặc trưng để phân biệt giữa hai gen. MLPA đã chứng tỏ sự tiện lợi để phát hiện các xóa đoạn/lặp đoạn hoặc sắp xếp lại phức tạp của gen ở các bệnh nhân có số lượng khác nhau của đơn vị RCCX ở trên 2 allele. Tuy nhiên cũng cần lưu ý đến việc nhận định kết quả của MLPA đòi hỏi kinh nghiệm toàn diện trong phân tích gen CYP21A2, đặc biệt là cần đánh giá cẩn thận hai khía cạnh: sự biến đổi của trình tự giả gen có thể làm thay đổi kết quả mong đợi và vấn đề sử dụng nội kiểm. Một loạt các nghiên cứu gần đây đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện các đột biến xóa đoạn/lặp đoạn của gen CYP21A2 ở nhiều nước khác nhau [88],[89],[90],[91].
Hạn chế của kỹ thuật MLPA bao gồm: hạn chế lớn nhất là dương tính giả xảy ra trong các trường hợp các đột biến/đa hình có vị trí ở vùng gắn với đầu dò và ở vị trí nối, điều này sẽ ngăn cản quá trình lai đầu dò và nối [92].
Bởi vậy, “long - range PCR” hoặc giải trình tự trực tiếp nên được tiến hành để xác định lại các xóa đoạn một exon được phát hiện bởi MLPA.
Đối với mỗi phương pháp thì việc phát hiện nhiều bản sao của gen gấp 3 hay 4 lần thì đều có khó khăn [93].