TỔ NG QUAN
T ổ ng quan v ề chi Sanchezia
1.1.1 Vị trí phân loại chi Sanchezia
Theo “Hệ thống phân loại về ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)” [1, 26] của tác giảA.Takhtajan”, vị trí phân loại chi Sanchezia là:
Lớp Cỏ tháp bút: Equisetopsida C Agardh
Phân lớp Mộc lan: Magnoliidae Novák ex Takht
1.1.2 Sốlượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Sanchezia
Chi Sanchezia được đặt theo tên của giáo sư thực vật học ở Cadiz là
Chi Sanchezia được Jose Sanchez phát hiện vào thế kỷ XIX tại Cadiz, Tây Ban Nha Lần đầu tiên vào năm 1794, Ruiz và Pavon đã mô tả 2 loài thuộc chi này Đến năm 1964, Leonard và Smith công bố có tổng cộng 59 loài, trong đó 26 loài được mô tả lần đầu và cung cấp khóa phân loại cho chúng Tuy nhiên, vào năm 2015, Tripp và Koenemann đã thống kê lại và lập danh mục 55 loài thuộc chi Sanchezia.
Các nhà khoa học thực hiện dự án The Plant list đã xác định có 75 tên loài thuộc chi, trong đó có 54 tên khoa học được chấp nhận (72,0%), 12 tên
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU chưa xác định được chính xác thông tin (16,0%) và 9 tên được xác định là tên đồng nghĩa (12,0%) [37]
Chi Sanchezia thường được trồng làm cây cảnh, phân bố ở phía Tây Nam Mỹ, một số ít loài phân bố ở vùng phía Bắc và Đông Bắc của Bắc Mỹ,
Trung Mỹ, vùng biển Caribbean và nhiều hòn đảo ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dươngnhư quần đảo Cook, Hawaii, Fiji và New Caledonia [9, 12, 30]
Chi Sanchezia tại Việt Nam chỉ có một loài duy nhất, được ghi nhận trong “Danh mục các loài thực vật Việt Nam” của Nguyễn Tiến Bân, đó là cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook F) Loài này chủ yếu phân bố ở khu vực miền núi Tây Giang, tỉnh Quảng Nam.
Vang - Đà Nẵng, miền núi Chiêm Hóa, Na Hang - Tuyên Quang, tỉnh Nam Định [1]
1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Sanchezia
Chi Sanchezia là một loại cây bụi hoặc cỏ xanh nửa mùa, thường sinh trưởng trong các khu rừng mưa nguyên sinh và rừng nhiệt đới thứ sinh Hoa của cây thường mọc đơn lẻ hoặc thành chùm, có kích thước lớn và đa dạng màu sắc như vàng, cam, đỏ hoặc tím, thường xuất hiện ở phần ngọn của cây.
Lá bắc có màu đỏ, dài khoảng 5cm, trong khi lá đài có màu xanh đậm với vân trắng kem hoặc vàng, hình mác và dài khoảng 26cm Đài hoa có 5 thùy, tràng hoa gồm 5 cánh dính nhau tạo thành hình ống, với 4 nhị, trong đó có 2 nhị thò ra và bao phấn có 2 ô Quả nang chứa từ 6 đến 8 hạt, hạt có hình cầu.
[17] Thân cây trơn màu xanh, rễ cây không có lông [3].
T ổ ng quan v ề cây Khôi đố m
Tên khoa học: Sanchezia speciosa Leonard
Tên Việt Nam: Khôi đốm, Xăng sê, Ngũ sắc [1]
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Cây Khôi đốm, có nguồn gốc từ Peru và Ecuador, chủ yếu phân bố ở các vùng núi Tây Giang (Quảng Nam), Hòa Vang (Đà Nẵng) và miền núi Chiêm Hóa, Na Hang (Tuyên Quang), cũng như Nam Định Loài cây này phát triển tốt nhất trong khí hậu nhiệt đới, mát mẻ và trong lành.
1.2.2 Đặc điểm thực vật cây Khôi đốm
Khôi đốm là cây bụi thường xanh lâu năm, được mô tả bởi Phạm Hoàng Hổ trong "Cây cỏ Việt Nam" Cây có chiều cao từ 0,5 đến 1,5m, đôi khi lên tới 3m, với thân cây màu xanh lá cây Gân chính của lá có màu lục, đỏ hoặc vàng, trong khi gân bên có màu trắng và không có lông Lá đơn, mọc đối hình chữ thập, dài khoảng 10 cm.
Lá cây có kích thước 25cm, rộng từ 3 đến 7cm, với bề mặt nhẵn và mép lá hơi lượn sóng Mặt trên của lá có màu xanh đậm, trong khi mặt dưới có màu xanh nhạt Hệ gân trên lá dạng lông chim, với 9 đến 12 đôi gân bên, và cuống lá ngắn.
Hình 1.1: Hình ảnh cây Khôi đốm
Cây Khôi đốm sở hữu hoa nở liên tục suốt cả năm, với cụm hoa bông ở ngọn có cuống ngắn, thường từ 3 bông nhỏ trở lên Lá bắc của hoa có màu lục hoặc đỏ, hình trứng, đỉnh tù và nhẵn, ôm lấy cụm hoa, cao từ 4 đến 5 cm, tạo nên vẻ đẹp đặc trưng cho cây.
Trường Đại học Y Dược, VNU, nghiên cứu về tiểu nhị thò dài, thụ 2, nép 2, nang 8 hột, cho thấy hoa lưỡng tính với màu xanh lục mờ và mùi hoa nhạt đặc trưng.
Hình 1.2: Hình ảnh cơ quan sinh sản của cây Khôi đốm[4]
Chú thích: 1 Cụm hoa; 2 Hoa nguyên vẹn; 3 Các bộ phận của hoa; 4 Đài;
5 Tràng; 6,7 Bộ nhị; 8 Bầu cắt ngang; 9 Bầu cắt dọc Đài nhiều, hình vảy, dài 1,5 - 1,8cm , rộng 3 - 5mm, tròn ở đỉnh [23] Tràng cảu cánh hoa hợp nhất, hình ống tròn, cao 4 - 5,5cm, rộng 7 - 8cm ở phía trên, thu hẹp dần xuống dưới đến 3mm, màu vàng, có sáp; các thùy dài 3 - 4mm, tròn, có khía; chỉ nhị dài, nhị 4 trong đó có 2 nhị phát triển dài 4 - 4,5cm, có lông và 2 nhị tiêu giảm [3, 24] Quả nang có 8 hạt, có nơ, hình trụ [3]
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
1.2.3 Đặc điểm vi phẫu cây Khôi đốm
Thân già vi phẫu hình vuông có cấu tạo từ ngoài vào trong với lớp biểu bì là hàng tế bào có lông che chở đơn bào Tiếp theo là mô dày gồm 6 - 8 hàng tế bào xếp thành hình tròn khép kín Bên trong là lớp mô mềm với 5 - 7 lớp tế bào chứa tinh thể calcioxalat hình kim và hạt tinh bột đơn Libe gần như hình tròn khép kín, với libe ở ngoài và gỗ ở trong, thỉnh thoảng bị ngăn cách bởi một số tế bào mô mềm Mô mềm ruột gồm nhiều lớp tế bào có thành mỏng, hình đa giác, xếp lộn xộn, và bên ngoài cùng có thêm một lớp bần.
Thân non vi phẫu hình tròn Cấu tạo tương tự thân già, nhưng không có lớp bần bên ngoài cùng [7, 10]
Hình 1.3: Hình vẽ mô tả vi phẫu thân [10]
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Hình 1.4: Đặc điểm vi phẫu thân [4]
Hình ảnh vi phẫu gân lá cho thấy hai mặt trên và dưới đều lồi lên, với cấu trúc biểu bì được hình thành từ một hàng tế bào đa giác xếp đều đặn Mô dày ở cả hai mặt chứa nhiều lớp tế bào có thành dày ở các góc Mô mềm bao gồm các tế bào thành mỏng, gần như tròn, chứa tinh thể canxi oxalat và hạt tinh bột, xen kẽ là các bó mạch phụ Libe gỗ được sắp xếp theo hình vòng cung, với libe nằm ở phía ngoài và gỗ ở phía trong Một số tế bào biểu bì có lông che chở và lông tiết.
Hình ảnh vi phẫu cuống lá giống như hình chén, đặc điểm tương tự như gân lá, tuy nhiên có thêm lớp mô dày sát lớp biểu bì [10]
Vi phẫu phiến lá bao gồm hai lớp biểu bì, với biểu bì trên và dưới được cấu tạo từ một hàng tế bào đa giác sắp xếp đồng đều Dưới biểu bì trên là mô giậu, tạo nên cấu trúc vững chắc cho lá.
Trường Đại học Y Dược và Dược phẩm VNU có cấu trúc tế bào bao gồm hai hàng tế bào hình chữ nhật được sắp xếp đều đặn Mô khuyết cấu của trường bao gồm các tế bào hình gần tròn được sắp xếp một cách lộn xộn.
Hình 1.5: Hình vẽ mô tả vi phẫu lá [10]
Hình 1.6: Đặc điểm vi phẫu lá [4]
1.2.4 Đặc điểm vi học bột dược liệu
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Bột lá có màu xanh nhạt và vị hơi đắng, khi soi dưới kính hiển vi, ta thấy chứa nhiều mảnh khác nhau như mảnh biểu bì, mảnh biểu bì mang lông tiết, lỗ khí, mảnh mô khuyết, mô mềm, mô giậu, mô dày, cùng với mảnh mạch xoắn và mạch điểm Đặc biệt, bột lá còn chứa tinh thể calci oxalat hình kim, hạt tinh bột và lông tiết, lông che chở.
Hình 1.7: Hình vẽ mô tả bột lá [10]
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Hình 1.8: Đặc điểm vi phẫu bột lá [4]
Chú thích:1 Lỗ khí; 2 Mảnh mô mềm; 3 Mảnh mô dày; 4 Mảnh mạch xoắn; 5,6 Mảnh mạch điểm; 7 Tinh thể calci oxalat hình kim
Bột thân có màu xanh lá hơi vàng và vị đắng, với hình ảnh dưới kính hiển vi cho thấy sự hiện diện của mảnh biểu bì mang lông che chở, lỗ khí, mảnh bần màu nâu, mảnh mạch xoắn và mạch điểm Ngoài ra, còn có tinh thể calci oxalat hình kim, sợi, chứa hạt tinh bột và lông che chở.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Hình 1.9: Hình vẽ mô tả bột thân [10]
Hình 1.10: Đặc điểm vi phẫu bột thân [4]
Chú thích: 1 Mảnh mô mềm; 2 Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột;
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
3 Mô dày; 4 Mạch xoắn; 5,6 Mạch điểm; 7 Tinh thể calci oxalat hình kim;
8 Sợi; 9 Hạt tinh bột; 10 Lông che chở
1.2.5 Thành phần hóa học của cây Khôi đốm
Năm 2013, Ahmed E Abd Ellah và các cộng sự đã thành công trong việc phân lập 5 hợp chất từ dịch chiết methanol của phần trên mặt đất của cây Khôi đốm, bao gồm 1 hợp chất matsutake alcohol và 4 hợp chất alcohol glycosid.
- 3-O-β-arabinopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-(1-6)-β- glucopyranosyl-1-octen-3-ol (5)
Ahmed E và các cộng sự cũng đã phân lập được 6 hợp chất từ dịch chiết methanol của lá và rễ cây Khôi đốm:
- 9-O-β-xylopyranosyl-(1→6)-O-β-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- glucopyranosyltrans-cinnamyl alcohol (7)
- Hai hợp chất benzyl alcohol glycosid: 7-O-β -glucopyranosyl benzyl alcohol (10) và7-O-β-apiofuranosyl-(1→6)-O-β -glucopyranosyl benzyl alcohol (11)
Nhóm nghiên cứu phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ dịch chiết methanol lấy từ hoa của cây Khôi đốm:
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Hình 1.11: Các hợp chất phân lập được từ cây Khôi đốm
Năm 2015, theo nghiên cứu định tính của Seline Omondi và J C
Omondi, lá cây Khôi đốm có chứa các nhóm chất antharaquinon và saponin, không chứa các hợp chất thuộc nhóm terpenoid, steroid và flavonoid [18]
Năm đó, nhóm nghiên cứu của Md Abu Shuaib Rafshanjani đã phát hiện rằng lá cây Khôi đốm chứa nhiều hợp chất quý giá như alcaloid, glycosid, flavonoid, carbohydrat, steroid, phenolic, saponin và tannin Tất cả các chất này được tìm thấy trong phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ lá cây, trong khi flavonoid và các hợp chất phenolic không có mặt trong phân đoạn n-hexan.
Năm 2016, Tiến sĩ Vũ Đức Lợi và nhóm nghiên cứu đã tách chiết được
4 hợp chất từ lá cây Khôi đốm [17]
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Hình 1.12: Các hợp chất phân lập được từ lá cây Khôi đốm
Ngoài ra, trong đề tài nghiên của thạc sĩ Bùi Thị Xuân năm 2018 nhóm nghiên cứu đã phân lập được 3 hợp chất: 9-methoxycanthin-6-on, 9- hydroxyheterogorgiolid , O-methyl furodysinin lacton [5]
1.2.6 Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu của cây Khôi đốm
❖ Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, diệt côn trùng
Năm 2014, Abu Shuaib đã thực hiện nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và diệt côn trùng của cây Khôi đốm bằng phương pháp khuếch tán đĩa, với phép thử hoạt tính trên bề mặt, áp dụng cho 15 loài vi khuẩn khác nhau.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Gram dương và Gram âm, 6 loài nấm và côn trùng Tribolium castaneum
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Đối tượ ng nghiên c ứ u
Lá cây Khôi đốm được lựa chọn và thu hái tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện
Vào ngày 15/01/2018, tại Trực Ninh, tỉnh Nam Định, sau khi thu hái và xử lý mẫu, các mẫu được phơi sấy và bảo quản trong túi nilon kín Mẫu sau đó được gửi đi giám định tên khoa học tại Viện Dược Liệu, do ThS Nguyễn Quỳnh Nga thực hiện.
Cây Sanchezia nobilis Hook.f., thuộc họ Acanthaceae, còn được biết đến với tên gọi Việt Nam là cây Khôi đốm hoặc Xăng xê Mẫu lá của cây này hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Khoa Tài Nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu với số hiệu tiêu bản DL-150118.
2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị
- Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: EtOH 80%, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), aceton (Ac),…đạt tiêu chuẩn tinh khiết
- Các hóa chất dùng để định tính: FeCl3, NaOH, H2SO4, HCl, phenolphtalein, fehling,…
- Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silicagel pha thường cỡ hạt 0,063-
0,200 mm (Merck), (0,040 - 0,063 mm, Merck) Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silicagel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)
- Sắc ký cột: sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063- 0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040- 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau
- Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
- Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội
- Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ)
- Dụng cụ thí nghiệm: Pipet, ống nghiệm, bình nón, bình chiết, cốc có mỏ, bình gạn,…
- Các thiết bị khác: tủ sấy, tủhút, cân phân tích,…
Phương pháp nghiên cứ u
Mẫu lá cây Khôi đốm (2,5 kg) sau khi rửa sạch, phơi khô và thái nhỏ được ngâm chiết bằng dung môi ethanol 80% trong 3 lần, mỗi lần 8L Quá trình chiết sử dụng thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 40°C trong 3 giờ Sau đó, dịch chiết ethanol được lọc qua giấy lọc, gộp lại và cất dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao chiết tổng ethanol.
Phân tán cao chiết ethanol trong nước cất và thực hiện chiết phân bố bằng n-hexan ba lần Sau đó, tiến hành cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được sản phẩm, ký hiệu là H.
Tiến hành xử lý và phân lập hợp chất từ phân đoạn n-hexan chủ yếu bằng phương pháp sắc ký cột, trong khi các phân đoạn được theo dõi qua sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký cột (CC) sử dụng chất hấp phụ silicagel với các pha thường và pha đảo, kết hợp với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần Silicagel pha thường có kích thước hạt từ 0,063 đến 0,200mm (Merck) và 0,040 đến 0,063mm (Merck), phù hợp với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau.
Sắc ký lớp mỏng (TLC): thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G F (Merck), độ dày 0,2 mm và RP-18F , độ dày 0,25 mm
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 365nm Tiếp theo, bản mỏng được phun thuốc thử là dung dịch.
H2SO410% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ
2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập qua 2 bước chính:
Để thiết lập bộ dữ liệu cho chất phân lập, bước đầu tiên là thực hiện đo nhiệt độ nóng chảy cùng với các phương pháp phân tích như phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT).
- Bước 2: So sánh các dữ liệu các chất thiết lập đó với các dữ liệu các chất đã công bố
Phương pháp phổ khối lượng (MS) là kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học trong mẫu bằng cách đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích của các ion pha khí Kỹ thuật này phân tích khối lượng của các phân tử tích điện khi di chuyển trong điện trường, với mẫu được ion hóa thành các phân tử tích điện khác nhau Các phân tử này được phân tách dựa vào giá trị m/z, trong đó m là khối lượng và z là điện tích Dữ liệu phổ khối lượng được ghi lại tự động và sử dụng để nhận dạng protein thông qua các công cụ tin sinh học.
Dưới điều kiện ion hóa giống nhau, sự phân mảnh của ion mẹ thành các ion con tuân theo những quy luật nhất định Các chất có cấu trúc tương tự sẽ tạo ra các phân mảnh tương đồng, từ đó cho phép xác định cấu trúc của chất chưa biết thông qua các phương pháp phổ khác Việc so sánh phổ khối của chất chưa biết với phổ khối của chất đã biết giúp định danh chất chưa biết một cách chính xác.
❖ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một phương pháp hiện đại dùng để nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là các phân tử phức tạp như hợp chất thiên nhiên NMR hoạt động dựa trên sự tương tác giữa bức xạ điện tử tần số radio và các hạt nhân trong từ trường mạnh Khi một chất có hạt nhân được đặt trong từ trường, chúng sẽ sắp xếp theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường cho đến khi đạt được trạng thái cân bằng Khi chiếu bức xạ điện tử phù hợp, các spin hạt nhân hấp thụ năng lượng và chuyển lên mức năng lượng cao, sau đó giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng khi ngừng chiếu xạ Để thu được phổ NMR, cần xác định năng lượng mà các hạt nhân trong phân tử hấp thu hoặc giải phóng, và kỹ thuật phổ biến hiện nay là FT-NMR, sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân.
Tùy thuộc vào mục đích và độ phức tạp của cấu trúc, có thể thực hiện đo nhiều loại phổ khác nhau Điều này bao gồm việc xác định phổ của cùng một loại hạt nhân như 1H hoặc 13C thông qua các phương pháp phổ một chiều như 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT, hoặc phân tích các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều.
Phổ proton (1H-NMR) cung cấp thông tin về môi trường hóa học của proton trong phân tử Trong phổ proton, các proton hoặc nhóm proton có cùng môi trường hóa học sẽ được biểu diễn bằng một đỉnh, cho thấy sự tương đồng trong tính chất hóa học của chúng.
Tại Trường Y Dược, ĐHQGHN, các đỉnh có thể là đơn, đôi hoặc ba thành phần Diện tích của mỗi đỉnh tỷ lệ thuận với số lượng proton, từ đó cho phép xác định số lượng proton của từng đỉnh.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) tương tự như phổ proton, cung cấp thông tin quan trọng về môi trường hóa học của nguyên tử carbon Thông qua khoảng chuyển dịch, chúng ta có thể xác định cấu trúc của carbon trong khoảng từ 0 đến một giá trị nhất định.
Trong phổ NMR, các carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố thường xuất hiện ở khoảng 60 ppm, trong khi carbon liên kết đơn với oxy (như alcohol và ether) có chuyển dịch trong khoảng 45 - 85 ppm Carbon lai hóa sp2 thì nằm trong khoảng 100 - 150 ppm, và nếu có liên kết đôi với oxy, chúng có thể dịch chuyển đến 240 ppm Mỗi vạch trong phổ NMR đại diện cho một carbon trong phân tử, hoặc nhiều hơn nếu có sự tương đồng trong môi trường hóa học.
Kỹ thuật DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer) cho phép xác định số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, từ đó suy ra số lượng carbon và hydro trong phân tử Các kỹ thuật phổ hai chiều cung cấp thông tin về tương tác giữa carbon và hydro, như phổ COSY để phân tích các proton của carbon lân cận, phổ HETCOR để tìm hiểu sự tương tác giữa proton và carbon gần nhau, và các phương pháp như HSQC và HMBC để nghiên cứu các tương tác giữa carbon xa hơn Ngoài ra, các kỹ thuật NOESY và ROESY giúp xác định mối quan hệ giữa các proton gần nhau trong không gian.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
KẾ T QU Ả VÀ BÀN LU Ậ N
K ế t qu ả chi ế t xu ấ t và phân l ậ p h ợ p ch ấ t
Ngâm chiết lá cây Khôi đốm 2,5 kg đã qua xử lý và rửa sạch bằng dung môi ethanol 80% (3 lần, mỗi lần 8L) ở nhiệt độ phòng, với mức dung môi ngập dược liệu khoảng 2 - 3 cm Sau khi đậy nắp bình, ngâm trong 3 ngày Tiến hành rút thu dịch chiết lần một, sau đó bổ sung dung môi ngập dược liệu 2 - 3 cm để thu dịch chiết lần hai, và tiếp tục quy trình để thu dịch chiết lần ba.
Lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được khoảng 150g cao chiết toàn phần
Phân tán 100g cao chiết toàn phần trong nước cất nóng với tỷ lệ 1:1, thu được dịch chiết nước Dịch chiết này được lắc với 500ml dung môi n-hexan trong 3 lần, thu được phân đoạn dịch chiết n-hexan Sau đó, cất loại dung môi dưới áp suất giảm và cô quay cách thủy ở nhiệt độ 60°C, thu được cắn của phân đoạn n-hexan với khối lượng 9,2g, ký hiệu là H.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất lá cây Khôi đốm phân đoạn n-hexan
❖ Giai đoạn phân lập 1: Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel với sắc ký cột cỡ hạt 0,063 - 0,200mm (Merck)
- Cột sắc ký có đường kính 5 cm, được lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạch bằng cồn
- Chất nhồi cột: Silicagel được hoạt hóa ở 100 o C/2h trong tủ sấy rồi lấy ra để nguội trong bình hút ẩm
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Để thực hiện quy trình, hãy lót một lớp bông ở đáy cột và đổ vào cột 40ml dichlomethan Sau đó, mở khóa để dung môi chảy từ từ, giúp đẩy hết bọt khí trong lớp bông ra ngoài Khi dung môi còn khoảng 3cm trong cột, hãy khóa lại.
Nhồi cột là quá trình trộn silicagel với dung môi dichlomethan để tạo thành hỗn dịch, sau đó đổ lên cột và gõ nhẹ quanh thành cột nhằm nén hạt, loại bỏ bọt khí và phân bố đều Cuối cùng, rửa thành cột bằng dichlomethan, với chiều dài cột silicagel là 15cm.
Để đảm bảo cột được ổn định, cần kiểm tra vị trí thẳng đứng của cột Sử dụng quả bóp cao su để nén cột bằng cách gõ nhẹ, đều và đối xứng xung quanh thân cột cho đến khi không còn bọt khí bên trong Quy trình này giúp cột duy trì sự ổn định cần thiết.
Tiến hành sắc ký cột hấp phụ:
- Mở khóa cột cho dung môi dichlomethan chảy đến sát bề mặt silicagel, khóa cột lại
Để phân lập 8g n-hexan, chất này được đưa lên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel, sử dụng hệ dung môi n-hexan và dichloromethan theo tỷ lệ 15:1 (v/v) Tốc độ rửa giải được điều chỉnh ở mức 1ml/phút.
Hứng dịch rửa giải vào các ống và kiểm tra bằng SKLM Các ống từ 2 đến 16 được gộp lại để thu được phân đoạn H1, trong khi các ống từ 17 đến 20 được gộp để tạo ra phân đoạn H2, và quy trình tương tự được thực hiện để thu được phân đoạn H3.
❖ Giai đoạn phân lập 2: Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel với sắc ký cột cỡ hạt 0,063 - 0,200mm (Merck)
Tiến hành chuẩn bị cột tương tự như giai đoạn 1 với cột sắc ký có đường kính 3cm
- Tiến hành sắc ký cột cắn phân đoạn H1 với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi n-hexan : dichloromethan (10:1; v/v), kiểm tra các ống hứng
Tại Trường Y Dược, ĐHQGHN, quy trình dịch rửa bằng SKLM đã được thực hiện, trong đó các ống có cùng thành phần được gộp lại và dung môi được bốc hơi để thu được 4 phân đoạn nhỏ, bao gồm H1.1, H1.2, H1.3 và H1.4.
Phân đoạn H1.1 được tách trên cột sắc ký silicagel với dung môi n-hexan : ethylacetat (10:1; v/v), thu được hợp chất NS1 (12 mg) Trong khi đó, phân đoạn H1.2 cũng được tách trên cột sắc ký silicagel, sử dụng dung môi n-hexan : dichlometan (5:1; v/v), cho hợp chất NS2 (18 mg).
Hợp chất NS1: Sitosterol-3-O- β -D-glucopyranosid (daucosterol)
Tinh thể có màu trắng đục với nhiệt độ nóng chảy tnc = 285 °C và chỉ số Rf = 0,45 khi sử dụng dung môi dichloroform:methanol theo tỷ lệ 8:1 Hợp chất NS1 phản ứng với thuốc thử H2SO4 10%/EtOH tạo ra màu hồng tươi, sau đó chuyển dần sang xanh tím Phổ IR (KBr, cm -1) cho các đỉnh hấp thụ tại 3430 (OH), 2938 (C-H), 1635 (C=CH), 1077 (C-O-C) và 1021 (C-O-C) Phân tích ESI-MS cho m/z 599,1 [M+Na]+.
Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT của chất NS1 và chất tham khảo được trình bày ở bảng 3.1
B ả ng 3.1: D ữ li ệ u ph ổ DEPT, 1 H- và 13 C-NMR c ủ a NS1 và chất tham khảo [11, 25]
Vị trí C DEPT δ C NS1 ppm δ C Oa,b ppm δ H NS1 (ppm) (Mult, J=Hz) δ H Oa,c (ppm) (Mult, J=Hz)
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
6' CH2 61,1 63,3 3,75 (d; 12,0) a ) đo trong CDCl 3 , b ) 100 MHz, c ) 300 MHz, G) của chất tham khảo daucosterol
Hình 3.2: Cấu trúc của hợp chất NS1
Hợp chất NS1 phản ứng với thuốc thử H2SO4 10 %/EtOH tạo màu hồng tươi và sau đó chuyển sang xanh tím, cho thấy NS1 thuộc nhóm sterol Phổ IR cho thấy đỉnh hấp thụ tại v * max 3430 cm -1 đặc trưng cho nhóm O-H, 2938 cm -1 cho liên kết C-H, 1635 cm -1 cho liên kết >C=C