Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
2.3.1.1. ðiều tra hiện trạng sản xuất về diện tích, sản lượng và chủng loại giống
- Thớ nghiệm ủược tiến hành trong thời gian 3 năm từ 1998 - 2000 tại 8 tỉnh trồng vải chủ lực của miền Bắc là: Hà Tây, Hà Nam, Hải Dương, Phú Thọ, Quảng Ninh, Hòa Bình, Bắc Giang, Hưng Yên.
- ðiều tra, ủỏnh giỏ giống thực hiện trờn vườn trồng sẵn của người dõn.
2.3.1.2. ðỏnh giỏ ủặc tớnh nụng sinh học
- Thớ nghiệm ủược tiến hành vào năm 2002 - 2003, tại Gia Lõm - Hà Nội, trên vườn trồng sẵn, cây 5 tuổi, nhân giống bằng phương pháp ghép, mật ủộ trồng: 278 cõy/ha theo kiểu tuần tự, 8 cụng thức, mỗi giống là một cụng thức thớ nghiệm, mỗi giống bố trớ 30 cõy, trờn nền ủất phự sa cổ khụng ủược bồi ủắp thường xuyờn.
+ Công thức I: giống Bình Khê + Công thức II: giống ðường Phèn + Công thức III: giống Thạch Bình
+ Công thức IV: giống Yên Hưng + Công thức V: giống Yên Phú + Công thức VI: giống Phúc Hoà
+ Cụng thức VII: giống Hựng Long (ủó ủược cụng nhận năm 2000) + CT VIII: giống Thiều Thanh Hà (ủó ủược cụng nhận năm 2000) - Mụ tả cỏc ủặc ủiểm hỡnh thỏi theo hướng dẫn của Viện Di truyền tài nguyên thực vật quốc tế (2002) [67].
- đánh giá ựa dạng di truyền áp dụng cho 6 giống: Bình Khê, đường Phèn, Thạch Bình, Yên Hưng, Hùng Long và Thiều Thanh Hà.
2.3.1.2. Thí nghiệm về kỹ thuật thâm canh
a) Nghiờn cứu ảnh hưởng của kỹ thuật cắt tỉa ủến sinh trưởng, ra hoa, ủậu quả, năng suất, phẩm chất của vải Yên Hưng.
Thớ nghiệm ủược tiến hành vào năm 2002 - 2003 tại Thanh Hà, Hải Dương, bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 4 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 3 cây, trên cây 8 tuổi:
- Công thức I: cắt tỉa theo Quy trình chăm sóc vải của Trung tâm khuyến nông Hải Dương (nền 1).
Cách làm: cắt tỉa một lần sau thu hoạch 7 - 10 ngày: cắt tỉa toàn bộ các cành sõu bệnh, cành tăm, cành vượt, dựng kộo cắt cành cắt ủến gốc cành, sỏt vào cành chớnh hoặc thõn chớnh (khụng ủể chừa ra phần gỗ dễ gõy thối cành).
- Cụng thức II: cắt tỉa theo phương phỏp ủốn phớt: nền 1 + cắt bỏ tất cả cỏc ủầu cành phớa ngoài tỏn.
Cỏch làm: cắt bỏ cỏc ủầu cành (kể cả cành cho thu quả năm trước và khụng cho thu quả) ở vị trớ 1 - 2 cm từ phần bẻ hoặc ủỉnh sinh trưởng.
- Công thức III: cắt tỉa theo quy trình kỹ thuật trồng, chăm sóc và thu hoạch vải của Viện Nghiên cứu Rau quả: nền 1 + cắt tỉa vụ xuân + cắt tỉa vụ hè + tỉa bỏ bớt cành thu.
Cách làm:
+ Cắt tỉa vụ xuõn: ủược tiến hành vào 30/1 ủến 10/2, cắt bỏ những cành xuân chất lượng kém, những chùm hoa nhỏ, thưa, mọc sâu trong tán, chùm hoa bị sâu bệnh. Với cây khoẻ mạnh, chăm sóc tốt thì có thể tỉa bỏ 20 - 30% số chùm hoa, những cây yếu cần tỉa bỏ nhiều hơn.
+ Cắt tỉa vụ hố: ủược tiến hành từ 30/3 ủến giữa 10/4, tỉa bỏ những chùm quả nhỏ, sâu bệnh.
+ Cắt tỉa vụ thu: ủược tiến hành sau khi thu quả vào 25/5 ủến 5/6, tỉa bỏ các cành hè mọc quá dài. Khi lộc thu hình thành mọc dài khoảng 10 cm, tỉa bỏ những mầm yếu, mọc khụng hợp lý và chọn ủể lại 2 - 3 cành thu trờn mỗi cành mẹ.
- Cụng thức IV (ủối chứng): khụng cắt tỉa
b) Nghiờn cứu ảnh hưởng của cỏc chất ðTST và dinh dưỡng qua lỏ ủến khả năng ra hoa, ủậu quả, năng suất, phẩm chất của vải Yờn Hưng.
* Thớ nghiệm 1. Nghiờn cứu ảnh hưởng của GA3 ủến khả năng ra hoa, ủậu quả, năng suất, phẩm chất của vải Yên Hưng.
Thớ nghiệm ủược tiến hành vào năm 2002 - 2003 tại Gia Lõm - Hà Nội, bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc 3 cây, trên cây 6 tuổi, nền cắt tỉa là công thức III (thí nghiệm cắt tỉa):
- Công thức I: phun GA3 30 ppm - Công thức II: phun GA3 50 ppm - Công thức III: phun GA3 70 ppm
- Cụng thức IV (ủối chứng): phun nước ló Thời gian phun:
+ Lần 1: phun trước khi nở hoa
+ Lần 2: phun vào khi tắt hoa (hoa tàn)
+ Lần 3: phun vào lỳc quả bằng hạt ủậu xanh (sau tắt hoa 7 ngày)
Cách pha phun: hòa tan hoàn toàn lượng GA3 thương phẩm trong cồn 900 (chỉ sử dụng lượng cồn vừa ủủ ủể pha hoỏ chất), thờm nước cất tạo dung dịch mẹ 1.000 ppm. Pha dung dịch mẹ với nước ló ủể ủược nồng ủộ thớch hợp, pha xong phun ngay.
** Thớ nghiệm 2. Nghiờn cứu ảnh hưởng của một số chất ủiều tiết sinh trưởng và bổ sung dinh dưỡng qua lỏ ủến khả năng sinh trưởng, ra hoa, ủậu quả, năng suất, phẩm chất của vải Yên Hưng.
Thớ nghiệm ủược tiến hành vào năm 2003 - 2004 tại Thanh Hà, Hải Dương, bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 8 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc 1 cây, trên cây 8 tuổi, nền cắt tỉa là công thức III (thí nghiệm cắt tỉa):
- Công thức I: phun GA3 50 ppm
- Công thức II: H3BO3 0,1% + Urê 5 g/lít - Công thức III: H3BO3 0,1% + Urê 10 g/lít - Công thức IV: H3BO3 0,1% + Urê 15 g/lít - Công thức V: H3BO3 0,1 %
- Công thức VI: Grow 3 lá xanh 0,25%
- Công thức VII: SF-900 0,3%
- Cụng thức VIII (ủối chứng): phun nước ló Thời gian phun:
+ Lần 1: phun trước khi bật lộc thu + Lần 2: phun vào lúc lộc thu thành thục + Lần 3: phun trước khi nở hoa
+ Lần 4: phun vào khi tắt hoa (hoa tàn) + Lần 5: phun vào lỳc quả bằng hạt ủậu xanh
Cách pha phun:
+ GA3 pha phun như thí nghiệm 2
+ Cỏc húa chất khỏc: cõn ủong cỏc húa chất ủủ lượng ủể pha cho bỡnh 10 lớt. ðổ 3 lớt nước ló vào bỡnh phun 10 lớt, cho lượng húa chất ủó cõn ủong vào bỡnh quấy cho tan hết ủổ thờm 7 lớt nước quấy ủều, phun ngay.
*** Thớ nghiệm 3. Nghiờn cứu ảnh hưởng ethrel ủến khả năng diệt lộc ủụng, ra hoa, ủậu quả, năng suất, phẩm chất của vải Yờn Hưng.
Thớ nghiệm ủược tiến hành vào năm 2002 - 2003 tại Gia Lõm - Hà Nội, bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc 3 cây, trên cây 8 tuổi :
- Công thức I: phun ethrel 400 ppm - Công thức II: phun ethrel 600 ppm - Công thức III: phun ethrel 800 ppm - Công thức VI: phun ethrel 1.000 ppm - Cụng thức V (ủối chứng): phun nước ló
Thời gian phun: phun 1 lần khi lộc ủụng xuất hiện dài 7 - 10 cm.
Cách pha phun: lấy lượng ethrel gấp 2,1 lần (vì hàm lượng nguyên chất là 48%) pha cho bình 10 lít. ðổ 3 lít nước lã vào bình phun 10 lít, cho lượng ethrel vào bỡnh quấy cho tan hết sau ủú ủổ thờm 7 lớt nước quấy ủều, phun ngay.
Cỏc cụng thức ủược chăm súc theo cựng một quy trỡnh (chế ủộ làm cỏ, bón phân, tưới nước và phòng trừ sâu bệnh).
- Lượng phân bón:
Cõy 5 tuổi: phõn chuồng: 50kg/cõy/năm; ủạm urờ: 400g/cõy/năm; lõn supe: 800g/cây/năm; kaliclorua: 700g/cây/năm.
Cõy 8 tuổi: phõn chuồng: 50kg/cõy/năm; ủạm rờ: 900g/cõy/năm; lõn supe: 1.300g/cây/năm; kaliclorua: 1.300g/cây/năm.
- Thời vụ và tỷ lệ bón: toàn bộ lượng phân chuồng bón 1 lần sau thu
hoạch. Lượng phõn vụ cơ ủược chia làm 3 lần bún trong năm:
+ Lần 1: bún thỳc hoa và nuụi lộc xuõn (15/11 - 25/11): 25% ủạm urờ, 25% kaliclorua và 30% lân supe.
+ Lần 2: bón thúc quả giúp quả phát triển nhanh, chống rụng quả (5/4 - 15/4): 25% ủạm urờ, 50% kaliclorua và 30% lõn supe.
+ Lần 3: bón sau thu hoạch giúp cây phục hồi sinh trưởng (25/5 - 05/6):
50% ủạm urờ, 25% kaliclorua và 40% lõn supe.
2.3.2. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 2.3.2.1. Nhóm chỉ tiêu về khả năng sinh trưởng - ðặc ủiểm lỏ chột, lỏ kộp: lấy ngẫu nhiờn 30 lỏ/giống
+ Chiều dài lỏ kộp: ủo từ ủiểm cuống lỏ tiếp giỏp với cành tới ủiểm chóp của lá cuối cùng.
+ Hỡnh thỏi lỏ kộp: số lượng lỏ ủơn/lỏ kộp; hỡnh thỏi lỏ kộp + Hỡnh thỏi lỏ ủơn:
* Chiều dài lỏ: ủo từ ủiểm tiếp giỏp với cuống lỏ kộp ủến chúp lỏ
* Chiều rộng lỏ: ủo tại vị trớ rộng nhất của lỏ
* Số gõn lỏ chớnh: những ủụi gõn lỏ nổi rừ từ cuống lỏ ủến mộp lỏ - Khả năng sinh trưởng: ủo 30 cõy/giống
+ ðộng thái ra cành của giống vải chín sớm
* Thời gian xuất hiện từng ủợt lộc
* Thời gian kết thỳc từng ủợt lộc
* Số lượng lộc của từng ủợt
* Kớch thước lộc của từng ủợt
+ Chiều cao cõy: ủo từ mặt ủất ủến ủỉnh ngọn.
+ ðường kớnh tỏn cõy: ủo chiều lớn nhất của tỏn cõy theo phương phỏp hỡnh chiếu ủứng.
- đánh giá ựa dạng di truyền các giống vải chắn sớm bằng kỹ thuật PCR và Isoenzyme:
+ Áp dụng cả 2 phương phỏp RAPD và AFLP ủể nghiờn cứu.
+ Cỏc sản phẩm của phản ứng PCR theo phương phỏp RAPD ủược ủiện di trờn gel Agarose (Metaphor Agar Sigma) nồng ủộ 1,2%, dịch ủỳc gel và chạy ủiện di là 1X TBE (Tris Borate EDTA), nhuộm gel bằng dung dịch Ethium bromide nồng ủộ 0,5 microgam/ml. Phản ứng RAPD ủược tiến hành theo chu kỳ nhiệt:
Bước 1: 940C trong 3 phút Bước 2: 940C trong 1 phút
Bước 3: 360C trong 1 phút và 720C trong 1 phút
Nhắc lại 44 chu kỳ từ bước 2. Các oligos primer từ hãng Invitrogen hoặc Operon. Cỏc thành phần cũn lại (Taq polimerase, dNTP, dịch ủệm) ủược sử dụng ở dạng Kit ủặc hiệu cho phản ứng RAPD của hóng Pharmacia.
+ Cỏc sản phẩm của phản ứng AFLP ủược ủiện di trờn gel Polyacrylamide tỷ lệ 19 : 1 ở nồng ủộ 6%, 7,5 mM urea. Kớch thước bản ủiện di 21 cm x 42 cm, chạy ở ngưỡng 2.500 volt. Dịch chạy ủiện di và ủỳc bản gel là ủệm 1 x TBE. Nhuộm gel bằng AgNO3 0,1% theo quy trỡnh của Promega. Sử dụng các bộ kit (Starter AFLP Kit) của hãng Invitrogel. Quy trình thực hiện phương pháp AFLP tiến hành áp dụng theo quy trình của Invitrogel khụng gắn chất ủồng vị phúng xạ hoặc Fluocence.
+ Các hóa chất cơ bản là sản phẩm của hãng Sigma, Prolabo hoặc Merk. Cỏc vật tư khỏc (ống PCR, eppendof, ủầu cụn...) là sản phẩm của hóng Eppendof.
+ Phản ứng PCR ủược thực hiện trờn mỏy chu trỡnh nhiệt Model: PT 100, SN: 25284/ Rating: 100-240 VAC, 50-60Hz, 350 Watts; sản xuất bởi MJ-Research, INC (590 Lincon Street, Waltham, MA 02451 United States of America).
+ Tớnh toỏn phõn tớch kết quả ủiện di: hệ số ủồng dạng di truyền ủược tính theo công thức Lei và Li hoặc phần mềm NTSYS 2.0. Cây phát sinh của
cỏc giống ủược thiết lập trờn phần mềm NTSYS 2.0.
+ Danh mục các oligos primer dùng trong phản ứng RAPD: