PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. ĐỊNH DANH VI KHUẨN NỘI SINH BẰNG TEST SINH HÓA
Sau khi tiến hành các thử nghiệm trên chúng tôi tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa cho các chủng có hoạt tính cao theo khóa phân loại Cowan và Steel (Feltham và Barrow, 1993; Trần Linh Thước, 2006 ), khóa phân loại Bergey (1994) (MacFaddin, 2000).
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 37
Nhuộm Gram
Nguyên tắc
Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và Gram (-) làm cho khả năng bắt màu màng tế bào với thuốc nhuộm khác nhau giữa hai nhóm vi khuẩn Dựa vào đặc điểm này người ta phân thành hai nhóm vi khuẩn
Tiến hành: được trình bày ở mục 2.3.2.5
Thử nghiệm catalase
Nguyên tắc
Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý đều có enzym catalase (trừ Streptococcus spp ) Catalase thủy phân hydrogen peroxidase H2O2 thành H2O và O2 Sự thủy phân hydrogen peroxidase sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí, dựa vào đặc tính này để thử khả năng sinh enzym catalase của vi khuẩn
Tiến hành
Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch, nhỏ một giọt H2O2 5 % lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính và quan sát Vi khuẩn sinh catalase sẽ sủi bọt khí, ngược lại không thấy hiện tượng
Thử nghiệm oxidase
Nguyên tắc
Các loại vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối có enzym oxydase (cytochrom oxydase).
Có thể phát hiện oxydase bằng cách sử dụng thuốc thử là giấy tẩm N – Dimethel – paraphenyldiamine.
Tiến hành
- Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn trong đĩa vi khuẩn đã nuôi cấy, phết lên giấy tẩm thuốc thử Đọc kết quả trong vòng 30 giây – 1 phút.
- Phản ứng oxydase (+): giấy tẩm thuốc thử chuyển sang màu tím đen - Phản ứng oxydase (-): giấy tẩm thuốc thử vẫn giữ màu trắng đục
Indol
Nguyên tắc
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 38 Tryptophan là một acid amino có thể bị chuyển hóa thành dạng chủ yếu: indol, skatole (methyl indol), acid indol acetic (IAA) bởi enzym tryptophanase từ vi sinh vật Cấu trúc pyrrole của indole sẽ kết hợp với para-Dimethylamino-Benzaldehyde (DMABA) trong thuốc thử Kovacs’ tạo thành hợp chất quinone có màu tím đỏ
Cách tiến hành
- Cấy vi khuẩn vào môi trường pepton lỏng, ủ 37oC/ 24 giờ Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovacs’ trực tiếp vào canh cấy Lắc nhẹ và để yên
- Ống (+): trong vài giây, lớp tiếp xúc giữa môi trường và thuốc thử chuyển sang đỏ
- Ống (-): không đổi màu, chỉ có màu thuốc thử
- Ống (+/-): có màu cam trên bề mặt môi trường, đó là do skatole, là hợp chất bị metyle hóa, có thể là tiền chất của indol
- Trong trường hợp ống (-) cần ủ thêm 24 giờ để kiểm tra lại
Amylase
Nguyên tắc
Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra enzym amylase có tác dụng phân giải tinh bột thành các đường đơn để vi khuẩn dễ sử dụng Phản ứng này được nhận biết khi ta nhỏ dung dịch lugol vào môi trường thạch nuôi cấy, nếu trong môi trường có tinh bột thì môi trường sẽ chuyển thành màu xanh đậm Nếu trong môi trường không còn tinh bột thì lugol sẽ không làm chuyển màu môi trường
Tiến hành
- Môi trường thạch dinh dưỡng bổ sung 0,4 % tinh bột - Hoạt hóa chủng vi sinh vật thử nghiệm ở 37oC/ 24 giờ
- Dùng tăm bông vô trùng chấm dịch khuẩn lên đĩa môi trường - Ủ 37oC/ 24 giờ
- Nhỏ Lugol và xem kết quả
Nitrate
Nguyên tắc
Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng nguồn nitrate làm nguồn hydro cơ chất trong quá trình hô hấp kỵ khí, đồng thời sử dụng nguồn nitrate như nguồn nitơ duy
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 39 nhất, do khả năng tổng hợp enzym nitratreductase Nitrate bị khử thành nitrit rồi có thể bị khử tiếp thành NH3 hoặc N2
Cơ chế phản ứng:
Acid sulfanilic không màu trong Gress A sẽ kết hợp với nhóm NO2-
tạo thành muối diazonium, acid sulfanilic bị diazo hóa không màu tiếp tục phản ứng với α- naphthylamine không màu tạo thành hợp chất p-sulfobenzene-azo-α-naphthylamine có màu đỏ Tác nhân bụi kẽm kết hợp với acid acetic trong thuốc thử sẽ làm giảm lượng muối diazonium do p-sulfobenzene-azo-α-naphthylamine kết hợp với acid acetic, dưới xúc tác của bụi kẽm tạo ra arylhydrazine có màu
Cách tiến hành
- Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch nitrate, ủ 37oC/ 24 giờ
- Nhỏ trực tiếp vào môi trường nuôi cấy 2 giọt Gress A, 2 giọt Gress B - Ống (+): có màu hồng đỏ
- Ống (±): không đổi màu
- Mẫu thử không đổi màu, có 2 trường hợp xảy ra:
- Trường hợp 1: NO3- không chuyển thành NO2-.
- Trường hợp 2: NO3- chuyển thành NO2- rồi tiếp tục chuyển thành NH3 hay N2.
- Tiếp tục cho bột kẽm vào môi trường phản ứng:
- Ống (+): không đổi màu - Ống (-): xuất hiện màu đỏ
Citrate
Nguyên tắc
Một số vi sinh vật có enzym citrat permease có khả năng sử dụng citrat trong môi trường có Na Chúng giải phóng ra môi trường ion Na+ khi sử dụng citrat, làm pH môi trường giảm Đồng thời những vi sinh vật này cũng có khả năng sử dụng muối amonium vô cơ NH4H2PO4 làm nguồn nitơ, giải phóng NH3 ra môi trường làm kiềm hóa môi trường, sự thay đổi pH được nhận diện bằng chỉ thị màu bromothymol blue có khoảng đổi pH từ 6 – 7,6 tương ứng với khoảng màu từ vàng - xanh lục - xanh dương
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 40
Tiến hành
- Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng Simmon’s Citrat ủ 37oC/ 24 giờ - Ống (+): màu xanh dương
- Ống (-): màu xanh lục
Urease
Nguyên tắc
Vài loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzym urease do đó có khả năng phân giải urê thành NH3, làm tăng pH môi trường, được nhận diện bằng chỉ thị màu phenolred có khoảng đổi pH 6,8 - 8,2 tương ứng với khoảng đổi màu từ vàng - đỏ
Tiến hành
- Cấy vi khuẩn trên môi trường Christensen’s Urea ủ 37oC/ 24 giờ - Ống (+): môi trường từ hồng chuyển sang đỏ cánh sen
- Ống (-): môi trường không đổi màu
Voges – Proskauer (VP)
Nguyên tắc
Thử nghiệm Voges-Proskauer dựa trên sự phát hiện acetoin, là sản phẩm biến dưỡng cuối cùng từ glucose
Glucose thủy phân thành sản phẩm trung gian là acid pyruvic Từ acid pyruvic, vi khuẩn sẽ chuyển hóa tiếp theo nhiều con đường khác nhau, trong đó một số vi khuẩn sẽ chuyển hóa tiếp tục con đường tạo thành acetoin, là tiền sản phẩm của 2,3-butanediol.
Cơ chế phản ứng của thử nghiệm VP (+):
- Glucose lên men tạo acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC) - AMC + α-naphtol , KOH và oxy không khí (lắc) → Diacetyl - Diacetyl + nhân guanidine trong pepton → tạo màu hồng đỏ
- Màu của phản ứng xuất hiện sau 2-5 phút và đậm nhất sau 30 phút – 1h và mất màu nếu để lâu hơn nữa
- Thử VP test trên môi trường canh MR-VP, thuốc thử sử dụng là α-naphtol 5%, KOH 40 %.
Cách tiến hành
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 41 - Cấy vi khuẩn vào môi trường, ủ 37oC/ 24 giờ Nhỏ trực tiếp 0,6 mL α- naphtol và 0,2 mL KOH, lắc đều trong 30 giây
- Ống (+): màu hồng đỏ trên bề mặt - Ống (-): màu vàng của thuốc thử
Các thử nghiệm lên men đường
Nguyên tắc
Vi khuẩn sử dụng nguồn đường sẽ chuyển hóa thành acid pyruvic làm pH môi trường giảm, quan sát sự thay đổi pH của môi trường dựa vào chỉ thị màu phenolred với khoảng đổi màu 6,6 – 8 tương ứng từ vàng – đỏ
Tiến hành
- Cấy vi khuẩn vào môi trường lên men đường cần khảo sát, ủ 37oC/ 24 giờ.
- Ống (+): màu vàng
- Ống (-): màu hồng đến đỏ
Khả năng phát triển ở 10 % NaCl
Nguyên tắc
Thử nghiệm chịu đựng muối sử dụng môi trường TSB (Trypticase Soy Broth), bổ sung NaCl để tạo ra môi trường có nồng độ muối 10 % Môi trường này dùng để thử nghiệm khả năng tồn tại của vi sinh vật trong môi trường có nồng độ muối cao Một số chủng Bacillus có khả năng phát triển ở điều kiện 10 % NaCl, do đó, thử nghiệm này góp phần định danh vi khuẩn
Tiến hành
Cấy vi khuẩn vừa được hoạt hóa khoảng 18 – 24 giờ vào môi trường TSB bổ sung 10 % NaCl, nuôi cấy ở 37oC/ 24 giờ Khả năng phát triển thể hiện qua khả năng mọc được, làm đục môi trường nuôi cấy
Khả năng phát triển ở 50oC, 41oC, 4oC
Tiến hành
Cấy vi khuẩn vừa được hoạt hóa khoảng 18 – 24 giờ vào môi trường TSB, nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 50oC, 41oC, 4oC Khả năng phát triển thể hiện qua khả năng mọc được, làm đục môi trường nuôi cấy
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 42
Kiểm tra khả năng phát triển ở điều kiện kỵ khí
Nguyên tắc
Nếu là nhóm vi khuẩn hiếu khí, nó chỉ có khả năng tăng trưởng trên bề mặt môi trường
Nếu là nhóm kỵ khí tuyệt đối, chỉ mọc được ở phần đáy của ống thạch sâu Nếu mọc được ở toàn bộ ống môi trường thạch sâu, là nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi.
Dịch khuẩn thử nghiệm:
- Dịch khuẩn khảo sát đạt nồng độ 108 CFU/ mL Pha dịch khuẩn thử nghiệm và so sánh với ống có độ đục chuẩn 0,5 McFarland
- Cách pha dung dịch chuẩn độ đục 0,5 McFarland
- Để chuẩn mực hóa độ đục của vi khuẩn thử nghiệm phải đạt nồng độ 108 tế bào/mL, nên dùng huyền dịch BaSO4 tương đương độ đục 0,5 McFarland hay một huyền dịch tương đương bằng mắt thường (huyền dịch latex)
- Pha độ đục chuẩn dựa trên nguyên tắc phản ứng giữa:
H2SO4 + BaCl2 → BaSO4 + 2HCl
- Hút 9,9 mL H2SO4 và 0,1 mL BaCl2 tương ứng với 3 x 108 tế bào/ mL Để ống đục chuẩn 0,5 McFarland có độ đục tương đương với số lượng vi khuẩn là 108 tế bào/ mL ta tiếp tục pha loãng Dùng ống nghiệm này lắc đều, hút lấy 4 mL pha vào 8 mL nước cất vô khuẩn, trộn đều, bỏ 2 mL, đậy kín Lấy ống này làm ống đục chuẩn 0,5 McFarland
Tiến hành
- Sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dựng micropipette hỳt 100 àL dịch khuẩn vào ống môi trường thạch sâu WB, đem vortex Ủ ở 37oC/ 24 giờ
- Nếu khuẩn lạc vi khuẩn chỉ mọc ở bề mặt ống môi trường → vi khuẩn hiếu khí.
- Nếu khuẩn lạc vi khuẩn mọc ở phần đáy ống nghiệm → vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối
- Nếu khuẩn lạc vi khuẩn vừa mọc ở bề mặt môi trường vừa mọc dọc theo ống môi trường thạch sâu → kỵ khí tùy nghi
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 43
Thủy phân casein
Nguyên tắc
Casease là một exoenzym được sản xuất bởi một số vi khuẩn để phân hủy casein Nếu vi sinh vật có khả năng sản xuất casease thì sẽ xuất hiện vòng trong xung quanh nơi vi khuẩn phát triển
Tiến hành
Cấy vi khuẩn vừa được hoạt hóa khoảng 18 – 24 giờ vào môi trường Sau đó, ủ ở 37oC/ 24 giờ
(+): xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn phát triển (-): không xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn phát triển
Xác định khả năng di động
Nguyên tắc
Một số vi khuẩn có tiên mao nên có khả năng di dộng trong môi trường bán lỏng và làm đục môi trường hay mọc giống như rễ cây xung quanh đường cấy
Khi cần có thể dùng muối tetrazolium trong môi trường thử di động giúp phát hiện di động dễ dàng hơn, đặc biệt những trường hợp khó đọc kết quả
Môi trường: môi trường bán lỏng NA, để đứng
Tiến hành:
Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn trong ống cấy sang ống thạch bán lỏng, trích thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường
Cho vào tủ ấm 37oC, ủ trong 24 – 48 giờ Đọc kết quả
Phản ứng di động dương (+): vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu
Phản ứng di động âm (-): vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy
Khả năng khuếch tán hu nh quang màu vàng trên môi trường Pseudomonas F
Nguyên tắc
Các chủng Pseudomonas có khả năng tiết sắc tố pyoverdine phát huỳnh quang khuếch tán trong thạch dọc theo đường cấy
Tiến hành
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 44 Cấy vi khuẩn vào môi trường Pseudomonas F, ủ ở 25oC trong 3 ngày. Quan sát khả năng phát huỳnh quang dưới tia UV (260 mm)
Không phát hu nh quan và sinh sắc tốt màu xanh lam trên môi trường Pseudomonas P.
Nguyên tắc
Các chủng Pseudomonas có khả năng tiết sắc tố pyocianine khuếch tán trong thạch dọc theo đường cấy Đặc biệt chủng Pseudomonas aeruginosa có khả năng khuếch tán sắc tố xanh lam đặc trưng
Tiến hành
Cấy vi khuẩn vào môi trường Pseudomonas P, ủ ở 25oC trong 3 ngày. Quan sát khả năng phát huỳnh quang dưới tia UV (260 mm)
Thử nghiệm Lecthinase
Nguyên tắc
Trong môi trường có lithium choloride và telluride ức chế sự phát triển của các vi khuẩn đi kèm Trong môi trường dịch trứng đục vi khuẩn có khả năng tiết ra enzym lecthinase phân giải protein trong môi trường tạo ra vòng sáng
Tiến hành
Cấy vi khuẩn thử nghiệm vào môi trường Baird- Parker có bổ xung dịch trứng và telluride, ủ ở 24h và đọc kết quả
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 45