PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4. Phương pháp chiết xuất cao từ củ sâm đại hành
Yếu tố khảo sát bao gồm: dung môi trích ly gồm petroleum ether (60 – 90), n- hexan, chloroform (CHCl3), ethanol và methanol.
Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:6; nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 72 giờ
Cách thực hiện:
Bột dược liệu từ củ sâm đại hành được chiết xuất bằng phương pháp ngâm với các dung môi có độ phân cực khác nhau
Tiến hành ngâm phân đoạn 10 g bột dược liệu với 60 mL dung môi trong bình tam giác ở nhiệt độ phòng Sau 72 giờ, các dịch chiết được lọc qua giấy lọc Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách bốc hơi hết dung môi Đem cân số cao này bằng cân phân tích Cao dược liệu được hòa tan vào DMSO để khảo sát tác động kháng vi sinh vật
Hiệu suất thu hồi các loại cao được tính theo công thức:
H(%) = A/B x 100 Trong đó:
H: hiệu xuất chiết suất A: khối lượng cao thu được
B: khối lượng nguyên liệu tương ứng ban đầu
Vòng kháng khuẩn
Hình 2. 1. Kết quả vòng kháng khuẩn , kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 32 Quy trình chiết xuất được trình bày qua sơ đồ sau:
Củ sâm đại hành
10g dƣợc liệu
Bột dƣợc liệu có độ ẩm 10 -12 % Xay
n - hexan Chloroform Ethanol Methanol
Đun bay hơi dung môi ở 60oC cho tất cảc các dung môi Petroleum
ether (60 – 90)
Cao dƣợc liệu 3 lần chiết xuất
Ngâm 24 giờ
Phơi bóng râm
Sấy 37oC trong 24 giờ
Rây qua rây 0,5
Sơ đồ 2. 2. Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dƣợc liệu
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 33
2.3.5. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn có trong cao thuốc theo dược điển Việt Nam IV
Chuẩn bị mẫu
Mẫu cao chiết được hòa tan trong DMSO theo tỉ lệ 1mg/ mL và được giữ trong chai thủy tinh nhỏ đã được hấp vô trùng
Đếm tổng số nấm men – nấm mốc, vi sinh vật hiếu khí
Đối với mẫu đếm tổng số nấm men – nấm mốc: dùng môi trường Sabourard dextrose agar Đối với mẫu đếm tổng vi khuẩn hiếu khí dùng môi trường NA
Từ dung dịch mẫu thử 10-1, pha loãng bằng dung dịch NaCl 0,85 % để được nồng độ pha loãng thấp hơn 10-2, 10-3,…
Đun chảy môi trường, để nguội khoảng 40 – 45oC Dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi đĩa petri 1 mL mẫu thử Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15 – 20 mL môi trường sau đó, xoay đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để mẫu thử được trộn đều trong môi trường cấy
Để thạch đông tự nhiên, sau đó lật ngược đĩa lại và ủ trong tủ ấm 37oC/ 24 – 48 giờ đối với mẫu đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, 28 – 30oC/ 5 ngày đối với mẫu đếm tổng số nấm nem – nấm mốc
Đọc kết quả
Chỉ chọn những đĩa có số khuẩn lạc mọc từ 25 – 250.
Số lượng nấm và vi khuẩn hiếu khí sống lại được có trong 1g (mL) mẫu thử được tính theo công thức sau:
N = ∑
Trong đó:
N: tổng số tế bào vi khuẩn trong 1g (mL) mẫu (CFU/ g hay CFU/ mL)
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn ni: số đĩa petri cấy tại độ pha loãng thứ i
di: hệ số pha loãng thứ i
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 34 v: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa petri (mL)
2.3.6. Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của các cao dược liệu được bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (Sen và cs., 2012; Mathivanan và cs., 2014; Arunachalam và cs., 2010).
Cao chiết được hòa tan trong DMSO ở nồng độ 1 mg/ mL và tiến hành thí nghiệm (Tương tự mục 2.3.3.)
2.3.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn và vi nấm gây bệnh
Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các cao chiết từ dược liệu với các vi khuẩn, vi nấm gây bệnh, chúng tôi áp dụng phương pháp pha loãng trong môi trường thạch (Phạm Hùng Vân và cs , 2013; Lê Lan Hương, 1991)
2.3.7.1. Đối với vi khu n gây bệnh
Chuẩn bị vật liệu
Chuẩn bị cao chiết pha loãng
Để cú thể pha loóng cao chiết chuẩn cú nồng độ 1000 àg/ mL ta hũa tan cao chiết trong dung dịch DMSO 1 % ở nồng độ gấp 10 lần nồng độ thử Từ dung dịch gốc này cao chiết thử nghiệm được pha loãng từ cao đến thấp theo cấp số nhân trong nước cất vô trùng thành dãy nồng độ liên tiếp
Tác động kháng vi sinh vật được xác định dựa vào nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật của chất thử (MIC)
Dung dịch “mẹ” Nước cất
* Độ pha Đậm độ trung gian (àg/ mL)
Đậm độ cuối cựng (àg/
mL) **
2,5 mL (10000 àg/
mL) 2 mL 1 mL 0,5 mL
- 2 mL 3 mL 3,5 mL 7,5 mL
- 1/2 1/4 1/8 1/16
10000 5000 2500 1250 625
1000 500 250 125 62,5
SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 35 0,5 mL
2 mL (625 àg/ mL) 1 mL
0,5 mL 0,5 mL
2 mL 3 mL 3,5 mL 7,5 mL
1/2 1/4 1/8 1/16
312,5 156,3 78,1 39,1
31,25 15,63 7,81 3,91
2 mL (39,1 àg/ mL) 2 mL 1/2 19,5 1,95
* Nước cất: dung dịch dùng để pha loãng cao chiết
** Đậm độ cuối cùng được tính theo tỷ lệ trộn 2,5 mL dung dịch trung gian + 22,5 mL thạch MHA, hoặc 0,2 mL dung dịch trung gian + 1,8 mL thạch MHA (pha loãng 1/10).
Chuẩn bị thạch MHA
Cân thạch theo công thức (ghi trên hộp), đun sôi cho tan hết thạch, hấp thạch ở 121oC/15 phút Để nguội thạch còn khoảng 40 – 50oC Dùng ống đong khắc vạch đong 22,5 mL thạch MHA vào bình nón có sẵn 2,5 mL dung dịch cao chiết đã pha loãng theo các nồng độ cao chiết, lắc kỹ và đổ vào đĩa petri, khi thạch nguội cất bảo quản trong tủ lạnh 4 – 8oC Mỗi lần làm MIC cần 1 đĩa môi trường MHA có chứa DMSO 1 % làm đĩa đối chứng
Chuẩn bị dịch khuẩn thử nghiệm
Vi khuẩn thử nghiệm có mật độ cần đạt là 1-1,5 x 106 tế bào/ mL được pha tương tự mục 2.3.3.
Tiến hành thử nghiệm
Dựng micropipet hỳt 2 àL dịch treo vi khuẩn (cú nồng độ 106 vi khuẩn/ mL) nhỏ lên đĩa thạch MHA có các nồng độ cao chiết khác nhau Cấy đồng thời mẫu khuẩn đối chứng Sau khi đặt lên các đĩa thạch, chờ cho đĩa thạch khô (khoảng 15 – 20 phút) cất vào tủ ấm 37oC/ 18 – 24 giờ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
2.3.7.2. Đối với vi nấm gây bệnh:
Lượng cao chiết hòa tan trong dung dịch DMSO 1 % ở nồng độ gấp 10 lần nồng độ thử Từ dung dịch gốc này chất thử được pha loãng thành dãy nồng độ từ