3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát một số đặc điểm nông sinh học của tập đoàn các giống lúa nếp địa phương
* Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí tuần tự không nhắc lại Mỗi ô thí nghiệm cấy 5 hàng dài 5 m.
- Kỹ thuật cấy:
+ Mật độ: 45 khóm/m2.
+ Khoảng cách: 20cm x 11cm.
+ Cấy 1 dảnh.
* Phân bón:
- Lượng bón cho 1 ha là: 120kg N + 90 kg P2O5 + 60 kg K2O . - Cách bón:
+ Bón lót: 100% P2O5 + 30% N
+ Bón thúc lần 1: 40% N + 50% K2O khi lúa bén rễ hồi xanh kết hợp làm cỏ sục bùn.
+ Bón thúc lần 2: 30% N + 50% K2O khi lúa đứng cái, làm đòng.
Các chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu theo dõi dựa theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá của viện
lúa Quốc tế (IRRI, 1996) .
* Trước khi cấy:
Trước khi cấy lấy 20 cây ngẫu nhiên của mỗi dòng giống để đo đếm các chỉ tiêu sau:
+ Tuổi mạ + Số lá mạ
+ Chiều cao cây mạ + Màu sắc lá mạ
+ Sức sinh trưởng (cho điểm 1,3,5,7,9 theo thang điểm của IRRI):
Điểm 1: Rất mạnh Điểm 3: Mạnh
Điểm 5: Bình thường Điểm 7: Yếu
Điểm 9: Rất yếu
*Từ cấy đến thu hoạch
Mỗi ô thí nghiệm theo dõi 5 khóm cố định.
Thời gian từ cấy đến:
- Bén rễ hồi xanh: khi có 85% số cây bến rễ hồi xanh.
- Bắt đầu đẻ nhánh: 10% số cây có nhánh đẻ dài 1 cm nhô khỏi bẹ lá.
- Kết thúc đẻ nhánh: Khi những khóm theo dõi có số nhánh không đổi.
- Ngày bắt đầu trỗ: 10% số cây có tối thiểu 1 bông trổ lên khỏi bẹ lá đòng.
- Ngày kết thúc trỗ: 85% số bông của các khóm trỗ ra khỏi bẹ lá đòng 5cm.
- Thời gian sinh trưởng từ gieo đến thu hoạch.
Màu sắc thân lá khi đẻ nhánh rộ.
Tổng số nhánh trên khóm, nhánh hữu hiệu trên khóm, tỷ lệ nhánh hữu hiệu trên khóm.
Một số chỉ tiêu về lá đòng: Chiều dài, chiều rộng, màu sắc và góc lá đòng, phủ lông.
* Theo dõi tình hình sâu bệnh:
+ Theo dõi, đánh giá và cho điểm theo thang của IRRI một số loại sâu bệnh chính thường gặp trên đồng ruộng ở vụ mùa như: sâu cuốn lá, sâu đục thân, bệnh đạo ôn, bệnh khô vằn và bệnh bạc lá.
* Sau thu hoạch
Mỗi dòng lấy 5 khóm, nhổ cả gốc, rửa sạch, đeo thẻ, phơi khô rồi đo đếm các chỉ tiêu sau:
+ Chiều cao cây cuối cùng.
+ Số bông hữu hiệu/ khóm.
+ Số hạt/ bông.
+ Tỷ lệ hạt chắc/bông.
+ Khối lượng 1000 hạt.
+ Năng suất lý thuyết.
3.3.2 Lây nhiễm nhân tạo và đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của tập đoàn các giống lúa nếp địa phương
- Lây nhiễm khi lúa đang ở giai đoạn làm đòng, trỗ bông.
- Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Wakimoto Khoai tây: 300,0(g)
Ca(NO3)2.4H2O: 0.5 (g) Na2HPO4.4H2O: 2,0 (g) Pepton : 5,0 (g) Saccarose : 15,0 (g) Agar : 17,0 (g) PH = 6.8 - 7,0
- Cách nấu môi trường: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch bằng nước cất, thái mỏng, đổ 50 ml nước cất vào đun sôi trong 30 phút. Sau đó lọc lấy dịch chiết khoai tây, thêm nước cất cho đủ 1000 ml.
Cân các hoá chất còn lại, lần lượt đổ vào dịch chiết khoai tây, vừa đổ vừa
khuấy đều cho tan hết hoá chất. Sau khi đun cách thuỷ xong, ta đổ môi trường vào ống nghiệm và đem hấp cách thuỷ ở 121,60C trong 15 phút. Trong khi hấp chú ý đặt nghiêng ống nghiệm để tạo mặt môi trường nghiêng. Sau 4 - 8h môi trường đông lại, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn ngay hoặc có thể bảo quản.
- Phương pháp lây nhiễm:
Lây nhiễm bằng cách cắt đầu lá: dùng kéo đã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh, cắt lên đầu lá lúa khoảng 2 – 5 cm vào giai đoạn làm đòng đến trỗ bông. Sau 18 – 20 ngày đo chiều dài vết bệnh và đánh giá.
- Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
Sau lây nhiễm 20 ngày, chúng tôi tiến hành đánh giá tính chống bệnh của từng dòng bằng phương pháp đo chiều dài vết bệnh do GS. Satoru Taura đề xuất:
+ Chiều dài vết bệnh: < 8cm - Kháng
+ Chiều dài vết bệnh: 8 - 12cm – Nhiễm vừa + Chiều dài vết bệnh: > 12cm - Nhiễm nặng
3.3.3 Sử dụng chỉ thị phân tử PCR tìm gen kháng bệnh bạc lá ở tập đoàn các giống lúa nếp địa phương
3.3.3.1 Quy trình chiết tách ADN (Theo phương pháp của Zheng và cộng sự năm 1995) có cải tiến gồm 4 bước: phá vỡ tế bào, loại bỏ protein, kết tủa DNA, xác định mức độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số.
- Thành phần dung dịch chiết tách DNA
Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ
Nồng độ dung dịch làm việc
Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tách Tris-HCl
(pH=8) 1M 50mM 0,5ml
EDTA (pH=8) 0,5M 0,25mM 0,5ml
NaCl 5M 300mM 0,6ml
SDS 10% 1% 1,0ml
H2O 7,4ml
+ Chuẩn bị Tris HCl 1M, PH = 8
Cân 30,28 g Trizmabase MW: 212.1g (dung dịch rất kiềm) cho vào lọ.
Đổ vào 200 ml nước cất. Chuẩn độ bằng HCl cho tới Ph = 8
Đổ thêm nước vào cho tới khi hỗn hợp đạt 250ml, hấp khử trùng ở 121oc, 15 phút.
+ Chuẩn bị ADTA 0.5M, Ph = 8
Cân 46,53g Disodium ethylendimin tetraacetat (dung dịch hơi axit), cho vào lọ.
Đổ vào 200ml H2O, cho tiếp vào 4g NaOH.
Khuấy từ nhẹ nhàng, chỉnh PH bằng NAOH đậm đặc và đổ nước cho tới khi thể tích đạt 250ml.
+ Chuẩn bị NaCl 5m (MW. 54.44g) Cân 73,05gNaCl cho vào lọ.
Đổ vào 250ml H2O, khuấy đều rồi đem khử trùng.
+ SDS 10% (MW.288.4g) Cân 25g SDS cho vào lọ.
Cho vào 200ml H2O, khuấy đều từ từ bằng cách tăng thêm nhiệt (do khó tan).
Cho thêm 50ml nước, để ở nhiệt độ phòng.
- Thành phần dung dịch đệm TE dùng để bảo quản DNA
Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ
Nồng độ dung dịch làm việc
Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tách
Tris-HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5ml
EDTA (pH= 8) 0,5M 1mM 0,1ml
H2O 49,4mll
* Quy trình chiết tách:
+ Bước 1: Thu mẫu lá cây khoẻ, cắt dài khoảng 2 cm, bỏ vào ống nghiệm có dung tích 1,5 ml, đánh dấu tên giống rồi bỏ vào đá lạnh.
+ Bước 2: Trong phòng thí nghiệm các cối sứ đã được khử trùng đặt
trong đá lạnh, các mẫu lá được cắt nhỏ 0,5 cm bỏ vào cối sứ.
+ Bước 3: Nhỏ 400 àl dung dịch chiết suất DNA vào cối sứ rồi lấy chầy nghiền nhỏ mẫu lá.
+ Bước 4: Nghiền nhỏ mẫu lá trong dung dịch chiết suất cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh đen chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra.
+ Bước 5: Đổ thờm 400 àl dung dịch chiết suất DNA vào rồi trộn lẫn và chuyển 400 àl dung dịch này vào ống nghiệm đó đỏnh dấu cựng giống.
+ Bước 6: Đổ vào ống nghiệm này 400àl Phenol: Chloroform:
Isolamylalchohol (25:24:1). Sau đó li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, 40C rồi chuyển phần dung dịch trên sang ống nghiệm đã được đánh dấu cùng giống.
+ Bước 7: Đổ thờm 400 àl Chloroform: Isolamyalchohol (24:1). Sau đú li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, 40C rồi chuyển phần dịch phía trên sang ống nghiệm đã được đánh dấu cùng giống.
+ Bước 8: Cho 800 àl Ethanol 96%, trộn đều sau đú li tõm 13000 vòng/phút, 5 phút, 40C. Đổ dung dịch phía trên giữ lại phần kết tủa phía đáy ống nghiệm.
+ Bước 9: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
+ Bước 10: Hoà tan kết tủa bằng 50 àl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ -200C.
Lấy 1 àl dung dịch DNA dựng cho mỗi phản ứng.
3.3.2 Kiểm tra độ tinh sạch của DNA nguyên bản
Sau khi tách chiết DNA chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của DNA.
- Lấy 1àl DNA nguyờn bản đó được bảo quản trong TE + 7ml TE (để làm giảm bớt nồng độ AND nguyên bản).
- Trộn lẫn với 1Ml loadingbuffer rồi nhỏ vào các giếng điện di.
- Cắm vào nguồn điện 70V,25 phút.
- Nhuộm bản gen bàng Ethillium bromide, 10 phút.
- Quan sát các vệt band bằng cách chiếu tia UV
DNA nguyên bản không bị gãy và không lẫn tạp khi xuất hiện vệt band đồng đều và rõ nét.
3.3.3 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR ( nh©n AND)
* Nhân DNA
Trình tự mồi sử dụng trong nhân gen PCR
Một số đoạn mồi dùng để phát hiện các gen kháng bệnh bạc lá lúa Xa4, xa5, Xa7.
Xa4 F5’-ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG-3’ R5’-GTGCTATAAAGGCATTCGGG-3’ Xa7 F5’-CAGCAATTCACTGGAGTAGTGGTT-3’ R5’-CATCACGGTCACCGCCATATCGGA-3’ xa5
(RG56R) F5’-TAGCTGCTGCCGTGCTGTGC-3’ R5’-AATATTTCAGTGTGCATCTC-3’
- Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) được theo nguyên lý của Karry Mullis và cộng sự (1980).
- Các thành phần tham gia phản ứng:
STT Thành phần Nồng độ dung dịch Thể tớch àl
1 Nước cất vô trùng 13,3
2 PCR buffer 10X 2,0
3 dNTPs 2,5mM 1,6
4 Primer-F 10pmol/àl 1,0
5 Primer-R 10pmol/àl 1,0
6 DNA Tag polymerase 5 unit/àl 0,1
- Cho 19àl cocktai đó pha chế vào mỗi ống.
- Cho tiếp 1àl DNA đó chiết tỏch vào mỗi ống, đậy nắp cẩn thận và Voltex nhẹ.
- Phản ứng PCR được tiến hành theo chu trình nhiệt gồm 4 bước sau:
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Số chu kỳ
I 94 4 1
II
94 0,5
34
35-56 0,5
72 1
III 72 5 1
IV 4
* Quy trìnhnh nhân gen Xa4, Xa7:
Bước Nhiệt độ (0c) Thời gian (phút)
1 94 4
2 94 1
3 56 1
4 72 2
5 Lặp lại 34 chu kỳ từ bước 2
6 72 8
7 4
8 END
Quy trình nhân gen xa5:
Bước Nhiệt độ (0c) Thời gian (phút)
1 94 4
2 94 1
3 60 1
4 72 1 phút và 50 giây
5 Lặp lại 34 chu kỳ từ bước 2
6 72 7
7 4
8 END
3.3.4 Phương pháp điện di sản phẩm PCR trên gel agarose:
- Dung dịch điện di: 50X TAE (2M Tris- acete pH= 8.0; 0.05m EDTA)
Tris 60.5g
Acetic acid 14.3 ml
ADTA 0.5ml
H2O 150ml
- Pha loãng 50X TAE thành dung dịch 1X TAE bằng cách pha 20ml 50X TAE vào trong 980ml nước cất 2 lần.
- Chuẩn bị gel agarosse 2% (1,5g agarose + 100ml 1X TAE)
+ Đun agarose trong lò vi sóng đến khi dung dịch trở nên trong suốt, lấy ra dùng máy khuấy từ làm tan hoàn toàn, để nguội đến khoảng 500.
+ Đặt lược tạo giếng (dán băng dính vào khuôn để tránh rò rỉ gel), đổ dung dịch agarose khuôn và để nguội. Chú ý không để lại bọt khí ở đáy lỗ khuôn, khi gel đông kết mới bỏ lược ra.
- Chạy điện di sản phẩm DNA nhân trong chu trình PCR
+ Sau khoảng 30 phút để gel đông lại, bỏ băng dính ở đầu cuối khuôn, tháo lược.
+ Đặt khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch điện di ngập gel khoảng 4mm.
- Trải một mảng parafin, nhỏ 2àl loading bufet, trộn với 8àL dung dịch PCR, nhỏ hỗn hợp vào giếng. Nhỏ theo thứ tự: Đối chứng âm (Ỉ24), đối chứng dương (BB4, BB%, BB&), DNA của các giống.
- Cắm nguồn điện di một chiều (75V) chạy trong khoảng 25 đến 30 phút.
DNA mang điện tích âm sẽ chạy về điện cực âm của nguồn điện.
- Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng Ethilium Bromide nồng độ 10mg/ml trong 10phút.
- Quang sát vệt băng bằng cách chiếu tia UV và chụp ảnh.
* Phát hiện gen kháng bạc lá
Khi quan sát vệt băng ta thấy: vệt băng chứa đối chứng dương sẽ chạy nhanh hơn vệt băng chứa IR24. Giếng nào tạo vệt thẳng hàng với đối chứng dương chứng tỏ giống đó chứa gen kháng tương ứng.