1.5. Các đột biến của gen CYP21A2 gây thiếu 21-OH
1.6.2. Các tiến bộ về phát hiện các đột biến điểm và các biến đổi nhỏ phổ biến và hiếm gặp của gen CYP21A2
Như đã được đề cập ở các phần trên đây thì gen CYP21A2 bao gồm 10 exon và các intron ngắn, điều này cho phép khuếch đại toàn bộ vùng bao gồm exon-intron. Hơn nữa, 9 đột biến có nguồn gốc từ giả gen CYP21A1P chiếm tới 90 - 95% các đột biến điểm/xóa đoạn nhỏ/thêm đoạn nhỏ ở các bệnh nhân thiếu 21-OH. Tuy nhiên, hiện tượng này lại gây ra một khó khăn lớn cho các kỹ thuật để phân tích đột biến bởi vì chúng ta phải khuếch đại đặc hiệu gen chức năng CYP21A2 và phải tránh khuếch đại phải giả gen không có chức năng CYP21A1P.
Các phương pháp nhanh khác nhau để phát hiện các đột biến phổ biến này và các kỹ thuật cũng đã được nghiên cứu như: “allele-specific oligonucleotide hybridization” (ASO) [41],[94], “allele -specific PCR amplification” (ARMS) [95], “real-time PCR” để phát hiện các đột biến phổ biến đã được mô tả [47] và có ưu điểm là sẽ không phải tiến hành các kỹ thuật sau phản ứng. Các kỹ thuật này đều có hạn chế là cần nhiều thao tác bằng tay so với những tiếp cận kết hợp như “ligation detection reaction” (LDR) [96] và
“multiplex minisequencing” [85],[97]. Tất cả các kỹ thuật đều phải cân nhắc tới vấn đề khó khăn khi khuếch đại đặc hiệu gen CYP21A2 do trình tự giống nhau với giả gen. Sự giống nhau này có thể gây nên sai lệch kết quả và allele
hiếm khi mà trình tự của bệnh nhân có mặt của nucleotide có nguồn gốc từ giả gen ở vùng đã được sử dụng để thiết kế primer đặc hiệu.
Một trong các quy trình sàng lọc nhanh và chính xác nhất đối với các đột biến này đã được tiến hành bởi Krone và cộng sự (2002) [97]: trong nghiên cứu này thì trước hết PCR đặc hiệu cho CYP21A2 được tiến hành, sau đó là phản ứng minisequencing 12-plex. Nghiên cứu này cũng bao gồm PCR phát hiện nhanh đột biến mất 8 bp của exon 3 để loại trừ xóa đoạn và hoán vị lớn của gen. Phương pháp này đã đưa đến kết quả sánh với phương pháp PCR định lượng của Olney và cộng sự [47]. Phương pháp minisequencing chỉ yêu cầu một phản ứng đối với mẫu DNA; việc nhận định các kiểu đỉnh đơn giản và có thể tự động hoá. Do ưu điểm rút ngắn được thời gian và giá thành thấp nên phương pháp đã được sử dụng như bước thứ phát để khẳng định bệnh ở các ca dương tính giả của chương trình sàng lọc sơ sinh [98].
Liên quan đến vấn đề giá thành và tần suất xuất hiện các đột biến ở một số chủng tộc ví dụ ở các bệnh nhân người Ý, tỷ lệ rất thấp các bệnh nhân mang một số đột biến trong số 9 đột biến phổ biến (đặc biệt hiếm đối với đột biến del(8) bp E3, cluster E6 và p.L307FfsX6 chiếm dưới 0,8%) và tỷ lệ cao các bệnh nhân (khoảng 5%) mang hơn một đột biến gây bệnh, trong đó có những đột biến rất hiếm mà Balsamo A và cộng sự (2010) đã đề xuất quy trình phân tích đột biến gen CYP21A2 ở các bệnh nhân thiếu 21-OH [93]:
Trong quy trình này thì:
i/ Ở các ca bệnh chỉ điểm (proband): khuếch đại đặc hiệu gen CYP21A2 ở ba đoạn chồng lên nhau sử dụng primer PCR đặc hiệu sau đó giải trình tự trực tiếp tự động hoá toàn bộ gen và vùng proximal promoter (từ nt. - 420 đến nt. +2907), sử dụng bộ primer chuẩn đã được thiết kế trước đó bởi Barbaro và cộng sự (2004) [99]. Hơn nữa, các primers để giải trình tự được sử dụng cho các allele đặc hiệu và khẳng định đột biến trên cả hai sợi. Với
phương pháp này tác giả có thể xác định được: (a) tất cả các đột biến gây bệnh bao gồm các đột biến phổ biến, đột biến hiếm, và đột biến mới chưa báo cáo trong y văn; (b) sự có mặt của các nucleotid có nguồn gốc từ giả gen có thể hình thành hiện tượng allele không được phát hiện (allele dropout), quy trình PCR/giải trình tự có thể được tiến hành để phân tích các allele ẩn này.
Hơn nữa, sự vắng mặt của đoạn PCR cho thấy sự vắng mặt hoàn toàn của gen CYP21A2 (đột biến xóa đoạn lớn đồng hợp tử), và đồng hợp tử cho tất cả các nucleotide đa hình (single nucleotide polymorphisms - SNPs) đã biết gợi ý khả năng xóa đoạn CYP21A2 trên một allele (dị hợp tử xóa đoạn).
ii/ Phân tích DNA của bố mẹ không những khẳng định các đột biến đã được phát hiện và sự phân ly của các đột biến này và xác định tình trạng người lành mang gen, mà còn có ý nghĩa phân tích tính phân ly của các SNPs trong từng gia đình cụ thể, điều này sẽ hỗ trợ giả thiết có sự tồn tại của xóa đoạn hay hoán vị lớn của gen trên một allele;
iii/ Phân tích MLPA ở tất cả các trường hợp nghi ngờ xóa đoạn/lặp đoạn của gen, hoặc có tái sắp xếp phức tạp của gen hoặc không có sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình.
Sự khuếch đại phức hợp gen CYP21A2/CYP21A1P [84] được tiến hành thường quy trong quá khứ dần dần bị loại bỏ nhờ độ tin cậy tăng lên của dữ liệu MLPA.
Với quy trình này, các tác giả đã xác định được trên 98% các allele gây thiếu 21-OH và đã phân tích > 1000 allele và đã nhận thấy có mối tương quan lớn về kiểu gen - kiểu hình. Điều này có ý nghĩa lớn trong thực hành lâm sàng, đặc biệt khi có chỉ định chẩn đoán trước sinh cho các trường hợp có nguy cơ cao mang thai ngoài ý muốn [93].
Tóm lại, có nhiều cách tiếp cận khác nhau để phát hiện hầu hết các đột biến phổ biến đã được nghiên cứu và ứng dụng bao gồm: “allele specific
oligonucleotide hybridization” (ASO) [94]; “allele specific PCR amplification” (ARMS) [95]; “ligation detection reaction” (LDR) [96]; “Real- time PCR” [47]; “phân tích DHPLC” [100] và “multiplex minisequencing”
[85],[97]. Tuy nhiên, giải trình tự trực tiếp gen CYP21A2 là cách tiếp cận tốt nhất để đảm bảo các đột biến hiếm gặp và đột biến mới không bị bỏ sót và phương pháp này cho phép phát hiện 100% các đột biến hiếm. Ngày nay, nhiều labo trong đó có nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp để phân tích đột biến gen CYP21A2 [90],[101],[102],[103],[104],[105],[106],[107]. Những năm gần đây, kỹ thuật và hệ thống giải trình tự mới đã được ứng dụng cho phép phân tích kết quả nhanh với vật liệu sử dụng lớn [108].