Khóa luận nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nước của lá cây khôi đốm (sanchezia nobilis hook f )

TỔ NG QUAN

V ị trí phân lo ại và đặc điể m th ự c v ậ t c ủ a chi Sanchezia

Theo “Hệ thống phân loại về ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)” của tác giả A.Takhtajan (1997), chi Sanchezia có vị trí phân loại như sau [48]:

Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnolipphyta

Lớp Cỏ tháp bút: Equisetopsida C Agardh Phân lớp Mộc lan: Magnoliidae Novák ex Takht

Họ Ô rô: Acanthaceae Chi: Sanchezia

1.1.2 Đặc điể m th ự c v ậ t và phân b ố c ủ a chi Sanchezia

Cây bụi hoặc cây cỏ có rễ không lông, với thân cây trơn nhẵn và màu xanh lá cây Lá cây dài, có thể đạt đến 26cm, màu xanh đậm với các vân trắng kem hoặc vàng, có hình dạng mác Hoa thường mọc đơn lẻ hoặc thành chùm, có kích thước lớn và màu sắc đa dạng như cam, vàng, đỏ hoặc tím, thường xuất hiện ở ngọn cây Lá bắc có màu sắc nổi bật, đài hoa 5 thùy và tràng hoa 5 dính liền tạo thành hình ống Cấu trúc hoa gồm 4 nhị, trong đó có 2 nhị lép và 2 nhị thò ra, với bao phấn có 2 ô Quả của cây là dạng nang, chứa từ 6 đến 8 hạt hình cầu.

Sanchezia, được đặt theo tên giáo sư thực vật học Jose Sanchez từ thế kỷ XIX, thuộc họ Acanthaceae và bao gồm gần 60 loài ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Chi này phân bố rộng rãi ở châu Phi, châu Úc, Mỹ, một số quốc gia Đông Nam Á, cùng nhiều hòn đảo ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương như Quần đảo Cook, Hawaii, Fiji và New Caledonia, với sự đa dạng nhất tại Peru và Ecuador Nhiều loài thuộc chi Sanchezia được trồng làm cây cảnh và hàng rào do sự đa dạng về hình thái, tuy nhiên, chỉ có S speciosa và S nobilis được nghiên cứu rộng rãi trên toàn cầu.

Cây Xăng sê, hay còn gọi là Ngũ sắc hoặc Khối đốm, có tên khoa học là Sanchezia speciosa (Sanchezia nobilis), chủ yếu phân bố ở miền núi Tây Giang - Quảng Nam, Hòa Vang - tỉnh Đà Nẵng, cũng như các khu vực miền núi Chiêm Hóa, Na Hang - Tuyên Quang và một số tỉnh khác như Nam Định, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thái Nguyên.

T ổ ng quan v ề loài Khôi đố m

1.2.1 Đặc điể m v ề loài Khôi đố m

Tên khoa học: Sanchezia speciosa Leonard hay Sanchezia nobilis

Tên Việt Nam: Xăng sê, Khôi đốm, Lá ngũ sắc [1]

Cây bụi cao từ 0,5 đến 1,5 m, với thân và gân chính của lá có màu lục, đỏ hoặc vàng, trong khi gân bên có màu trắng Lá đơn mọc đối hình chữ thập, với cuống lá ngắn và hình trụ, phiến lá hình mũi mác, dài từ 10-25 cm và rộng từ 3-7 cm, nhẵn và mép lá hơi lượn sóng Mặt trên của lá có màu xanh đậm, trong khi mặt dưới xanh nhạt, với hệ gân lông chim có 9-12 đôi gân bên Hoa mọc thành cụm hoa bông gồm 3 bông nhỏ trở lên ở ngọn, với cuống ngắn và lá bắc màu lục hay đỏ, hình trứng và đỉnh tù Hoa lưỡng tính có màu xanh lục mờ và mùi nhạt đặc trưng, với đài nhiều hình vảy, dài từ 1,5-1,8 cm và rộng từ 3-5 mm, tròn ở đỉnh.

Tràng hoa hình ống tròn, màu vàng và có sáp, cao từ 4-5 cm và rộng 7-8 cm ở phần trên, sau đó thu hẹp dần xuống còn 3 mm Bề mặt tràng hoa nhẵn, với các thùy dài 3-4 mm, tròn và có khía Chỉ nhị dài, gồm 4 nhị, trong đó có 2 nhị phát triển dài từ 4-4,5 cm, có lông, và 2 nhị tiêu giảm Quả nang chứa 8 hạt.

Hình 1.1 Hình ảnh hoa và lá của cây Khôi đốm

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

1.2.2 Đặc điể m vi ph ẫ u 1.2.2.1 Thân

Thân non vi phẫu có hình tròn, với cấu trúc từ ngoài vào trong bao gồm lớp biểu bì một hàng tế bào có lông che chở, tiếp theo là mô dày với 6-8 hàng tế bào xếp thành hình tròn khép kín Bên trong, mô mềm chứa 5-7 lớp tế bào, tinh thể calcioxalat hình kim và các hạt tinh bột đơn Libe gần như hình tròn khép kín, với libe ở ngoài và gỗ ở trong, thỉnh thoảng bị gián đoạn bởi một số tế bào mô mềm Mô mềm ruột được cấu tạo từ nhiều lớp tế bào có thành mỏng, hình đa giác xếp lộn với nhau.

Thân già vi phẫu hình vuông Cấu tạo tương tự thân non, ngoại trừ có thêm lớp bần bên ngoài cùng [9]

Hình 1.2 Đặc điểm vi phẫu thân [6]

1: Biểu bì; 2: Mô dày; 3: Mô mềm; 4: Sợi; 5: Libe;

6: Gỗ; 7: Tinh thể calci oxalat hình kim; 8: Mô mềm ruột

Vi phẫu gân lá cho thấy sự hiện diện của các lớp biểu bì trên và dưới, được cấu tạo từ một hàng tế bào đa giác sắp xếp đều đặn Mô dày phía trên và dưới gồm nhiều lớp tế bào với thành dày lên ở các góc Mô mềm bao gồm các tế bào thành mỏng, gần tròn, bên trong chứa các tinh thể canxi.

Copyright @ Trường Y Dược, ĐH Quốc gia Oxalat và các hạt tinh bột phân bố không đồng đều, có các bó mạch phụ rải rác Libe gỗ được sắp xếp theo hình vòng cung, với libe ở bên ngoài và gỗ ở bên trong Một số tế bào biểu bì có chức năng bảo vệ, bao gồm lông che chở và lông tiết.

Vi phẫu phiến lá bao gồm biểu bì trên và biểu bì dưới, được cấu tạo bởi một hàng tế bào đa giác sắp xếp đều đặn Mô giậu nằm ngay dưới biểu bì trên, đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc của lá.

2 hàng tế bào hình chữ nhật sắp xếp đều đặn nhau Mô khuyết cấu tạo bởi các tế bào hình gần tròn xếp lộn xộn

Vi phẫu cuống lá hình chén, có các đặc điểm tương tự gân lá, tuy nhiên có thêm lớp mô dày sát lớp biểu bì [10]

Hình 1.3 Đặc điểm vi phẫu lá [6]

1: Biểu bì trên; 2: Mô dày trên; 3: Gỗ; 4: Libe; 5: Mô mềm;

6: Mô dày dưới; 7: Biểu bì dưới; 8: Mô giậu; 9: Mô khuyết

Bột có màu xanh lá hơi vàng và vị đắng, khi soi dưới kính hiển vi, có thể quan sát thấy các đặc điểm như mảnh bần màu nâu, mảnh biểu bì có lông che chở, mảnh mạch xoắn, mạch điểm, tinh thể calci oxalat hình kim, sợi, tinh bột và lông che chở.

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Hình 1.4 Đặc điểm bột thân [9]

Bột lá có màu xanh nhạt và vị hơi đắng Khi quan sát dưới kính hiển vi, bột lá cho thấy nhiều đặc điểm như mảnh biểu bì, mảnh biểu bì mang lông tiết, lỗ khí, lông che chở, mảnh mô mềm, mô khuyết, mô giậu, mô dày, mạch xoắn, mạch điểm, sợi, và tinh thể calci oxalat hình kim.

Hạt tinh bột Mạch xoắn

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Hình 1.5 Đặc điểm vi phẫu bột lá [9]

Cây Khôi đốm, có nguồn gốc từ rừng mưa nhiệt đới miền Trung và Nam Mỹ (Ecuador), đã tồn tại từ lâu và được tìm thấy trên nhiều hòn đảo ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương như Quần đảo Cook, Hawaii, Fiji và New Caledonia Loài cây này thường được trồng làm cây cảnh và hàng rào, phát triển mạnh mẽ trong điều kiện khí hậu mát mẻ và trong lành.

Mô khuy ế t Lớp biểu bì dưới

Lông Lớp biểu bì trên

Cây Khôi đốm, một loại cây quý, được tìm thấy ở các huyện miền núi cao như Tây Giang, tỉnh Quảng Nam, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng, và một số huyện miền núi Chiêm Hóa, tỉnh Tuyên Quang Ngoài ra, cây cũng được trồng tại Hà Nội và Thừa Thiên Huế.

Theo các tài liệu thu thập, loài Khôi đốm chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng như flavonoid, glycosid, carbohydrat, alcaloid, steroid, phenolic, saponin và tannin Các hợp chất này đã được phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây, trong đó có một số hợp chất tự nhiên lần đầu được phân lập.

Năm 2013, Ahmed E Abd Ellah và cộng sự đã thu hái phần trên mặt đất của cây Khôi đốm tại vườn bách thảo Aswan, Ai Cập, và phân lập thành công 5 hợp chất matsutake.

-3-O-β-arabinopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-(1-6)-β- glucopyranosyl-1-octen-3-ol (5)

Trong đó, bốn hợp chất 1-4 lần đầu phân lập từ họ Acathanceae và hợp chất 5 lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên [15]

Năm 2014, Ahmed E Abd Ellah và các cộng sự đã phân lập thành công 9 hợp chất từ cây Khôi đốm, trong đó có 6 hợp chất khác nhau được chiết xuất từ dịch methanol của lá và rễ cây, cùng với 3 hợp chất flavonoid từ dịch chiết methanol của hoa.

-Ba hợp chất cinnamyl alcohol glycosid: 9-O-β -glucopyranosyl trans- cinnamyl alcohol (6), 9-O-β-xylopyranosyl-(1→6)-O-β-glucopyranosyl-

-Một hợp chất neolignan glucosid: 4-O-β-glucopyranosyl dehydrodiconiferyl alcohol (9)

-Hai hợp chất benzyl alcohol glycosid: 7-O-β-glucopyranosyl benzyl alcohol (10) và 7-O-β-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-glucopyranosyl benzyl alcohol (11)

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

-Ba hợp chất flavonoid: apigenin-7-O-β–glucopyranoside (12), apigenin-7-Ogentiobioside (13), apigenin-7-O- β–glucuronopyranoside (14)

Hợp chất 7 là hợp chất đầu tiên được phân lập từ tự nhiên, trong khi bốn hợp chất 6, 8, 9 và 13 là lần đầu tiên được phân lập từ họ Acathanceae Các hợp chất 10-12 và 14 cũng lần đầu tiên được phân lập từ chi Sanchezia.

According to Dr Vu Duc Loi and his team, four compounds have been identified in the leaves of the Khôi đốm plant: Quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid (quercitrin), Quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid (hyperosid), Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (daucosterol), and 3-Methyl-1H-benz[f]indolo-4,9-dion.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Đối tượ ng nghiên c ứ u

Lá cây Khôi đốm, được thu hái vào tháng 1/2018 tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định, đã được phơi sấy và bảo quản trong túi nilon kín Mẫu cây này được ThS Nguyễn Quỳnh Nga, thuộc Viện Dược liệu, xác định có tên khoa học là Sanchezia nobilis Hook.f., thuộc họ Acanthaceae (họ Ô rô) Hiện mẫu cây đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Khoa Tài Nguyên Dược Liệu, Viện Dược liệu với số hiệu tiêu bản là DL-150118.

Hình 2.1 Hình ảnh cây và hoa Khôi đốm

2.1.2 Trang thi ế t b ị , d ụ ng c ụ 2.1.2.1 Hóa ch ấ t và dung môi

-Dung môi hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập: Ethanol (EtOH), n- hexan, ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), chloroform, nước cất…đạt tiêu chuẩn tinh khiết

- Hạt nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich)

- Chất hấp phụsilica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 μm, Merck), pha đảo RP-18 (30-50 μm, Merck)

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

- Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn và RP-18 F254s tráng sẵn (Merck), hiện màu bằng thuốc thử acid sulfuric 10% và đốt nóng ở 110 o C

-Sắc ký cột: sắc ký các loại cột thủy tinh có kích cỡ khác nhau, tại Khoa

-Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

-Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap

-Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Khoa Y Dược, ĐHQGHN

-Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược, ĐHQGHN

-Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: ống nghiệm, bình nón, bình ga ̣n, cốc có mỏ, pipet…

-Các thiết bị khác: Tủ sấy, tủ hút, cân phân tích, đèn tử ngoại phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm.…

Phương pháp nghiên cứ u

2.2.1 Phương pháp chiế t xu ấ t và phân l ậ p h ợ p ch ấ t

Chiết xuất bằng ethanol và tách các thành phần bằng phương pháp chiết lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần, giúp thu được phân đoạn dịch chiết nước hiệu quả.

Phân lập các hợp chất có thể thực hiện bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 μm; 0,040-0,063 mm, Merck), pha đảo RP-18 (30-50 μm, Merck) và hạt nhựa trao đổi ion Diaion HP-20.

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng silicagel 60 F254 (Merck) có độ dày 0,2 mm và RP-18F254s với độ dày 0,25 mm (Merck) Sau khi triển khai, bản mỏng được kiểm tra dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, tiếp theo là phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ.

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

-Xác định độ tinh khiết của hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.2 Phương pháp xác đị nh c ấ u trúc h ợ p ch ấ t

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR,

13C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

KẾ T QU Ả VÀ BÀN LU Ậ N

K ế t qu ả chi ế t xu ấ t và phân l ậ p h ợ p ch ấ t

3.1.1 Chi ế t xu ấ t cao toàn ph ần và phân đoạ n

Lá Khôi đốm được rửa sạch, phơi khô và xay nhỏ Sau đó, 2,5 kg lá Khôi đốm đã được làm nhỏ được ngâm chiết trong 8L dung môi EtOH 80% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày để thu được dịch chiết lần một Tiếp theo, bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2-3cm (8L/lần) và thực hiện chiết thêm hai lần nữa, thu được dịch chiết lần hai và lần ba.

Gộp ba lần dịch chiết ethanol, sau đó lọc qua giấy lọc và cất dưới áp suất giảm, thu hồi được khoảng 150 g cao chiết tổng ethanol.

Hòa tan 100g cao đặc trong nước nóng theo tỷ lệ 1:1 để thu được dịch chiết nước Dịch chiết này được lắc với n-hexan và ethyl acetat, mỗi dung môi chiết 3 lần, mỗi lần 500ml trong 30 phút, từ đó thu được các phân đoạn dịch chiết Sau đó, các phân đoạn này được cất để thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở 60°C, thu được các cắn tương ứng: n-hexan (9,2g), ethyl acetat (28,8g) và dịch nước còn lại (26,6g).

B ả ng 3.1 Kh ối lượ ng các c ắn phân đoạ n d ị ch chi ế t ethanol t ừ lá Khôi đố m

STT Phân đoạn Khối lượng cắn (g) % so với nguyên liệu khô

Sơ đồ chiết xuất lá cây Khôi đốm được trình bày theo hình 3.1:

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Hình 3.1 Sơ đồ chi ế t xu ấ t c ác phân đoạ n t ừ lá cây Khôi đố m

Lớp nước chứa 25,0 g N được tách trên cột sắc ký trao đổi ion với chất hấp phụ Diaion HP-20, sử dụng hệ dung môi với nồng độ methanol tăng dần trong nước (50%, 75%, 100%) Quá trình này thu được ba phân đoạn N1 (6,8 g), N2 (8,1 g) và N3 (7,3 g).

Cắn n-hexan (9,2g) n-hexan thu hồi

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Phân đoạn N2 (8,1 g) được hòa tan trong methanol và tẩm với 25,0 g silicagel, sau đó cô quay dưới áp suất thấp để thu được bột mẫu Bột này được phân tách bằng sắc ký cột silicagel pha thường, sử dụng dung môi chloroform: methanol (30:1→ 1:1; v/v), cho ra 4 phân đoạn N2.1 (1,1 g), N2.2 (1,8 g), N2.3 (1,6 g), và N2.4 (2,1 g) Sắc ký phân đoạn N2.1 với silicagel và dung môi ethanol: methanol (2:1, v/v) thu được hợp chất NX1 (16 mg), trong khi phân đoạn N2.2 được sắc ký với dung môi chloroform: methanol (1:2, v/v) cho hợp chất NX2 (15 mg).

Phân đoạn N2.3 tiến hành sắc ký trên cột pha đảo kích thước 80 cm x 3 cm, hệ dung môi rửa giải methanol : nước (1:3, v/v), thu được hợp chất NX3 (16 mg)

Sơ đồ phân lập cắn nước được trình bày theo hình 3.2

Hình 3.2 Sơ đồ phân l ậ p các h ợ p ch ấ t t ừ phân đoạ n d ị ch chi ết nướ c

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

K ế t qu ả xác đị nh c ấ u trúc h ợ p ch ấ t

The compound is a yellow solid with a melting point of 291-293 °C It has an Rf value of 0.51 when analyzed using thin-layer chromatography (TLC) on silica gel with a solvent system of ethyl acetate, methanol, and water in a 2:4:0.1 ratio (v/v/v) The substance turns black when treated with a 5% solution of iron(III) chloride in ethanol Mass spectrometry (ESI-MS) reveals the following m/z values: 329.1 [M-H]-, 353.1 [M+Na]+, and 331.0 [M+H]+ Its molecular formula is C17H14O7.

Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT của chất NX1 và chất tham khảo [23] được trình bày ở bảng 3.1

B ả ng 3.2 D ữ li ệ u ph ổ NMR c ủ a NX1 và chất tham khảo [23]

Vị trí C DEPT δ C NX1 ppm δ C Va,b ppm δ H NX1 (ppm) (Mult, J =Hz) δ H Va,c (ppm) (Mult, J =Hz)

5'-OCH3 3,88 (s) 3,98 (s) a Đo trong CDCl3 , b 125 MHz , c 500 MHz của chất tham khảo [23]

Hợp chất NX1 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng Phổ ESI-MS xuất hiện các pic ion m/z 329,1 [M-H] - , 353,1 [M+Na] + , 331,0 [M+H] + ứng với công thức phân tử C17H14O7.

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Phổ 1 H-NMR của NX1 cho các tín hiệu đặc trưng của một flavonoid với cặp hai tín hiệu tại H 6,22 và 6,56 đều dưới dạng doublet (J=2,0 Hz) điển hình của hai proton H-6 và H-8 của vòng A, tín hiệu singlet H 6,96 (1H, H-3) được xác định là proton thuộc vòng C Tín hiệu singlet tương ứng với 2H tại

Dựa trên tín hiệu H NMR tại δH 7,31, có thể xác định được các vị trí C-3', C-4', C-5' và hai proton H-2' cùng H-6' Tín hiệu singlet tại δH 3,88 (6H, s, 2 x OCH3) cho thấy hai nhóm methoxy gắn liền với C-3' và C-5', từ đó khẳng định cấu trúc của các vị trí C-3' và C-5' trong phân tử.

Hợp chất NX1 có 17 nguyên tử cacbon, bao gồm 15 cacbon thuộc khung flavon và 2 cacbon từ nhóm methoxy Phổ 13C-NMR cho thấy các nhóm hydroxyl được xác định tại vị trí 5, C-7 và C-4 Tín hiệu cacbon cacbonyl xuất hiện tại δC.

Giá trị 181,8 cho thấy sự hiện diện của nối đôi C-2/C-3 trong cấu trúc của NX1 Tại các vị trí C-3', C-4' và C-5', giá trị C của C-4' thấp hơn C-3' và C-5', điều này phù hợp với sự methyl hóa nhóm hydroxyl trong phổ NMR Tất cả dữ liệu phổ NMR của NX1 hoàn toàn tương thích với các thông tin đã công bố trong tài liệu tham khảo [24], cho phép khẳng định cấu trúc của NX1 là 4',5,7-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon.

Hình 3.3: C ấ u trúc h ợ p ch ấ t NX1 3.2.2 H ợ p ch ấ t NX2: Kaempferol-3-O-  -L-arabinofuranosid

Tính chất: Chất rắn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy: tnc= 224-226 o C

Rf = 0,50 (TLC, silica gel, ethylacetat : acid formic : nước, 15:4:1, v:v:v), hiện màu đen với dung dịch Sắt(III) chlorid : ethanol 5%

Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT của chất NX2 và chất tham khảo [18] được trình bày ở bảng 3.2

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

B ả ng 3.3: D ữ li ệ u ph ổ NMR c ủ a NX2 và chất tham khảo [18]

C DEPT δ C NX2 ppm δ C Xa,b ppm δ H NX2 (ppm) (Mult, J =Hz) δ H Xa,c (ppm) (Mult, J =Hz)

CH 109,6 109,6 5,48 (br, s) 5,46 (s) 2'' CH 83,2 83,3 4,31 (br, d) 4,30 (d; 3,0) 3'' CH 78,5 78,6 3,91 (dd; 3,0; 5,0) 3,89 (dd; 3,0; 5,1) 4'' CH 87,8 87,9 3,81 (dd; 4,5; 9,0) 3,79 (dd; 4,2; 8,9) 5'' CH2 62,4 62,5 3,50 (dd; 2,0; 12,5) 3,47 (d; 4,0) a Đo trong CDCl3 , b 125 MHz, c 500 MHz của chất tham khảo [18]

Hợp chất NX2 được xác định là một chất rắn màu vàng, đặc trưng cho các hợp chất flavonoid Phổ 1 H-NMR của NX2 cho thấy hai vùng tín hiệu rõ ràng: một vùng tín hiệu của các proton vòng thơm ở trường thấp và một vùng tín hiệu của phân tử đường ở trường cao hơn Sự hiện diện của vòng thơm thế para (vòng B) được nhận diện qua hai tín hiệu doublet tại H 7,94 (2H, d, J=9,0 Hz; H-2' & H-6') và 6,91 (2H, d, J=9,0 Hz; H-3' & H-5') Hai tín hiệu broad singlet tại H 6,21 và 6,38 tương ứng với hai proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A trong các hợp chất flavonol Đặc biệt, không có sự xuất hiện của các proton olefin khác, cho thấy hợp chất flavonol này có các nhóm thế tại C-3', C-5 và C-7.

Bản quyền @ Trường Y Dược, VNU Nghiên cứu này xác nhận cấu trúc kaempferol của phần aglycon trong NX2, dựa trên phổ hợp chất kaempferol.

Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất NX2 chỉ ra nó là một dẫn xuất O- glycosid của kaempferol Phân tử đường gồm 5 tín hiệu tại C 109,6 (C-1'');

Các giá trị 83,2 (C-2''), 78,5 (C-3''), 87,8 (C-4''), và 62,4 (C-5'') cho thấy đây là một furanose Các giá trị C của phân tử đường này hoàn toàn trùng khớp với các giá trị tương ứng của -L-arabinofuranose đã được công bố Đối với -L-arabinofuranose, ba tín hiệu dễ nhận biết nhất là cacbon anome và hai tín hiệu cacbon CH với độ chuyển dịch hóa học cao, cụ thể là C 109,6 (C-1''), 83,2 (C-2''), và 87,8 (C-4'') Tương tác giữa proton anome H 5,48 (H-1'') và cacbon C cũng được ghi nhận.

134,8 (C-3) trên phổ HMBC cho phép xác định vị trí liên kết của arabinofuranose với khung kaempferol tại C-3 Tham khảo tài liệu hợp chất

NX2 [18] được nhận biết là kaempferol-3-O--L-arabinofuranosid

Tính chất: Dạng bột màu vàng nhạt, phổ APCI-MS m/z 449,1, công thức phân tử C21H20O11

Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT của chất NX3 và chất tham khảo [18] được trình bày ở bảng 3.4

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

B ả ng 3.4: D ữ li ệ u ph ổ NMR c ủ a NX3 và chất tham khảo [18]

C DEPT δ C NX3 ppm δ C Xa,b ppm δ H NX3 (ppm) (Mult, J =Hz) δ H Xa,c (ppm) (Mult, J =Hz)

5' CH 116,2 116,1 6,90 (d; 9,0) 6,87 (dd; 2,1; 8,7) 6' CH 132,4 132,3 8,08 (d; 9,0) 8,04 (d; 9,0) 1'' CH 104,1 104,1 5,25 (d;7,5) 5,23 (d;7,5) 2'' CH 75,6 75,7 3,46 (m) 3,40 (dd; 7,2; 10,0)

3,71 (dd; 2,1; 11,7) 3,51 (dd; 5,4; 11,7) a Đo trong CD 3 OD , b 125 MHz, c 500 MHz của chất tham khảo [18]

Hợp chất NX3 được phân lập dưới dạng bột màu vàng nhạt và có công thức phân tử C21H20O11, được xác định qua pic ion giả phân tử ở m/z 449,1 trên phổ khối lượng APCI-MS.

Phổ 1 H-NMR của NX3 xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δH 6,24 (1H, d, J=2,0Hz; H-6) và δ H 6,41 (1H, d, J=2,0Hz; H-8) điển hình cho hai proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A của hợp chất flavonol Cặp tín hiệu doublet khác tại δH 6,90 (2H, d, J=9,0Hz; H-3', H-5') và δH 8,08 (2H, d,

J=9,0Hz; H-2', H-6') đặc trong cho vòng thơm thế para Tín hiệu proton anomer tại δH 5,25 (1H, d, J=7,5Hz; H-1'') gợi ý trong phân tử hợp chất NX3

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU có mặt một gốc đường

Trên phổ 1 3 C-NMR và DEPT của hợp chất NX3 xuất hiện của 21 nguyên tử carbon, trong đó có 11 nhóm methin và 1 nhóm methylen Trong đó

Các tín hiệu tại δC 104,1; 75,6; 78,5; 71,4; 78,2 và 62,7 tương ứng với các nguyên tử carbon C-1'', C-2'', C-3'', C-4'', C-5'' và C-6'' xác nhận sự hiện diện của nhóm glucopyranosyl Đồng thời, tín hiệu của 15 nguyên tử carbon cũng thuộc về khung flavonol với vòng B thế para.

So sánh các dữ liệu phổ NMR của hợp chất NX3 với hợp chất kaempferol-3-

O-β-D-glucopyranosid [18] thấy gần như hoàn toàn phù hợp Tương tác HMBC giữa tín hiệu proton δH 5,25 (H-1'') với tín hiệu carbon δC 135,6 (C-3) gợi ý nhóm O-β-D-glucopyranosyl gắn vào vị trí số 3 Từ các dữ liệu phổ trên, cho phép kết luận hợp chất NX3 có tên là kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Bàn lu ậ n

3.3.1 V ề chi ế t xu ấ t cao toàn ph ần và phân đoạ n t ừ lá Khôi đố m Đề tài đã chiết xuất được cao toàn phần từ lá Khôi đốm bằng phương pháp chiết lạnh: ngâm tại nhiệt độ phòng trong 3 ngày với dung môi EtOH 80% Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền thu được khối lượng cắn toàn phần đạt 6% so với lượng dược liệu ban đầu Cắn toàn phần sau đó được chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, ethyl acetat thu được ba phân đoạn là n-hexan, ethyl acetat và và dịch chiết nước, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 60 0 C thu được lần lượt các cắn phân đoạn với khối lượng đạt 0,368% ; 1,152% ; 1,064% so với nguyên liệu khô ban đầu

3.3.2 V ề phân l ập và xác đị nh c ấ u trúc các h ợ p ch ấ t

Kết quả nghiên cứu đã phân lập được ba hợp chất từ dịch chiết nước của lá Khôi đốm tại tỉnh Nam Định Cấu trúc của các hợp chất này được xác định thông qua các phương pháp như đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối, và phổ cộng hưởng hạt nhân, cùng với việc so sánh với dữ liệu công bố trước đó Ba hợp chất được xác định bao gồm 4',5,7-Trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon (NX1), Kaempferol-3-O-α-L-arabinofuranosid (NX2), và Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid (NX3).

4',5,7-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon là một flavonoid lần đầu tiên được phân lập từ lá cây Khôi đốm và chi Sanchezia, chủ yếu tồn tại trong các loại cỏ và ngũ cốc thuộc họ Poaceae như lúa mì, lúa mạch, và ngô Hợp chất này nổi bật với nhiều tác dụng sinh học như chống viêm, chống oxy hóa, và ức chế sự hình thành khối u, đặc biệt là trong các loại ung thư như ung thư biểu mô đại trực tràng và ung thư vú Các cơ chế phân tử của nó đang được làm rõ, cho thấy 4',5,7-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon có khả năng giảm phản ứng viêm trong tế bào hPBMC thông qua việc điều chỉnh các con đường tín hiệu TLR4/NF-κB/STAT, p38MAPK và PI3K/AKT.

Bản quyền @ Trường Y Dược, ĐHQG Hà Nội nghiên cứu các cơ chế liên quan đến ung thư vú và ung thư trực tràng, đặc biệt thông qua việc ức chế hoạt động của cyclooxygenase và P-glycoprotein Năm 2016, Jang Mi đã thực hiện các nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực này.

Nghiên cứu in vitro của Han và cộng sự đã chỉ ra rằng hợp chất này có khả năng ức chế sự hình thành khối u bằng cách ngăn chặn đồng thời yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu VEGFR2 và protein HIF-1α.

Năm 2017, từ lá của loài Casearia arborea (Salicaceae), Augusto L Santos và cộng sự cho thấy hợp chất có tác dụng điều trị bệnh do nhiễm ký sinh trùng

Leishmania gây ra và tác dụng điều hòa miễn dịch trên tế bào chủ do kích thích đại thực bào sản xuất ra NO (oxit nitric) [42]

Kaempferol-3-O-α-L-arabinofuranosid là một flavonoid được chiết xuất từ nhiều loài thực vật khác nhau, bao gồm Rubus rigidus var camerunensis thuộc họ Rosaceae và Polygonum aviculare thuộc họ Polygonaceae Đây cũng là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ cây Khôi đốm và chi của nó.

Sanchezia có nhiều tác dụng quan trọng, bao gồm khả năng chống viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, và tác dụng chống oxy hóa Nó cũng cho thấy hoạt động bảo vệ thần kinh, giúp giảm độc tính do glutamate trên các tế bào HT22, đồng thời có khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 Năm 2014, Hyo Hyun Yang và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống lão hóa của hợp chất này trên nguyên bào sợi ở người từ bộ phận trên mặt đất của loài Polygonum aviculare.

Kaempferol-3-O-α-L-arabinofuranosid đã được nghiên cứu và cho thấy có khả năng giảm β-galactosidase, một dấu ấn sinh học liên quan đến lão hóa tế bào Nghiên cứu này mở ra triển vọng cho việc phát triển các chất bổ sung dinh dưỡng và mỹ phẩm nhằm ngăn ngừa lão hóa và các bệnh liên quan đến tuổi tác Ngoài ra, hợp chất này còn có khả năng ngăn ngừa viêm gan bằng cách vô hiệu hóa con đường tín hiệu TLR4/NF-κB Năm 2018, Fang-Xue Zhang và cộng sự đã chứng minh rằng kaempferol-3-O-α-L-arabinofuranosid có tác dụng chống viêm trong mô hình bệnh Parkinson ở chuột, làm giảm sản xuất cytokine tiền viêm do LPS gây ra, nhờ vào việc ức chế TLR4/NF-κB Do đó, hợp chất này có khả năng cải thiện tình trạng viêm thần kinh do LPS gây ra và chống lại sự thoái hóa.

Nghiên cứu tại Trường Y Dược, ĐH Quốc gia cho thấy rằng việc can thiệp vào con đường tín hiệu TLR4/NF-κB có thể làm giảm triệu chứng Parkinson Điều này mở ra triển vọng cho một chiến lược điều trị mới, an toàn và hiệu quả cho bệnh nhân Parkinson trong tương lai.

Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid là một flavonoid quan trọng có mặt trong nhiều loại thực vật như cây tơ hồng, dâu tằm, trà xanh, rau má, cây hồng, rau đay và muồng trâu Nó cũng được tìm thấy trong các cây thuốc như cam thảo và đỗ trọng, thuộc các họ thực vật như Ebenaceae, Rosaceae và Eucommiaceae.

Hợp chất này sở hữu nhiều tác dụng dược lý quan trọng, bao gồm khả năng chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, bảo vệ hệ thần kinh, hỗ trợ bệnh nhân đái tháo đường, và ngăn ngừa viêm loét dạ dày.

Nghiên cứu về kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid cho thấy hợp chất này có khả năng bảo vệ chống lại phản ứng dị ứng trong mô hình hen dị ứng do ovalbumin gây ra ở chuột Cụ thể, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid ức chế bạch cầu ái toan và giảm số lượng bạch cầu ái toan trong mô phổi Hơn nữa, điều trị bằng hợp chất này còn giúp ngăn chặn sự phá hủy phế nang và mở rộng đường thở trong mô hình viêm gây ra bởi ovalbumin.

Hợp chất này đã được chứng minh có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, bao gồm tế bào ung thư bạch cầu HL-60 và tế bào ung thư gan.

(HepG2, Huh-7 và H22) [27], tếbào ung thư da (HaCaT, A375P và SK-MEL-

Năm 2018, J Zhang và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tổn thương da do tia UV, sử dụng dòng tế bào da HaCaT trong ống nghiệm và mô hình thực nghiệm trên chuột Nghiên cứu này liên quan đến các tế bào ung thư phổi A549 và H1299.

Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid có tiềm năng trở thành một chất chống ung thư mới trong việc phòng ngừa và điều trị tổn thương da do tia cực tím UV, nguyên nhân chính dẫn đến ung thư biểu mô tế bào vảy da Hợp chất này hoạt động bằng cách ức chế đặc hiệu mục tiêu phân tử p38 MAPK và có độc tính thấp.

Các nghiên cứu cho thấy kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid có khả năng chống oxy hóa như khả năng ức chế stress oxy hóa gây ra bởi nội độc tố,