Tiếp tục nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ phân đoạn n−hexan của lá cây xăng sê (sanchezia nobilis hook f)

TỔ NG QUAN

Tổng quan về chi Sanchezia

1.1.1 Vị trí phân loại chi Sanchezia

Theo phân loại của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) năm 2020 [12], chi Sanchezia thuộc:

Phân giới: Tracheobionta (Thực vật có mạch)

Siêu ngành: Spermatophyta (Thực vật có hạt)

Ngành: Magnoliophyta (Thực vật hạt kín – Ngọc lan)

Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm – Ngọc lan)

Phân lớp: Asteridae (Cúc) Bộ: Scrophulariales (Hoa môi – Hoa mõm chó)

Họ: Acanthaceae (Ô rô) Chi: Sanchezia Ruiz & Pav (xăng−sê)

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Sanchezia

Sanchezia là cây bụi thường xanh, nửa gỗ, cao từ 1,3 đến 2,4 m, với thân cây trơn nhẵn có màu lục sáng đến tím Lá cây hình ngọn giáo, dài tới 26 cm, mọc đối và có màu lục với các vân vàng hoặc ngà rõ rệt Hoa của cây có màu vàng, hình ống, với bẹ hoa màu đỏ, dài khoảng 5 cm, thường mọc thành chùm từ 6 đến 10 bông ở ngọn hoặc nách lá Quả của Sanchezia là những bao thuôn dài chứa 6 đến 8 hạt tròn, nén chặt.

1.1.3 Đặc điểm phân bố chi Sanchezia

Theo tổ chức The Plant List, chi Sanchezia có 75 tên loài, trong đó có

Trong tổng số 75 tên loài, có 54 tên (chiếm 72%) được chấp nhận, 9 tên (12%) là đồng nghĩa và 12 tên (16%) chưa được đánh giá Trong số các tên được chấp nhận, loài Sanchezia nobilis có mức tín nhiệm trung bình.

Trên thế giới, chi Sanchezia gồm các loài bản địa ở Nam Mỹ (Bolivia,

Bangladesh, Belize, Cameroon, Costa Rica, Cuba, Dominica, El Salvador, Fiji, Guatemala, Guinea, Haiti, Hawaii, Honduras, Jamaica, Mexico,

Nicaragua, Puerto Rico, Trinidad và Tobago, các đảo Cook, Leeward, Solomon, Windward và Việt Nam đều là nơi có sự phân bố của chi Sanchezia Tại Việt Nam, chi này có một loài được phát hiện là S nobilis hay S speciosa, thường được gọi là cây Xăng−sê, lá Ngũ sắc hay cây Khôi đốm Loài này chủ yếu phân bố ở miền núi Tây Giang (Quảng Nam), Hoà Vang (Đà Nẵng), Chiêm Hoá và Na Hang (Tuyên Quang), và mọc nhiều ở miền Bắc Việt Nam.

Tổng quan về loài Sanchezia nobilis

Theo một số tài liệu, loài S nobilis và S oblonga là cùng 1 loài [36, 40,

45] Một số tài liệu khác lại cho rằng S nobilis và S speciosa là cùng 1 loài

Có ít nghiên cứu phân biệt rõ ràng loài S nobilis với các loài gần gũi như S pennellii, S cyathibracteata và đặc biệt là S speciosa, mặc dù điều này cần được chú ý.

Lá của cây S nobilis có hình dạng thuôn mũi giáo rất nhọn, khác biệt hoàn toàn so với lá thuôn hình ê líp của S speciosa Mặc dù vậy, Trung tâm Dữ liệu Thực vật Việt Nam lại xem S speciosa là tên đồng nghĩa với S nobilis.

Hình 1.1 Ảnh chụp lá và hoa của cây S nobilis

1.2.1 Đặc điểm đại phẫu loài S nobilis

Hình 1.2 Cấu tạo tổng thể cây S nobilis [22]

Lá cây có hình trứng hoặc ngọn giáo, không có lá gốc, với kích thước và hình dạng khác nhau, có rìa hơi răng cưa, phần bụng lá bất đối và ngọn lá rất nhọn, mọc đối chữ thập Mặt trên lá có màu xanh đậm, trong khi mặt dưới nhạt hơn và cả hai mặt đều bóng láng với mùi đặc trưng nhẹ Lá có một gân chính và mạng lưới gân phụ, trong đó các gân nổi rõ hơn ở mặt dưới Kích thước lá dài từ 7−9 cm và rộng từ 4−6 cm, cuống lá hình trụ hoặc gần trụ, màu lục với lông rất nhỏ Thường thì cuống lá phía trên ngắn hơn cuống lá phía dưới, với chiều dài cuống từ 1,5−2 cm và chiều rộng từ 2−3 mm.

Cây có thân mọc thẳng đứng, nửa gỗ và sống lâu năm, với chiều cao từ 0,5 đến 1 mét và đường kính từ 0,5 đến 2 cm Phần trên của thân cây có hình tròn, trong khi phần dưới có hình tứ giác Thân cây đơn nhánh, với nhiều lóng dài tới 5 cm ở phần dưới và ngắn hơn ở phần trên.

Những bông hoa mọc thành chùm, tạo thành cụm hoa kép không cuống, phát triển từ hướng xuống lên Hoa lưỡng tính, nhỏ và không cuống, có kích thước khác nhau nhưng hình dạng tương đồng Hoa phát ra mùi nhẹ đặc trưng và có vị hơi đắng, chiều dài dao động từ 2,5 đến 3,5 cm.

Bẹ hoa màu lục, hình thuôn dài hoặc hình ngọn giáo thuôn dài, đỉnh nhọn, có chiều dài 1,2−1,3 cm, chiều rộng 0,25−0,5 cm [22]

+ Đài hoa Đài hoa màu lục, gồm 5 lá đài xen kẽ (cánh rời), có chiều dài 1,3−1,5 cm, chiều rộng 0,2−0,4 cm, xếp đè nhau [22]

Tràng hoa màu vàng cam có 5 cánh hoa dính nhau, hình ống và có lông bên ngoài, với 5 thuỳ, mỗi thuỳ có 2 môi (trong và ngoài) Cánh hoa hình trứng thuôn dài, hẹp ở hai đầu, với viền tròn và chiều dài khoảng 2,5−3 cm.

Bộ nhị hoa bao gồm 4 nhị, chia thành 2 nhị hữu thụ và 2 nhị không phấn Nhị hữu thụ có 2 ô thuôn dài và bao phấn có lông, với sợi tơ dài 1,3−1,5 cm, trong khi sợi tơ của nhị không phấn chỉ dài 0,5−0,7 cm Bao phấn gắn vào sợi tơ do chúng phát triển đồng thời.

Bộ nhuỵ có cấu trúc gồm một noãn kép vượt trội với hai khoang, chiều dài từ 0,3 đến 0,4 cm và đường kính từ 0,2 đến 0,3 cm Mỗi vị trí có hai tiểu noãn gắn vào bầu nhuỵ, với tiểu noãn hướng trục Vòi nhuỵ có chiều dài từ 2,5 đến 3 cm và đường kính từ 0,4 đến 0,5 cm Đầu nhuỵ không phân nhánh và không có nhú.

Hình 1.3 Công thức hoa S nobilis [22]

1.2.2 Đặc điểm bột dược liệu loài S nobilis

1.2.2.1 Bột lá và cuống lá

Tinh th ể calci carbonat Xơ trụ bì Bi ểu bì (dướ i) Xơ m ạ ch libe

Lông che ch ở Bi ể u bì (trên) M ạ ch g ỗ Qu ả n bào

Mô giậu Nhu mô mỏng

Lông tiết Bi ể u bì cu ố ng lá

Hình 1.4 Thành phần bột lá và cuống lá S nobilis [22]

Tinh th ể calci carbonat Xơ trụ bì Xơ bầ n Lông che ch ở

M ạ ch g ỗ Bi ể u bì thân cây Xơ m ạ ch libe Qu ả n bào Ố ng qu ả n bào

Tinh th ể calci oxalat H ạ t tinh b ộ t Mô b ầ n Nhu mô b ầ n

Hình 1.5 Thành phần bột thân S nobilis [22]

1.2.3 Thành phần hoá học loài S nobilis

Năm 2013, Ahmed E.A.E và cộng sự đã nghiên cứu phần trên mặt đất (thân và lá) của S nobilis tại Ai Cập Từ cao MeOH tổng, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 5 hợp chất.

1 hợp chất matsutake alcohol: 1-octen-3-ol (1)

4 hợp chất matsutake alcohol glycosid:

+ 3-O--arabinopyranosyl-(1→6)--glucopyranosyl-1-octen-3-ol (4) + 3-O--arabinopyranosyl-(1→6)--glucopyranosyl-(1→6)--

Trong đó hợp chất 1−4 lần đầu tiên được phân lập từ họ Acanthaceae, hợp chất 5 lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên [23]

Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Ahmed E.A.E tiếp tục nghiên cứu trên mẫu S nobilis tại Ai Cập (2003) và phân lập được 6 hợp chất từ cao

MeOH của thân và lá, 3 hợp chất từ cao MeOH của hoa 9 hợp chất bao gồm:

3 hợp chất cinnamyl alcohol glycosid:

+ 9-O--xylopyranosyl-(1→6)-O--glucopyranosyl-(1→6)-O-- glucopyranosyl trans-cinnamyl alcohol (7)

1 hợp chất neolignan glucosid: 4-O--glucopyranosyl dehydrodiconiferyl alcohol (9)

2 hợp chất benzyl alcohol glycosid:

Trong đó hợp chất 7 lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên, hợp chất 6, 8, 9,

Năm 2018, B.T Xuân và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu mẫu lá cây S nobilis thu hái tại Nam Định, thuộc họ Acanthaceae, và lần đầu tiên phân lập thành công 3 hợp chất từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat Đặc biệt, hợp chất 10−12 và 14 cũng lần đầu tiên được báo cáo từ chi Sanchezia.

Cả 3 hợp chất này đều được phân lập lần đầu tiên từ lá cây S nobilis [6]

Năm 2019, B.T Xuân và cộng sự tiếp tục nghiên cứu trên mẫu lá S nobilis ở Nam Định và phân lập được thêm 2 hợp chất từ phân đoạn dịch chiết n−hexan:

+ Stigmasterol (19) Đây là lần đầu tiên 2 hợp chất này được phân lập từ lá cây S nobilis [5]

Cùng năm 2019, N.T Hiền đã nghiên cứu phân lập được một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước của lá S nobilis ở Nam Định:

Cả 3 hợp chất này đều được phân lập lần đầu tiên từ cây S nobilis cũng như chi Sanchezia [3]

Hình 1.6 Công thức cấu tạo các hợp chất 1−22 1.2.4 Tác dụng dược lý

Năm 2016, Tung B.T và cộng sự đã phân lập thành công 4 hợp chất từ dịch chiết EtOH của lá S speciosa và tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm thông qua thử nghiệm ức chế sự biến tính albumin Kết quả cho thấy hợp chất 3-methyl-1H-benz[f]indole-4,9-dion có hoạt tính mạnh nhất với IC50 = 193,7 ± 5,24 μg/mL, tiếp theo là sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol), quercetin 3-O-β-d-galactopyranosid (hyperosid), và cuối cùng là quercetin.

Vào năm 2016, nghiên cứu của Loi V.D và cộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết EtOH từ lá S speciosa với liều 1,5 g/kg có tác dụng giảm đáng kể triệu chứng phù bàn chân ở chuột, được kích thích bởi 0,05 mL muối Carrageenan 1%.

Năm 2013, Mohammadjavad P và cộng sự xác định khả năng dọn dẹp gốc tự do của phân đoạn MeOH dịch chiết lá S speciosa bằng thử nghiệm

Nghiên cứu của Tung B.T và cộng sự năm 2016 cho thấy dịch chiết EtOH từ lá S speciosa có khả năng chống oxi hóa mạnh mẽ, với hyperosid đạt IC50 = 20,83 ± 1,29 μg/mL, vượt trội hơn so với quercitrin và các hợp chất khác như 3-methyl-1H-benz[f]indole-4,9-dion và daucosterol, khẳng định tiềm năng của chất chống oxi hóa tự nhiên.

Năm 2013, nghiên cứu của Mohammadjavad P và cộng sự đã chỉ ra tác dụng gây độc tế bào của phân đoạn MeOH dịch chiết lá S speciosa trên các tế bào MCF−7, SK−MEL−5 và HUVEC thông qua thử nghiệm MTT, với sự ức chế tăng trưởng tế bào mạnh nhất ở MCF−7, tiếp theo là SK−MEL−5 và thấp nhất ở HUVEC, cho thấy khả năng ức chế chọn lọc tốt hơn so với doxorubicin Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Abu S.R đã tiến hành thử nghiệm độc tế bào trên loài tôm nước mặn Artemia salina để so sánh.

LC50 của phân đoạn n−hexan (19,95 μg/mL) và ethyl acetat (12,88 μg/mL) dịch chiết lá S speciosa với vincristin suphat (10,96 μg/mL), cho thấy tiềm năng kiểm soát ung thư của lá S speciosa [44]

Năm 2018, B.T Xuân và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương bằng hai mô hình thực nghiệm: phương pháp mâm nóng và phương pháp rê kim trên chuột nhắt trắng, sử dụng phân đoạn dịch chiết n-hexan và ethyl acetat từ lá cây S nobilis Kết quả cho thấy liều 16 mg/kg/ngày và 48 mg/kg/ngày của phân đoạn ethyl acetat có tác dụng rõ rệt hơn so với liều 64 mg/kg/ngày và 192 mg/kg/ngày của phân đoạn n-hexan, khi được sử dụng qua đường uống trong 7 ngày liên tiếp.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Đối tượng

Lá cây Khôi đốm, thu hái tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định vào ngày 15/01/2018, đã được xử lý, phơi sấy và bảo quản trong túi nilon kín Mẫu lá này được giám định tên khoa học bởi ThS Nguyễn Quỳnh Nga tại Viện Dược liệu, với kết luận rằng nó thuộc loài Sanchezia nobilis Hook.f.

Acanthaceae (họ Ô rô) với tên Việt Nam là cây Khôi đốm hoặc Xăng xê hoặc

Lá ngũ sắc Mẫu được lưu tại: Phòng Tiêu bản, Khoa Tài nguyên Dược liệu,

Viện Dược liệu (số hiệu: DL−150118) (Phụ lục 1)

+ Dung môi chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH) 70%, n−hexan, ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (CH2Cl2)…; tất cả đều đạt tiêu chuẩn phân tích

+ Hóa chất định tính: FeCl3, NaOH, H2SO4, HCl, phenolphtalein, thuốc thử Fehling,…

+ Đo nhiệt độ nóng chảy: Máy Mikroskopheiztisch PHMK−50 (VEB Wagetechnik Rapido, Đức)

+ Ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz), DEPT−90 và 135 MHz): Quang phổ kế AVANCE AV 500

(Brucker, Đức) tại Viện Hoá học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST)

+ Ghi phổ khối tia điện ion hoá (ESI−MS): Khối phổ kế Varian Agilent

+ Sắc ký bản mỏng (TLC): Bản mỏng Kieselgel 60 F254 (Merck) (silicagel, độ dày 0,25 mm) và RP−18 F254 (Merck) (silicagel, độ dày 0,25 mm)

+ Sắc ký cột (CC): Silicagel pha thường cỡ hạt 70−230 và 230−400 mesh (Merck) và các cột sắc ký có kích cỡ khác nhau

+ Dụng cụ thí nghiệm: pipet, ống nghiệm, bình chiết, cốc có mỏ, bình gạn…

+ Các thiết bị khác: tủ sấy, tủ hotte, cân phân tích, máy cô quay, đèn UV…

Phương pháp nghiên cứ u

2.2.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất

Mẫu lá S nobilis Hook.f sau khi được rửa sạch và phơi khô, được cắt nhỏ và ngâm chiết bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày để thu dịch chiết lần 1 Tiếp theo, bổ sung dung môi ngập dược liệu từ 2−3 cm để thu dịch chiết lần 2 và lần 3 Cuối cùng, gộp dịch chiết từ 3 lần, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao tổng EtOH.

Phân tán cao tổng EtOH trong nước cất và chiết phân bố bằng n-hexan và ethyl acetat Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được các cắn: n-hexan (H) và ethyl acetat (E) Phần dịch nước còn lại được cô cạn để thu được cắn nước (N).

Tiến hành xử lý và phân lập hợp chất từ cắn n-hexan thông qua phương pháp sắc ký cột Quá trình phân lập được theo dõi bằng kỹ thuật TLC để xác định các phân đoạn thu được.

Sắc ký cột được thực hiện bằng cách sử dụng chất hấp phụ silicagel pha thường với kích cỡ hạt từ 70−230 và 230−400 mesh (Merck) trong các loại cột sắc ký có kích thước khác nhau Quy trình này bao gồm việc lựa chọn các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần để tối ưu hóa hiệu quả tách biệt.

+ Sắc ký bản mỏng: Thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60

F254 (Merck), độ dày 0,25 mm và RP−18 F254, độ dày 0,25 mm (Merck)

Sau khi thực hiện sắc ký, các vết sẽ được kiểm tra bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm Tiếp theo, thuốc thử sẽ được phun lên bề mặt để hiện màu, cho thấy sự hiện diện của các chất trong dung dịch.

H2SO4 10%, sau đó làm nóng bằng súng nhiệt

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

2.2.2.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được qua 2 bước chính

+ Bước 1: Thực hiện đo nhiệt độ nóng chảy, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

( 1 H−NMR, 13 C−NMR, DEPT), phổ khối (MS), thiết lập bộ dữ liệu của các chất phân lập được

+ Bước 2: So sánh bộ dữ liệu của các chất phân lập được với dữ liệu của các chất đã công bố

2.2.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ NMR)

Các kỹ thuật phổ NMR cho phép xác định mối liên hệ giữa các proton và carbon trong phân tử, từ đó xây dựng cấu trúc phân tử của hợp chất Kết hợp với phổ khối và thông tin khác, NMR cung cấp nhiều dữ liệu đặc trưng về cấu trúc phân tử Việc so sánh phổ proton hoặc carbon một chiều của chất cần phân tích với một chất đã biết giúp xác định chất đó một cách đáng tin cậy.

2.2.2.3 Phổ khối tia điện ion hoá (ESI−MS)

Dưới cùng một điều kiện, sự phân mảnh của ion mẹ tạo ra các ion con theo những quy luật nhất định, với các chất có cấu trúc tương tự tạo ra những phân mảnh giống nhau Bằng cách sử dụng ESI−MS và các phương pháp phổ khác, kết hợp với ngân hàng dữ liệu phổ, chúng ta có thể xác định cấu trúc và định danh các chất chưa biết.

KẾ T QU Ả NGHIÊN C Ứ U VÀ BÀN LU Ậ N

K ế t qu ả

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất lá S nobilis phân đoạn n−hexan

Lá Sanchezia nobilis Hook.f (3,0 kg) sau khi rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô và sấy ở 80°C trong 6 tiếng, được ngâm chiết bằng 12 L dung môi ethanol 70% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, với chiều cao dung môi ngập dược liệu từ 2−3 cm Sau đó, dịch chiết lần 1 được rút ra và bổ sung thêm dung môi để ngâm dược liệu tương tự với khoảng 10 L.

Cao chiết tổng pha loãng

Pha nước Pha hữu cơ

Cô quay thu hồi dung môi

Cô quay thu hồi dung môi

Sau khi thực hiện quá trình dịch chiết bằng ethanol (EtOH) ba lần, các mẫu chiết được gộp lại và lọc qua giấy lọc Tiếp theo, dung môi EtOH được thu hồi bằng phương pháp cất dưới áp suất giảm, mang lại 251,2 g cao chiết tổng từ ethanol.

150 g cao chiết tổng EtOH được hòa tan trong 150 mL nước cất với tỷ lệ 1:1 (m/v) Dịch chiết được phân bố ba lần với 900 mL n-hexan trong mỗi lần trong 30 phút, thu được pha hữu cơ n-hexan và pha nước Sau khi cất dung môi dưới áp suất giảm, thu được 28,6 g cắn n-hexan ký hiệu là H Pha nước sau đó được chiết tiếp với dung môi ethyl acetat.

3.1.2.1 Phân lập giai đoạn 1 Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel pha thường cỡ hạt 70−230 và 230−400 mesh (Merck) và dung môi sắc ký là n−hexan : dichloromethan (14:1; v/v)

Chất nhồi cột: Silicagel được hoạt hoá ở 100°C/2h trong tủ sấy rồi để nguội trong bình hút ẩm

+ Cột sắc ký đường kính 5 cm, có lớp lọc frit, được lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạch bằng EtOH

Để chuẩn bị cột sắc ký, trước tiên bạn cần khóa van cột và đổ 40 mL dung môi sắc ký vào cột Sau đó, mở van để dung môi chảy từ từ, giúp tráng cột và loại bỏ bọt khí trong lớp lọc frit Khi bề mặt dung môi còn cách lớp lọc khoảng 3 cm, hãy khóa van cột lại.

Để chuẩn bị cột silicagel, lắc silicagel với một lượng vừa đủ dung môi sắc ký cho đến khi đạt được hỗn dịch đồng nhất, đảm bảo silicagel lắng xuống sau 30 giây ngừng lắc Tiếp theo, đổ nhanh hỗn dịch vào cột, đồng thời gõ nhẹ quanh thành cột bằng quả bóp cao su để silicagel được nén chặt, phân bố đều và thoát hết bọt khí Sau đó, rửa thành cột bằng dung môi sắc ký và mở van cột để silicagel lắng nhanh hơn Chiều dài cột silicagel cần đạt 30 cm.

Để đảm bảo cột ở vị trí thẳng đứng, hãy khóa van cột và sử dụng quả bóp cao su gõ nhẹ, đều và đối xứng quanh thân cột cho đến khi không còn bọt khí Để cột ổn định trong 10 phút, cần chú ý giữ dung môi cách bề mặt silicagel ít nhất 5 cm và tránh để dung môi bay hơi quá nhiều.

+ Mở van cột cho dung môi sắc ký chảy đến sát bề mặt silicagel, khóa van cột

Để phân lập 18 g n-hexan (H), sử dụng cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường và hệ dung môi rửa giải n-hexan : dichloromethan theo tỷ lệ 14:1 (v/v) Tốc độ rửa giải được điều chỉnh ở mức 1 mL/phút.

Hứng dịch rửa giải vào các ống và kiểm tra bằng TLC, các ống có sự tương đồng được gộp lại Cụ thể, gộp các ống 2−16 thu được phân đoạn H1 với khối lượng 8 g, gộp các ống 17−20 thu được phân đoạn H2 nặng 5 g, và gộp các ống 21−22 tạo ra phân đoạn H3 có khối lượng 4 g.

3.1.2.2 Phân lập giai đoạn 2 Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel pha thường cỡ hạt 70−230 và 230−400 mesh (Merck).

Tiến hành chuẩn bị cột và chất nhồi cột tương tự giai đoạn 1 với cột sắc ký đường kính 3 cm

Tiến hành sắc ký cột cắn phân đoạn H1 sử dụng chất hấp phụ silicagel và hệ dung môi n−hexan : dichloromethan với tỉ lệ 10:1 (v/v) Dịch rửa giải được hứng vào các ống và kiểm tra bằng phương pháp TLC Các ống có thành phần tương đồng được gộp lại, sau đó bốc hơi dung môi, thu được 4 phân đoạn nhỏ là H1.1, H1.2, H1.3 và H1.4.

Phân đoạn H1.3 (1,9 g) và H1.4 (1,8 g) đã được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel, sử dụng dung môi chloroform : methanol (5:1; v/v) cho H1.3, thu được hợp chất S3 (56 mg), và dung môi n−hexan : chloroform (3:1; v/v) cho H1.4, thu được hợp chất S4 (41 mg).

Tiến hành sắc ký cột phân đoạn H2 sử dụng chất hấp phụ silicagel và hệ dung môi n−hexan : ethyl acetat (tỉ lệ 10:1, 5:1; v/v) Dung dịch rửa giải được hứng vào các ống và kiểm tra bằng phương pháp TLC Các ống có cùng thành phần được gộp lại và dung môi được bốc hơi, thu được hai phân đoạn nhỏ là H2.1 và H2.2.

Phân đoạn H2.1 (1,8 g) được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n−hexan : dichloromethan (4:1; v/v) thu được hợp chất ký hiệu là S5 (29 mg)

3.1.3 Kết quảxác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

+ Hợp chất S3: Hexadecanoic acid (axit palmitic)

Tinh thể màu trắng đến vàng, t°nc = 43–44°C

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ DEPT, 13 C−NMR và 1 H−NMR của hợp chất S3 và hợp chất tham khảo [28]

Hợp chất S3 Hợp chất tham khảo [28]

C DEPT C ab ppm δH ac ppm

(Mult; J=Hz) C ab ppm δH ac ppm

OH − − − 3,75 (s) a Đo trong CDCl 3 ; b Đo ở 125 MHz; c Đo ở 500 MHz

Dữ liệu phổ ESI−MS của hợp chất S3 cho thấy pic ion phân tử ở m/z 257,0 [M+H]+ và m/z 255,0 [M−H]−, tương ứng với khối lượng phân tử M = 256 Phổ 13C−NMR và DEPT chỉ ra rằng hợp chất S3 có 16 carbon, với tín hiệu δC 179,7 (C-1) thể hiện carbon ở nhóm carboxyl Các tín hiệu khác bao gồm δC 34,0 (C-2), 31,9 (C-14), và 5 carbon đối xứng C-7, C-8, C-9, C-10, C-11 tạo tín hiệu cao δC 29,7 Nhiều tín hiệu gần nhau như δC 29,4 (C-4), 29,6 (C-5), 29,4 (C-13), 29,3 (C-6), 29,1 (C-12), cùng với δC 24,7 (C-3), 22,7 (C-15), và 14,1 (C-16) Dữ liệu phổ 1H−NMR cho thấy hợp chất S3 có 32 hydro, bao gồm tín hiệu δH 2,34 (2H, t, Ј=7,0, H-2) và tín hiệu δH 1,63.

(2H, m, J=7,5, H-3); tín hiệu δH 1,26 (24H, m) thể hiện 24 hydro là H-4, H-5, H-6, H-7, H-8, H-9, H-10, H-11, H-12, H-13, H-14 và H-15; tín hiệu δH 0,88 (3H, t, J=7,0, H-16) So sánh dữ liệu phổ trên với dữ liệu tham khảo [28], kết luận hợp chất S3 là hexadecanoic acid (axit palmitic)

Hình 3.2 Cấu trúc hợp chất S3 + Hợp chất S4: (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoic acid (axit linoleic)

Chất lỏng, sánh, không màu

Phổ ESI−MS: m/z 281,0 [M+H] + CTPT: C18H32O2 (M(0) (Phụ lục

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ DEPT, 13 C−NMR và 1 H−NMR của hợp chất S4 và hợp chất tham khảo [16]

Hợp chất S4 Hợp chất tham khảo [16]

C DEPT C ab ppm δH ac ppm

(Mult; J=Hz) C ab ppm δH ac ppm

18 CH3 14,0 0,89 (t) 14,09 0,88 (t; 7,0) a Đo trong CDCl 3 ; b Đo ở 125 MHz; c Đo ở 500 MHz

Dữ liệu phổ ESI−MS hợp chất S4 cho thấy pic ion phân tử ở m/z 281,0

Hợp chất S4 có khối lượng phân tử M = 280, được dự đoán là axit béo không bão hòa mạch thẳng với 18 carbon Dữ liệu phổ 13C–NMR và DEPT cho thấy nhóm carboxyl có tín hiệu C 179,6 (C-1) và 4 methin olefinic carbon với các tín hiệu C 130,0 (C-9), 128,1 (C-10), 127,9 (C-12), 130,2 (C-13) Ngoài ra, hợp chất này còn có 1 nhóm methyl với tín hiệu C 14,0 (C-18) và các nhóm methylen có tín hiệu C 22,6−34,0 Dữ liệu phổ 1H–NMR cho thấy S4 có 32 hydro, với các tín hiệu bao gồm 4 olefinic proton tại δH 5,31−5,40 (4H, m, H-9, H-10, H-12, H-13), 2 proton gắn với bis-allylic carbon tại δH 2,77 (2H, t, J=7,0, H-11), 2 proton trong nhóm methylen ở vị trí α của nhóm carboxyl tại δH 2,34 (2H, t, H-2), 4 proton gắn với allylic carbon tại δH 2,05 (4H, m, H-8, H-14) và nhóm methyl tận cùng tại δH 0,89 (3H, t, H-18) Các hằng số ghép thấp cho thấy cấu hình của hợp chất.

Z của 2 liên kết đôi So sánh dữ liệu phổ trên với dữ liệu tham khảo [16], kết luận hợp chất S4 là (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoic acid (axit linoleic)

Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất S4 + Hợp chất S5: (Z)-octadec-9-enoic acid (axit oleic)

Chất lỏng, sánh, không màu

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ DEPT, 13 C−NMR và 1 H−NMR của hợp chất S5 và hợp chất tham khảo [8]

Hợp chất S5 Hợp chất tham khảo [8]

C DEPT C ab ppm δH ac ppm

(Mult; J=Hz) C ab ppm δH ac ppm

18 CH3 14,1 0,89 (t; 7,0) 14,1 0,88 (t; 7,0) a Đo trong CDCl 3 ; b Đo ở 125 MHz; c Đo ở 500 MHz

Dữ liệu phổ ESI−MS của hợp chất S5 cho thấy pic ion phân tử tại m/z 283,0 [M+H]+ và m/z 281,0 [M–H]–, tương ứng với khối lượng phân tử M = 282 Phổ 13C–NMR và DEPT chỉ ra rằng hợp chất S5 có 18 carbon, trong đó có 2 tín hiệu tại δC 130,0 (C-9) và 129,7 (C-10) của carbon chưa bão hòa, tín hiệu δC 180,3 (C-1) của nhóm carboxyl, 1 tín hiệu δC 14,1 (C-18) của methyl carbon, cùng với các tín hiệu methylen carbon khác Phổ 1H–NMR cho thấy hợp chất S5 có 34 hydro, bao gồm tín hiệu δH 0,89 (3H, t, J=7,0, H-18) của nhóm methyl tận cùng và dải tín hiệu δH 1,26−1,37 (22H, m) của các methylen proton.

2,04 (4H, m, H-8, H-11) là các nhóm methylen vị trí α của nhóm C=C; δH

2,34 (2H, t, H-2) là nhóm methylen vị trí α của nhóm carboxyl; tín hiệu δH

5,34 (2H, m, H-9, H-10) là các proton chưa bão hoà So sánh dữ liệu phổ trên với dữ liệu tham khảo [8], kết luận hợp chất S5 là (Z)-octadec-9-enoic acid (axit oleic)

Hình 3.4 Cấu trúc hợp chất S5

Bàn lu ậ n

Kết quả nghiên cứu đã phân lập thành công ba axit béo từ phân đoạn n-hexan của cây S nobilis, bao gồm axit palmitic, axit linoleic và axit oleic Quá trình này được thực hiện thông qua phương pháp ngâm chiết với dung môi EtOH, sau đó tách phân đoạn bằng n-hexan Cấu trúc của các hợp chất được xác định thông qua các phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối và cộng hưởng từ hạt nhân, và kết quả được so sánh với dữ liệu đã được công bố.

Dầu chiết xuất từ lá và hạt của nhiều loài thực vật chứa các axit béo bão hoà, chủ yếu là axit palmitic, cùng với axit béo không bão hoà như axit linoleic và axit oleic Thành phần axit béo trong hạt có sự khác biệt giữa các loài, trong khi lá thường giữ nguyên Các axit béo này có khả năng ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại vi sinh vật như vi tảo, vi khuẩn, nấm, và virus, điều này đã được nghiên cứu và ghi nhận trong nhiều thập kỷ qua.

Axit béo và monoglycerid là nguyên liệu chính trong phụ gia bảo quản thực phẩm, có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn qua nhiều cơ chế khác nhau Tính kháng khuẩn của chúng liên quan đến cấu trúc hóa học, với axit bão hòa mạch ngắn và axit không bão hòa mạch dài thể hiện hiệu quả tốt hơn Đặc biệt, cấu hình cis- của axit không bão hòa cho tác dụng mạnh mẽ hơn so với cấu hình trans-, và vị trí liên kết đôi ở axit mạch dài cũng đóng vai trò quan trọng Chỉ có vi khuẩn Gram (+) và một số vi khuẩn Gram (−) là nhạy cảm với axit béo.

Bảng 3.4 Liên quan cấu trúc axit béo với tác dụng kháng khuẩn [35]

Cấu trúc axit béo Độc tính trên vi khuẩn

Chuỗi ngắn (< 6C) Nồng độ cao trên vi khuẩn Gram (−), phụ thuộc pH

Chuỗi dài Nồng độ thấp trên vi khuẩn Gram (+), không phụ thuộc pH

Cấu hình không gian Đồng phân cis- hoạt động mạnh hơn đồng phân trans-

Mức độ bão hoà Giảm mức bão hoà làm tăng tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) Bảng 3.5 Tác dụng của axit béo lên enoyl reductase vi khuẩn Gram (+) [32]

*Axit palmitic không có tác d ụ ng dù ở n ồng độ >2 mM [32]

Bảng 3.6 Nồng độức chế tối thiểu của axit béo (đơn vị: mM)* [30]

Vi sinh vật Axit palmitic Axit oleic Axit linoleic

Streptococcus nhóm D NI NI NI

Streptococcus beta−hemolytic non−A 3,9 NI 0,089

*NI = không ứ c ch ế ở n ồng độ th ử nghi ệ m (1,0 mg/mL ho ặc 3,0−6, 0 mM) V ớ i axit không bão hoà, ch ỉ c ấ u hình cis- có tác d ụ ng [30]

Vi khuẩn Helicobacter pylori là nguyên nhân chính gây viêm loét dạ dày tá tràng Nghiên cứu của Bo K.Y và cộng sự năm 2018 cho thấy axit lauric có khả năng diệt H pylori ở nồng độ 1 mM, trong khi monoglycerid chuỗi 10−14 carbon của axit lauric (GML) diệt H pylori ở nồng độ 0,5 mM với ít khả năng hình thành kháng thuốc Ngoài ra, các axit béo bão hòa và monoglycerid của chúng cũng như các axit béo đa không bão hòa như axit linolenic đều có hiệu quả trong việc tiêu diệt H pylori.

Axit palmitic (C16:0) là axit béo bão hòa phổ biến nhất trong cơ thể, chiếm 20−30% tổng axit béo trong màng phospholipid và triacylglycerol của mô mỡ Nó có mặt với tỷ lệ lớn trong nhiều sản phẩm tự nhiên như dầu cọ (44%), thịt và sữa (50−60%), bơ ca cao (26%), dầu ô liu (8−20%) và sữa mẹ (20−30%) Mức tiêu thụ axit palmitic hàng ngày của con người khoảng 20−30 g, và sự thay đổi trong lượng tiêu thụ thường không ảnh hưởng đáng kể đến nồng độ của nó trong mô.

Axit palmitic đã được chứng minh có khả năng chống viêm thông qua việc ức chế cạnh tranh enzym phospholipase A2, với hằng số ức chế Ki là 1,58 × 10 −5 M và giá trị IC50 đạt 43,26 × 10 −5 M Nghiên cứu của Vasudevan A và cộng sự năm 2012 cho thấy năng lượng gắn ΔG là −8,69 kcal/mol Thêm vào đó, thử nghiệm in silico chỉ ra rằng axit palmitic có năng lượng gắn tự do là 58,14 kcal/mol, tương đương với các chất ức chế khác.

Nghiên cứu của Chifu B.H và cộng sự năm 2011 chỉ ra rằng axit palmitic và một số axit béo khác có khả năng tiêu diệt hiệu quả các vi khuẩn Gram (−) Mặc dù tác dụng kháng khuẩn của các axit béo có thể được tăng cường bởi ethanol, yếu tố này không làm giảm đi tầm quan trọng của các axit béo trong việc chống lại vi khuẩn.

Bảng 3.7 Tỷ lệ ức chế (%) của axit palmitic so với đối chứng âm [13]

Aggrega- tibacter actinomy- cetemco- mitans

*Dựa trên tỷ lệ CFU 24 giờ giữa 3 đĩa có 25 μg/mL axit palmitic so với đối chứng âm [13]

Nghiên cứu của Eva J và cộng sự năm 2013 cho thấy axit palmitic có tác dụng trên Escherichia coli: kìm khuẩn ở nồng độ10−20 ppm, diệt khuẩn ở nồng độ 30 ppm (bảng 3.8) [28]

Bảng 3.8 Đường kính vùng ức chế (mm) vi khuẩn E coli của các chất [28]

Chất sử dụng Vùng ức chế sau 24 giờ Vùng ức chế sau 48 giờ

Axit palmitic 30 ppm 13,00 16,50 Đối chứng âm (DMSO) 0,00 0,00 Đối chứng dương

+ Axit linoleic ((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoic acid) và axit oleic ((Z)- octadec-9-enoic acid)

Axit linoleic (C18:2, n−6) là axit béo đa không bão hòa phổ biến nhất trong cơ thể, đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp prostaglandin, màng tế bào và axit arachidonic Hỗn hợp đồng phân của C18:2 mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, bao gồm chống ung thư, tiểu đường, viêm, béo phì và xơ vữa động mạch, đã được chứng minh qua các nghiên cứu in vitro và in vivo Tuy nhiên, tác dụng của các đồng phân khác nhau có thể khác nhau, và một số có thể gây hại cho sức khỏe trong những điều kiện nhất định.

Axit oleic (C18:1) là axit béo đơn không bão hoà, chủ yếu có trong dầu ô liu, rất quan trọng cho dinh dưỡng con người Nó giúp giảm LDL-cholesterol, cholesterol toàn phần và chỉ số đường huyết Axit oleic là thành phần chính trong chế độ ăn Địa Trung Hải, mang lại nhiều lợi ích cho hệ miễn dịch và hỗ trợ điều trị, ngăn ngừa các bệnh như bệnh tim mạch, bệnh tự miễn, rối loạn chuyển hoá, tổn thương da và ung thư Ngoài ra, axit oleic còn đóng vai trò quan trọng trong việc hấp thu một số thuốc, bao gồm một số NSAID.

Nghiên cứu của Dilika F và cộng sự năm 2000 chỉ ra rằng axit linoleic và axit oleic chiết xuất từ cây Helichrysum pedunculatum có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn Gram dương Hai axit này thể hiện tác dụng hiệp đồng mạnh mẽ khi được sử dụng kết hợp, nhưng không có hiệu quả đối với vi khuẩn Gram âm.

Nghiên cứu của Chang J.Z và cộng sự năm 2005 cho thấy axit linoleic và axit oleic có khả năng ức chế enoyl−acyl carrier protein reductase (FabI), một yếu tố quan trọng trong quá trình tổng hợp và kéo dài chuỗi axit béo ở vi khuẩn Cơ chế ức chế của axit linoleic diễn ra qua việc gắn vào enzym tự do, ngăn cản sự gắn kết của cofactor nucleotid, cũng như gắn vào phức hợp FabI−NADPH, cản trở sự gắn kết của cơ chất.

Bảng 3.9 Nồng độức chế tối thiểu của axit béo (đơn vị: mg/mL)* [26]

Vi khuẩn Gram Axit linoleic

Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Serratia marcescens

*NA = không có tác d ụ ng

Các axit béo tự nhiên như axit palmitic, axit linoleic và axit oleic có tiềm năng lớn trong việc ức chế vi sinh vật, hỗ trợ điều trị bệnh cho cả người và động vật Đặc biệt, cây Sanchezia nobilis được biết đến với khả năng tiêu diệt vi khuẩn H pylori gây viêm loét dạ dày tá tràng, mặc dù chưa có tài liệu nào xác thực điều này ở Việt Nam Nghiên cứu đã phân lập thành công ba hợp chất từ lá cây S nobilis tại Nam Định, cho thấy đây là nguồn dược liệu quý giá Cần tiếp tục nghiên cứu và khai thác thông tin để chứng minh hiệu quả của các bài thuốc dân gian liên quan đến cây này.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận: Sau quá trình nghiên cứu và thực nghiệm, đề tài đã thu được một số kết quả:

Sử dụng phương pháp ngâm chiết với dung môi EtOH 70%, kết hợp với phương pháp sắc ký cột, đã thành công trong việc chiết xuất và phân lập 3 hợp chất từ phân đoạn n−hexan của lá cây Sanchezia noblis thu hái tại tỉnh Nam Định.

Để xác định cấu trúc của các hợp chất, chúng tôi đã sử dụng các kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân Các dữ liệu này được so sánh với thông tin đã công bố về các hợp chất liên quan Qua quá trình phân tích, ba hợp chất đã được xác định bao gồm axit palmitic (S3), axit linoleic (S4) và axit oleic (S5).

+ Tiếp tục nghiên cứu, chiết xuất và phân lập thêm các hợp chất từ phân đoạn n−hexan của lá cây S nobilis

Thử nghiệm chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của cây S nobilis, bao gồm hoa, thân và rễ, cũng như các phân đoạn như ethyl acetat và nước, nhằm khám phá thêm các thành phần mới hoặc có hoạt tính.