Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Nhận định và đánh giá các đột biến của gen CYP21A2
Các đột biến phát hiện được ở các bệnh nhân được viết theo danh pháp ở dạng thay đổi của nucleotid trong phân tử cDNA và ở dạng thay đổi của protein đột biến theo danh pháp “Genome Variation Nonmenclature”
(http://www.hgvs.org/mutnomen/). Đối với cDNA thì danh pháp được đánh số bắt đầu từ nucleotid A của bộ ba mã hóa cho acid amin đầu tiên (HGVS Recommendations for the description of sequencing variants: 2016 update.
Hum Mutat. 2016).
2.3.3.2. Nhận định các đột biến
Trình tự gen CYP21A2 thu được sau khi giải trình tự cho các bệnh nhân nghiên cứu sẽ được so sánh với trình tự gen CYP21A2 tham khảo ở “reference sequencing NM_000500.2”
Các đột biến của CYP21A2 phát hiện được ở các bệnh nhân nghiên cứu sẽ được so sánh với dữ liệu từ Human Gene Mutation database (HGMD)
http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=CYP21A2 và so sánh với dữ liệu của uỷ ban danh pháp Cytochrome P450 allele người. Gen CYP21A2 tại http://www.cypalleles.ki.se/cyp21.htm
Đối với các đột biến chưa được báo cáo tại các cơ sở dữ liệu trên đây sẽ được kiểm tra đối chiếu với dữ liệu tại 1000 genomes database tại
"MutationTaster". http://www.mutationtaster.org. Đột biến nào chưa được báo cáo tại các cơ sở dữ liệu trên đây sẽ được coi là đột biến mới (novel mutation) hay đột biến chưa được báo cáo (unreported mutation).
2.3.4. Đánh giá kiểu hình của các bệnh nhân và mối tương quan giữa kiểu gen - kiểu hình
1.3.4.1. Đánh giá kiểu hình
Đánh giá kiểu hình: dựa trên kết quả các dữ liệu nghiên cứu lâm sàng (tại thời điểm chẩn đoán, tiền sử và diễn biến trong quá trình theo dõi điều trị), chẩn đoán hình ảnh và xét nghiệm sinh hóa. Đối với các bệnh nhân được chẩn đoán sớm (< 5 ngày sau sinh) và được điều trị hormon thay thế sớm, trước khi có các biểu hiện mất muối trên lâm sàng, và bất thường điện giải đồ huyết thanh thì đánh giá thể mất muối dựa trên theo dõi diễn biến trong quá trình theo dõi điều trị, và khẳng định thể MM khi bệnh nhân có các biểu hiện
suy thượng thận cấp, mất nước, mất muối (Na+ huyết thanh hạ và K+ huyết thanh tăng cao). Phân loại kiểu hình: theo tiêu chuẩn lâm sàng và hóa sinh của Pang S, Clark A. 1993 [26].
- Thể cổ điển mất muối (MM): cả ở trẻ trai và trẻ gái có biểu hiện chậm tăng cân/sụt cân sau đẻ, nôn, mất nước, Na+ huyết thanh < 130 mmol/l, hoặc 130- 135 mmol/l kết hợp với K+ huyết thanh > 5,5 mmol/l, tăng hoạt độ renin. Kết hợp với nam hóa bộ phận sinh dục ngoài, mơ hồ giới tính (mức độ nặng theo phân loại của Prader) ở trẻ gái (phụ lục 2) [17]. Nồng độ 17-OHP huyết thanh tăng > 100 ng/ml.
- Thể cổ điển nam hóa đơn thuần (NHĐT): mơ hồ giới tính ở trẻ gái, dậy thì sớm ngoại biên ở trẻ trai, tăng chiều cao và tuổi xương ở cả hai giới, không có biểu hiện lâm sàng của mất muối, hoạt độ renin không tăng, điện giải đồ huyết thanh bình thường. Nồng độ 17-OHP huyết thanh tăng > 100 ng/ml.
- Thể không cổ điển: không có hoặc nam hóa nhẹ bộ phận sinh dục ngoài sau sinh ở trẻ gái, các triệu chứng của tăng androgen sau sinh như: mọc lông mu và lông nách sớm ở tuổi tiền dậy thì ở cả trẻ trai và gái, rậm lông và rối loạn vòng kinh ở tuổi vị thành niên. Nồng độ 17-OHP huyết thanh trước kích thích bằng ACTH từ 2 - 100 ng/ml, 60 phút sau kích thích bằng ACTH từ 10 - 100 ng/ml.
2.3.4.2. Đánh giá mối tương quan kiểu gen - kiểu hình
Để đánh giá tương quan kiểu gen - kiểu hình, các đột biến gây bệnh được chia thành 4 nhóm dựa theo dữ liệu về hoạt độ 21-OH đã được nghiên cứu in vitro và đã được đề xuất bởi Krone N và cộng sự có bổ xung [57].
- Nhóm “null” (0): bao gồm các bệnh nhân mang các đột biến gây mất toàn bộ hoạt độ enzym: xóa đoạn, exon 6 cluster, p.L307FfsX6, p.Q318X, p.R356X, và các đột biến mới gây lệch khung dịch mã trên cả 2 allele.
- Nhóm A: bao gồm các bệnh nhân đồng hợp tử đột biến trên intron 2 (c.290-13A/C>G hay I2g), hoặc có một allele là đột biến I2g và allele khác là
đột biến trong nhóm “null”. Đột biến I2g được biết là còn lượng hoạt độ enzym rất nhỏ.
- Nhóm B: bao gồm các bệnh nhân mang đột biến p.I172N (hoạt độ enzym còn khoảng 2%) đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép với các đột biến của nhóm “null” hoặc A, hoặc hoán vị gen promoter + p.P30L.
- Nhóm C: bao gồm các bệnh nhân mang đột biến p.P30L, p.V281L (còn khoảng 20-60% hoạt độ enzym) đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép với các đột biến của nhóm “null”, hoặc A, hoặc B.
- Nhóm D: bao gồm các bệnh nhân mang các đột biến chưa đánh giá được ảnh hưởng của đột biến trên hoạt độ enzym và các bệnh nhân chưa xác định được đột biến.
Kiểu hình được dự báo kết hợp với các nhóm kiểu gen “null” và A là thể cổ điển MM, với nhóm kiểu gen B là cổ điển NHĐT, và nhóm kiểu gen C là thể không cổ điển.
Giá trị dự báo dương tính (positive predictive value – PPV) được tính bằng số bệnh nhân có kiểu hình đúng như dự báo của mỗi nhóm kiểu gen chia cho tổng số bệnh nhân của nhóm đó và nhân với 100. Cụ thể như sau:
PPV-0 = n bệnh nhân thể MM của nhóm “null”/tổng số bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm “null” x 100;
PPV-A = n bệnh nhân thể MM trong nhóm A/tổng bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm A x 100;
PPV-B = n bệnh nhân thể NHĐT trong nhóm B/tổng số bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm B x 100;
PPV-C = n bệnh nhân thể không cổ điển trong nhóm C/tổng số bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm C x 100.
Để đánh giá tương quan giữa mức độ nặng của nam hóa bộ phận sinh dục ngoài với kiểu gen của các bệnh nhân nữ thì tỷ lệ của các mức độ nam hóa giữa các nhóm kiểu gen khác nhau được so sánh.
Để đánh giá tương quan kiểu gen và kiểu hình dấu ấn sinh học nồng độ 17-OHP, testosterone, progesterone và điện giải đồ trong huyết thanh thì trị số trung bình, trung vị của nồng độ các chất này trong huyết thanh của các bệnh nhân của từng nhóm kiểu gen “null”, A, B, C được so sánh với nhau.