PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
Dựa vào mục tiêu đề tài chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ như sau:
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 26 Định danh chủng vi khuẩn nội
sinh có hoạt tính Củ sâm đại hành khỏe mạnh
Sấy và say thành bột dược liệu Phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường TSA
Chiết xuất với các dung môi
Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
Tìm nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết với vi khuẩn, vi nấm gây bệnh
Làm thuần và bảo quản chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được
Quan sát đại thể, vi thể Cô thành cao dược liệu
mẫu củ và lá cây sâm đại hành khỏe mạnh
Sơ đồ 2. 1. Quy trình thí nghiệm
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 27
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh 2.3.2.1. ấy mẫu
Mẫu sâm đại hành được chọn là những cây khỏe mạnh, lá xanh tốt, không mắc bệnh và tăng trưởng tốt Nên chọn những cây có cảm quan tối ưu nhất tại vị trí lấy mẫu (Roy và cs., 2010).Sau khi lấy mẫu được gửi đi định danh tại trường đại học Khoa Học Tự Nhiên
Lấy mẫu: mẫu được thu ở lúc sáng sớm hay chiều mát, thu toàn bộ cây rồi rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá; sau đó cắt rời rễ và thân cây ra
2.3.2.2. Xử lý mẫu
Xử lý mẫu: để loại trừ các vi sinh vật có khả năng còn bám ở bề mặt, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, rễ dưới vòi nước mạnh; tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt rễ và thân thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm; sau đó lần lượt khử trùng mẫu (rễ, thân) bằng cồn 70 % trong 1 phút, sodium hypochloride 2,5 % trong 4 phút, ethanol trong 30 giây và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa (Costa và cs , 2012)
Để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, lấy 200 μL nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần thứ 4 (lần cuối) cấy lên các đĩa môi trường TSA 10 % (1,5 g/ L triptone, 0,5 g/ L soy peptone, 1,5 g/ L NaCl, 15 g/ L agar, pH 7,3) và ủ ở 280C, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi trường này không có sự xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu (Costa và cs., 2012).
2.3.2.3. Phân lập
Phân lập vi khu n nội sinh từ lá và củ cây sâm đại hành:
Mẫu sau khi mẫu đã xử lý xong, tiến hành phân lập trên môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) ủ 300C trong điều kiện có ánh sáng trong 48 giờ để cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh (Roy và cs., 2010).
2.3.2.4. àm thuần
Sau khi ủ, khuẩn lạc có hình thái khác nhau đã được lựa chọn và tiến hành cấy ria nhiều lần trên đĩa NA và ủ ở 280C trong 48 giờ để làm thuần vi khuẩn nội sinh
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 28 Tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường NA cho đến khi thu được khuẩn lạc có độ đồng đều về hình dạng, màu sắc Quan sát, nhận xét về đặc điểm hình thái như:
màu sắc, hình dạng, kích thước, viền, bề mặt của khuẩn lạc. (Arunachalam và cs., 2010) Lưu ý, từ một khuẩn lạc lấy từ mẫu thí nghiệm ta có thể có được ít nhất một chủng nội sinh
Các chủng đã được làm thuần được cấy giữ chủng vào các ống thạch nghiêng NA và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C (Arunachalam và cs., 2010).
2.3.2.5. Quan sát đại thể, vi thể
Xác định đặc điểm hình thái: hình dạng, kích thước và màu sắc của khuẩn lạc Nhuộm Gam, quan sát các chủng vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi (Arunachalam và cs., 2010).
Nhuộm Gram: nhằm xác định hình dạng tế bào vi khuẩn, dạng cầu hay trực, quan sát cách sắp xếp dạng đơn lẻ, dạng chuỗi hay chùm, và phân biệt tính chất bắt màu Gram (–) hoặc Gram (+) Cách tiến hành:
Đăt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U
Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
Tẩy màu bằng cồn 96o, khoảng 15 - 20 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1 000 lần
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím crystal violet, vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng safranin
2.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của vi khuẩn nội sinh
Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn nội sinh phân lập được bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (Arunachalam và cs., 2010; Roy và cs, 2010).
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 29
Chu n bị môi trường
Môi trường NB và NA (đối với vi khuẩn), PDA (đối với vi nấm) thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121oC trong 20 phút.
NA được đổ vào đĩa petri (đường kính 90 mm) với thể tích 20 mL
Chu n bị dịch vi khu n nội sinh thử nghiệm
Vi khuẩn nội sinh được cấy ria vào ống thạch nghiêng NA, ủ 24 giờ ở 37oC.
Lấy vi khuẩn từ ống thạch nghiêng, cấy tăng sinh vi sinh vật nội sinh vào 30 mL môi trường NB, lắc 150 rpm ở 37oC trong 5 ngày Sau 5 ngày, tiến hành ly tâm môi trường nuôi cấy ở 8000 rpm trong 8 phút, thu dịch khuẩn ở 4oC.
Chu n bị dịch treo vi khu n gây bệnh
Vi khuẩn thử nghiệm hoạt tính: Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli.
Lấy vi khuẩn gây bệnh đã được hoạt hóa từ ống thạch nghiêng 24-48 giờ để pha thành dịch treo trong nước muối sinh lý 0,85 % (NaCl 0,85% đã được hấp vô trùng).
Vortex dịch khuẩn trong 15 giây để đảm bảo độ đồng nhất Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland Độ đục của 0,5 McFarland tương đương với nồng độ vi khuẩn 1 - 2 x 108 CFU/ mL Sau đó, pha loãng 100 lần huyền dịch có độ đục tương đương độ đục 0,5 McFarland với nước muối sinh lý để được huyền dịch vi khuẩn có nồng độ 106 CFU/ mL.(Arunachalam và cs., 2010; Powthong và cs., 2012).
Chu n bị dịch treo vi nấm gây bệnh
Cấy nấm trên môi trường thạch Sabouraud có bổ sung kháng sinh cloramphenicol ủ ở 30oC trong 10 ngày.
Cho vào ống nấm nước muối sinh lý 0,85 % có chứa 0,05 % Tween 80 đã được hấp vô trùng, dùng que cấy cạo nhẹ trên mặt khóm nấm để tạo thành dịch treo Đo OD 530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08 – 0,12 tương đương với mật độ tế bào là 1 x 106 CFU/ mL.
Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 30 Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, vi nấm gây bệnh, dùng 1 que bông vô trùng nhúng vào huyền dịch rồi lấy lên ép và xoay nhẹ que gòn trên thành ống nghiệm cho ráo nước
Sau đó trải đều vi khuẩn, vi nấm từ que gòn lên mặt thạch đã hong khô trước đó, xoay mặt thạch 60o rồi trải tương tự, tiếp tục như vậy để đảm bảo trải đầy được vi khuẩn, vi nấm lên mặt thạch.
Khi mặt thạch khô, tiến hành đục lỗ thạch đường kính 9 mm bằng dụng cụ vô trùng.
Đối với vi khuẩn nội sinh: 100 àL dịch vi khuẩn nội sinh được thờm vào trong mỗi giếng thạch
Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn nội sinh và cao chiết khuếch tán vào lớp thạch
Ủ ở 37oC trong 18 đến 24 giờ đối với vi khuẩn và 28oC trong 4-5 ngày đối với vi nấm gây bệnh Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại
Kết quả:
Vi khuẩn nội sinh thử nghiệm có khả năng kháng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh khi xung quanh lỗ có vòng kháng khuẩn, kháng nấm
Kết quả được đọc khi vi khuẩn, vi nấm ở mẫu đối chứng mọc rõ Nếu có vùng ức chế tạo thành xung quanh lỗ chứa dịch Đo đường kính vùng ức chế Kết quả được xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm STATGRAPHICS và được trình bày dưới dạng: trung bình (mm) ± sai số chuẩn SE (Standard Error)
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 31
2.3.4. Phương pháp chiết xuất cao từ củ sâm đại hành Mục đích: xác định loại dung môi thích hợp cho hiệu suất cao
Yếu tố khảo sát bao gồm: dung môi trích ly gồm petroleum ether (60 – 90), n- hexan, chloroform (CHCl3), ethanol và methanol.
Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:6; nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 72 giờ
Cách thực hiện:
Bột dược liệu từ củ sâm đại hành được chiết xuất bằng phương pháp ngâm với các dung môi có độ phân cực khác nhau
Tiến hành ngâm phân đoạn 10 g bột dược liệu với 60 mL dung môi trong bình tam giác ở nhiệt độ phòng Sau 72 giờ, các dịch chiết được lọc qua giấy lọc Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách bốc hơi hết dung môi Đem cân số cao này bằng cân phân tích Cao dược liệu được hòa tan vào DMSO để khảo sát tác động kháng vi sinh vật
Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo công thức:
H(%) = A/B x 100 Trong đó:
H: hiệu xuất chiết suất A: khối lượng cao thu được
B: khối lượng nguyên liệu tương ứng ban đầu
Vòng kháng khuẩn
Hình 2. 1. Kết quả vòng kháng khuẩn , kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 32 Quy trình chiết xuất được trình bày qua sơ đồ sau:
Củ sâm đại hành
10g dƣợc liệu
Bột dƣợc liệu có độ ẩm 10 -12 % Xay
n - hexan Chloroform Ethanol Methanol
Đun bay hơi dung môi ở 60oC cho tất cảc các dung môi Petroleum
ether (60 – 90)
Cao dƣợc liệu 3 lần chiết xuất
Ngâm 24 giờ
Phơi bóng râm
Sấy 37oC trong 24 giờ
Rây qua rây 0,5
Sơ đồ 2. 2. Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dƣợc liệu
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 33
2.3.5. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn có trong cao thuốc theo dược điển Việt Nam IV
Chuẩn bị mẫu
Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO theo tỉ lệ 1mg/ mL và được giữ trong chai thủy tinh nhỏ đã được hấp vô trùng
Đếm tổng số nấm men – nấm mốc, vi sinh vật hiếu khí
Đối với mẫu đếm tổng số nấm men – nấm mốc: dùng môi trường Sabourard dextrose agar Đối với mẫu đếm tổng vi khuẩn hiếu khí dùng môi trường NA
Từ dung dịch mẫu thử 10-1, pha loãng bằng dung dịch NaCl 0,85 % để được nồng độ pha loãng thấp hơn 10-2, 10-3,…
Đun chảy môi trường, để nguội khoảng 40 – 45oC Dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi đĩa petri 1 mL mẫu thử Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15 – 20 mL môi trường sau đó, xoay đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để mẫu thử được trộn đều trong môi trường cấy
Để thạch đông tự nhiên, sau đó lật ngược đĩa lại và ủ trong tủ ấm 37oC/ 24 – 48 giờ đối với mẫu đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, 28 – 30oC/ 5 ngày đối với mẫu đếm tổng số nấm nem – nấm mốc
Đọc kết quả
Chỉ chọn những đĩa có số khuẩn lạc mọc từ 25 – 250.
Số lượng nấm và vi khuẩn hiếu khí sống lại được có trong 1g (mL) mẫu thử được tính theo công thức sau:
N = ∑
Trong đó:
N: tổng số tế bào vi khuẩn trong 1g (mL) mẫu (CFU/ g hay CFU/ mL)
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn ni: số đĩa petri cấy tại độ pha loãng thứ i
di: hệ số pha loãng thứ i
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 34 v: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa petri (mL)
2.3.6. Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của các cao dược liệu được bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (Sen và cs., 2012; Mathivanan và cs., 2014; Arunachalam và cs., 2010).
Cao chiết được hòa tan trong DMSO ở nồng độ 1 mg/ mL và tiến hành thí nghiệm (Tương tự mục 2.3.3.)
2.3.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn và vi nấm gây bệnh
Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các cao chiết từ dược liệu với các vi khuẩn, vi nấm gây bệnh, chúng tôi áp dụng phương pháp pha loãng trong môi trường thạch (Phạm Hùng Vân và cs , 2013; Lê Lan Hương, 1991)
2.3.7.1. Đối với vi khu n gây bệnh
Chuẩn bị vật liệu
Chuẩn bị cao chiết pha loãng
Để cú thể pha loóng cao chiết chuẩn cú nồng độ 1000 àg/ mL ta hũa tan cao chiết trong dung dịch DMSO 1 % ở nồng độ gấp 10 lần nồng độ thử Từ dung dịch gốc này cao chiết thử nghiệm được pha loãng từ cao đến thấp theo cấp số nhân trong nước cất vô trùng thành dãy nồng độ liên tiếp
Tác động kháng vi sinh vật được xác định dựa vào nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của chất thử (MIC)
Dung dịch “mẹ” Nước cất
* Độ pha Đậm độ trung gian (àg/ mL)
Đậm độ cuối cựng (àg/
mL) **
2,5 mL (10000 àg/
mL) 2 mL 1 mL 0,5 mL
- 2 mL 3 mL 3,5 mL 7,5 mL
- 1/2 1/4 1/8 1/16
10000 5000 2500 1250 625
1000 500 250 125 62,5
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 35 0,5 mL
2 mL (625 àg/ mL) 1 mL
0,5 mL 0,5 mL
2 mL 3 mL 3,5 mL 7,5 mL
1/2 1/4 1/8 1/16
312,5 156,3 78,1 39,1
31,25 15,63 7,81 3,91
2 mL (39,1 àg/ mL) 2 mL 1/2 19,5 1,95
* Nước cất: dung dịch dùng để pha loãng cao chiết
** Đậm độ cuối cùng được tính theo tỷ lệ trộn 2,5 mL dung dịch trung gian + 22,5 mL thạch MHA, hoặc 0,2 mL dung dịch trung gian + 1,8 mL thạch MHA (pha loãng 1/10).
Chuẩn bị thạch MHA
Cân thạch theo công thức (ghi trên hộp), đun sôi cho tan hết thạch, hấp thạch ở 121oC/15 phút Để nguội thạch còn khoảng 40 – 50oC Dùng ống đong khắc vạch đong 22,5 mL thạch MHA vào bình nón có sẵn 2,5 mL dung dịch cao chiết đã pha loãng theo các nồng độ cao chiết, lắc kỹ và đổ vào đĩa petri, khi thạch nguội cất bảo quản trong tủ lạnh 4 – 8oC Mỗi lần làm MIC cần 1 đĩa môi trường MHA có chứa DMSO 1 % làm đĩa đối chứng
Chuẩn bị dịch khuẩn thử nghiệm
Vi khuẩn thử nghiệm có mật độ cần đạt là 1-1,5 x 106 tế bào/ mL được pha tương tự mục 2.3.3.
Tiến hành thử nghiệm
Dựng micropipet hỳt 2 àL dịch treo vi khuẩn (cú nồng độ 106 vi khuẩn/ mL) nhỏ lên đĩa thạch MHA có các nồng độ cao chiết khác nhau Cấy đồng thời mẫu khuẩn đối chứng Sau khi đặt lên các đĩa thạch, chờ cho đĩa thạch khô (khoảng 15 – 20 phút) cất vào tủ ấm 37oC/ 18 – 24 giờ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
2.3.7.2. Đối với vi nấm gây bệnh:
Lượng cao chiết hòa tan trong dung dịch DMSO 1 % ở nồng độ gấp 10 lần nồng độ thử Từ dung dịch gốc này chất thử được pha loãng thành dãy nồng độ từ