Khóa luận chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá cây gan heo (dicliptera chinensis (l ) ness)

T Ổ NG QUAN

V ị trí phân lo ại, đặc điể m th ự c v ậ t, phân b ố

1.1.1 Vị trí phân loại chi Dicliptera

Theo Hệ thống phân loại về ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta của tác giả Takhtajan, chi Dicliptera có vị trí phân loại như sau [30]:

Ngành Ngọc Lan: Magnolipphyta Lớp ỏ Tháp út: Equisetopsida C Agardh Phân lớp Mộc Lan: Magnoliidae Novák ex Takht ộ Hoa Môi: Lamiales

1.1.2 Đặc điểm thực vậ t chi Dicliptera

- Dạng sống: dạng cây thân thảo

- Lá: lá đơn mọc cách, lá hình trứng Lá bắc hình bầu dục, có lông hoặc hình trứng ngược

- Cụm hoa: dạng xim, dạng chùy hay chùm hoặc bông ở nách lá hay ở đỉnh cành, có khi ở trên thân Đôi khi hoa đơn độc ở nách lá hoặc đỉnh cành

- Hoa: Tất cả chi đều có hoa lưỡng tính Hoa mẫu 4 hoặc mẫu 5

- Tràng: Tràng dạng ống, môi trên 3 khía, môi dưới nguyên

Bao phấn thường có hai ô, với hình dạng thuôn, gần tròn hoặc hình đường Chúng được đính lưng và mở dọc, trong khi gốc bao phấn thường có phần phụ dạng móc hoặc lông Ngoài ra, bao phấn còn được đính trên chỉ nhị lệch nhau.

- Bộ nhụy: Tất cả đều có bầu thượng Bầu hình tròn, gần tròn, hoặc bầu dục; bầu phủ lông mịn hoặc nhẵn

- Quả: ở Việt Nam chỉ có dạng quả nang, mở 2 mảnh, quả có lông, giá noãn dựng đứng ở gốc

- Hạt ép dẹt, bề mặt nhiều điểm nốt, bề mặt hạt thường có lông [9]

Hình 1.1 Một số hình vẽ bộ phận chi Dicliptera [9]

1.1.3 Số lượng, đặc điểm các loài thuộc chi Dicliptera

- Trên thế giới Chi Dicliptera họ Acanthaceae) bao gồm hơn 150 loài vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới hi này phân bố ở hâu : Trung Quốc, Lào, ampuchia,

Thái Lan, Indonesia, Malaysia, hâu Phi, hâu c và Mỹ [2, 4, 10]

- Việt Nam Chi Dicliptera gồm 4 loài [4 ; [8]:

Loài D bupleuroides Nees thuộc họ Lưỡng thiệt, là loại cỏ cứng cao khoảng 30cm với thân vuông, thường có màu đen khi khô hoặc nâu đậm, không có lông và có lóng dài từ 3-4cm Lá của cây mọc đối, có phiến hình trái xoan, mặt trên có màu nâu đen và mặt dưới màu nâu Hoa của loài này có hình môi, thường mọc thành chùm với ít hoa ở nách lá; đài hoa dài từ 6-8mm và vành hoa cao khoảng 1,5mm.

Loài D.chinensis Nees thuộc họ D ửu căn là một loại cây cỏ có thân hình bốn cạnh và phủ lông mịn Lá của nó mọc đối xứng, có hình bầu dục thon và cũng có lông mịn Hoa của cây có hình môi bẹt với môi trên nguyên, trong khi quả nang chứa hạt có ít lông.

V NU ây được phân bố ở các khu vực: Cao ằng, ắc ạn chợ Đồn , Thái

Nguyên, Hà Giang, Yên ái, H a ình, Nam Định, Hà Nội, Huế, Sài G n

Loài D leonotis Dalz là một loại cỏ đứng, có thân tròn và có lông ở giai đoạn non Lá của cây có phiến thon, kích thước từ 2-6 x 2cm, nhọn ở hai đầu và dài từ 2-10cm Hoa của cây mọc thành chùm ở kẽ lá, có hình dạng môi với môi trên hình xoan nhọn và môi dưới có ba răng Quả nang có lông, hạt có hình tròn hoặc dẹt Loài này được phân bố chủ yếu ở các huyện miền núi như Hiêm Hóa, Na Hang tỉnh Tuyên Quang và huyện miền núi tỉnh Quảng Nam.

H a Vang thành phố Đà Nẵng và một số tỉnh khác Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thái Nguyên)

Loài D vestita R là một loại cây cỏ có thân mảnh với chiều dài lóng từ 4-7cm Lá của cây có hình bầu dục hoặc hình trái xoan, kích thước từ 4-7 x 3cm và được phủ một lớp lông sáp mịn Hoa của loài này có hình môi, với môi trên rộng và hình xoan, trong khi môi dưới nhỏ hơn, thường mọc ở nách lá và có nhiều lông, kèm theo lá đài hình kim.

Quả nang nhỏ có lông, mọc hoang và được trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc như Thạch An, Lạng Sơn, Văn Quan, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Quảng Ninh và Sơn La.

1.1.4 Đặc điểm thực vật củ a cây Gan heo

- Tên khác: Lá diễn, Cửu văn, an thái

- Tên khoa học : Dicliptera chinensis (L.) Ness Gan heo là cây thân thảo sống hằng năm hay vài ba năm, cao 30-80cm

Thân và cành non của cây có 4 cạnh và được phủ lông tơ, với các mấu phình to giống như đầu gối Lá cây mọc đối, có màu xanh lục, phiến lá hình trứng thuôn, kích thước dài từ 2-7cm và rộng từ 2-4cm, với đầu và gốc nhọn cùng lông thưa Các lá bắc có hình trái xoan, dài từ 8-11mm, trong khi các tiền diệp lại hẹp.

Hoa màu trắng hồng, mọc thành xim ở nách lá và ởđầu cành.Ra hoa từ mùa đông đến mùa hạ (từtháng 12 đến tháng 5)

Quả nang ngắn có lông tơ ở phía đầu Hạt dẹt

 Phân bố của cây Gan heo:

Cây của vùng lục địa Ðông Nam Á Châu, được tìm thấy ở Việt Nam, Trung Quốc và Lào [4]

Việt Nam có sự phân bố phổ biến ở các tỉnh miền núi phía bắc, nơi thường thấy cây mọc hoang dã ven đường, suối, và bãi trống Các tỉnh thuộc vùng núi thấp và trung du như Lạng Sơn, Quảng Ninh, Nam Định, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Kạn, và Thái Nguyên là những nơi lý tưởng cho sự phát triển của cây Người dân có thể thu hái toàn cây quanh năm, sử dụng tươi hoặc phơi khô để bảo quản.

1.1.5 Đặc điểm bột dược liệu và vi phẫ u cây Gan heo

- Đặc điểm vi phẫu lá cây Gan heo [15]:

Lá cây Gan heo là lá có các gân hình lông chim nêm lá chia ra làm hai phần: Phần gân lá và phần phiến lá ở hai bên

Phiến lá bao gồm hai lớp biểu bì: biểu bì trên được cấu tạo bởi các tế bào sống sắp xếp đều, không chứa diệp lục và không có lỗ khí; trong khi biểu bì dưới có lỗ khí và mang lông bảo vệ, có thể là đơn bào hoặc đa bào.

Gân lá có cấu trúc lồi lên ở cả hai mặt, với lớp biểu bì trên và dưới được hình thành từ các tế bào kéo dài theo chiều dọc của gân giữa Bên dưới lớp biểu bì là hai lớp mô dày, bao gồm mô dày trên và mô dày dưới, được cấu tạo từ các tế bào có vách dày bằng cellulose, có chức năng nâng đỡ Mô giậu được hình thành bởi các tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn, trong khi đó mô xốp bên trong là mô mềm với các tế bào hình đa giác kích thước khác nhau, sắp xếp lộn xộn Cuối cùng, các libe gỗ tạo thành một hình cung hoặc vòng bao quanh lấy gỗ.

Bột từ phần trên mặt đất của cây Gan heo có màu nâu và khi quan sát dưới kính hiển vi, ta thấy chứa các thành phần như lông tơ che chở đơn bào, lông tơ che chở đa bào, bào thạch, lỗ khí, biểu bì mang lỗ khí, mảnh mô mềm và mảnh mạch.

Hình 1.2 Vi phẫu lá cây Gan heo [15]

Hình 1.3 Một số vi phẫu bột cây Gan heo [15]

1 Lông che chởđơn bào 5 Lỗ khí

2 Mảnh mạch xoắn 6 Mảnh bần

3 Mảnh mô mềm 7 Bào thạch

Thành ph ầ n hóa h ọ c c ủ a cây Gan heo

- Dịch chiết cây Gan heo được định tính các hợp chất bằng phương pháp hóa học [15]

Bảng 1.1 Kết quảđịnh tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học

Ghi chú: (- âm tính, + dương tính không rõ, ++ dương tính rõ, +++ dương tính rất rõ

STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận

1 Acid amin TT Ninhydrin ++ Có

3 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Không có

5 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc +++ Có

6 Coumarin Mở vòng lacton - Không có

7 Đường khử TT Fehling +++ Có

Hơi NH4OH Cyanidin FeCl3 5%

9 Glycosid tim Phản ứng Liebermann

10 Saponin Hiện tượng tạo bọt

12 Acid hữu cơ Bột Na 2 CO 3 +++ Có

Cây Gan heo chứa nhiều thành phần quan trọng như acid amin, caroten, chất béo, đường khử, flavonoid, saponin, tannin và acid hữu cơ Những hợp chất này đóng vai trò thiết yếu trong việc cung cấp dinh dưỡng và có thể mang lại lợi ích cho sức khỏe.

Nhóm tác giả Vũ Đức Lợi và Nguyễn Tiến Vững đã nghiên cứu và phân lập một số hợp chất từ lá cây Gan heo tại Việt Nam Qua quá trình chiết siêu âm bằng dung môi ethanol và phương pháp sắc ký cột, ba hợp chất đã được tách ra Cấu trúc của các hợp chất này được xác định dựa trên các kết quả đo như nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối, và phổ cộng hưởng hạt nhân, đồng thời so sánh với dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan.

Hợp chất 3 lần đầu tiên phân lập được từ lá cây Gan heo

Nhóm tác giả tại Đại học Bắc Kinh, Trung Quốc đã phát hiện ra một loại verebroside mới có tên dicliptercerebroside, được phân lập từ cây Dicliptera chinensis Cerebrosides, một nhóm glycosphingolipid, là các monoglycosylceramid quan trọng trong cơ thịt động vật và màng tế bào thần kinh.

Cấu trúc của dicliptercerebrosid được xác định là: 1-O-β-D- glucopyranosyl-2N - [(2'R) -2'-hydroxy- (9Z) -palmitoleoyl] -2S, 3S, 4R-C

Như vậy, nhóm tác giả đã phân lập được 3 chất từ dịch chiết Dicliptera chinensis đó là:

 Amidoalcohol ác câu trúc trên được xác định trên bằng phương pháp quang phổ

- Vào tháng 6 năm 2006, 3 tác giả trên cũng có bài báo trên Pubmed là:

Gao YT, Yang XW , Ai TM [25]

Các hợp chất được tách ra thông qua các phương pháp sắc ký như sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp mỏng và HPLC đảo ngược Để xác định cấu trúc của các hợp chất này, các kỹ thuật quang phổ như UV, NMR và MS được sử dụng.

Bảy hợp chất đã được phân lập từ chiết xuất ethyl axetat Cấu trúc của chúng được xác định là:

 secoisolariciresinol dimethyl eter dicalat (II)

 5-methoxy-4, 4'-di-O-methyl secolariciresinol (III)

Trong đó, công thức hóa học của các chất được xác định như sau:

Bảng 1.2 Bảy hợp chất đã được phân lập từ chiết xuất etyl axetat

STT Tên chất Công thức hóa học

M ộ t s ố tác d ụng dược lý đã đượ c nghiên c ứ u

1.3 Một số tác dụng dƣợc lý đã đƣợc nghiên cứu

1.3.1 Tác d ụ ng ch ống xơ gan

Nghiên cứu cho thấy polysaccharide từ cây Gan heo (Dicliptera chinensis) có khả năng tác động lên TGF-β/Smad và ức chế hoạt động của tế bào hình sao ở chuột bị xơ gan do dimethylnitrosamine Mục tiêu của nghiên cứu này là theo dõi ảnh hưởng của polysaccharide Dicliptera chinensis (DCP) đối với bệnh xơ gan HF và hoạt động của các tế bào hình sao gan (HSC).

Mô hình xơ gan được tạo ra bằng cách tiêm dimethyl nitrosamines (DMN) vào chuột Nhóm chuột điều trị được tiêm tĩnh mạch với các nồng độ DCP khác nhau (0, 100, 300 mg/kg) Các thuốc nhuộm và phép thử được sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của các tế bào gan Kết quả cho thấy DCP có khả năng làm giảm xơ gan do DMN gây ra ở chuột, với sự giảm đáng kể các biểu hiện TGF-β1, pSmad2/3 và α-SMA trong mô gan theo liều lượng.

Như vậy, DCP nhắm mục tiêu tới TGF-β / Smad và ức chế sự kích hoạt tế bào Stellen ở chuột bị gây xơ gan do dimethylnitrosamine

Kiểm tra bệnh học cho thấy liều cao và trung bình của D P có hiệu quả rõ rệt trong việc cải thiện tình trạng xơ gan, giảm viêm và hoại tử DCP cũng chứng minh khả năng cải thiện chức năng gan, thể hiện qua việc giảm nồng độ men gan ALT, aspartate aminotransferase (AST) và tổng bilirubin.

Tăng albumin L và giảm nồng độ huyết thanh của hoại tử khối u liên quan đến yếu tố alpha (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) ở chuột HF Đồng thời, hàm lượng acid hyaluronic (HA), collagen type IV (IV-C), precollagen type III (PCIII) và laminin (LN) trong mô gan của chuột nhắt bị xơ gan giảm đáng kể, trong khi biểu hiện của yếu tố tăng trưởng-β (TGF-β), collagen type I (Col-I) và protease kim loại-1 (TIMP-1) lại tăng lên.

DCP thể hiện khả năng chống độc tính gan hiệu quả đối với DMN ở chuột nhắt HF Cơ chế này liên quan đến việc điều chỉnh các enzyme huyết thanh chức năng, cải thiện chức năng trao đổi chất và ức chế phản ứng viêm trong mô gan.

- Các DCP có tác dụng làm giảm tổn thương gan ở chuột khi cho chuột sử dụng thuốc chống lao isoniazid và rifampicin

Chuột bị tổn thương gan trước và sau khi điều trị với DCP đã được lấy mẫu máu và gan để xét nghiệm các chỉ số ALT, AST, AKP, NO, TNF-α, IL-6 qua phương pháp miễn dịch ELISA Kết quả cho thấy bệnh lý gan ở chuột đã cải thiện, với số lượng tế bào viêm giảm và các chỉ số xét nghiệm cũng giảm, cho thấy DCP có hiệu quả trong điều trị tổn thương gan do thuốc kháng lao, liên quan đến cơ chế tác dụng kháng viêm của nó.

1.3.3 Tác d ụ ng ch ố ng oxy hóa

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc sử dụng dịch chiết metanol thô từ các bộ phận trên mặt đất của Dicliptera roxburghiana DRM, sau đó lắc phân đoạn với các dung môi để tạo ra các phân đoạn n-hexane (DRHF), chloroform (DRCF), ethyl acetate (DREF), n-butanol (DRBF) và phần nước dư (DRF) Nhóm tác giả Ahmad đã tiến hành đánh giá hoạt động chống oxy hóa của các phân đoạn này thông qua các phương pháp phân tích khác nhau.

The results indicate the presence of various oxidizing compounds, including flavonoids, phenols, tannins, alkaloids, saponins, terpenoids, and coumarins, with the highest concentrations found in the MeOH, chloroform, EtOAc, and n-butanol extracts.

1.3.4 Tác d ụ ng trên ch ức năng sinh s ả n ở chu ộ t cái

Ảnh hưởng tới thông số sinh lý, sinh hóa trên chuột cái chưa trưởng thành

Phương pháp: chiết xuất dung dịch nước của hỗn hợp lá (ADHJ) bốn cây thuốc (Aloe buettneri, Dicliptera verticillata, Macranthus hibiscus và

Justicia insularis) Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá phản ứng buồng trứng với hỗn hợp lá ở chuột cái chưa trưởng thành

Trong một nghiên cứu, các liều lượng khác nhau của chiết xuất nước từ J insularis được cho chuột cái chưa trưởng thành ăn hàng ngày trong 20 ngày Chuột được chia thành 4 nhóm thực nghiệm, mỗi nhóm gồm 20 con Cuối giai đoạn thử nghiệm, một số thông số sinh hóa và sinh lý liên quan đến chức năng buồng trứng đã được kiểm tra.

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của dung dịch hỗn hợp lá tới sự hình thành nang trứng và sinh sản ở chuột cái

Trọng lượng buồng trứng Tăng gấp 3 hoặc gấp đôi so với đối chứng

Protein Tăng đáng kể 58,09% và 45,64%

Cholesteron Giảm 70% ở chuột được tiêm Điểm xuất huyết Giảm

Trọng lượng tử cung Giảm Thông số sinh và thai Tăng số lượng thể vàng

Hỗn hợp lá này có khả năng điều chỉnh chu kỳ kinh nguyệt, giảm đau bụng kinh và hỗ trợ điều trị vô sinh ở phụ nữ, có thể do chứa estrogen trong thành phần dịch chiết.

Hỗn hợp dịch chiết từ Dicliptera verticillata có tác động đến nồng độ estradiol, hormone nữ, và ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa gan ở chuột cái chưa trưởng thành.

Năm 2002, nhóm tác giả gồm Telefo PB, Moundipa PF, Tchouanguep

FM nghiên cứu tác dụng của hỗn hợp dịch chiết từ lá của các loài Aloe buettneri, Justicia insularis, Hibiscus macranthus và Dicliptera verticillata

Nghiên cứu cho thấy khi cho chuột cái chưa trưởng thành uống hỗn hợp dịch chiết với liều 13, 49 và 94 mg/kg mỗi ngày trong 15 ngày, nồng độ estradiol trong buồng trứng và huyết thanh tăng đáng kể, cùng với sự gia tăng trọng lượng tử cung Bên cạnh đó, hoạt động của N-demethylase aminopyrine ở chuột điều trị cũng giảm.

Tác d ụ ng và công d ụ ng theo y h ọ c c ổ truy ề n

Tính vị: Gan heo có vị ngọt, nhạt, tính mát [2, 12]

Quy kinh: an, phế, thận [10 ông năng: Thanh nhiệt, tiêu viêm, lợi tiểu, làm mát máu, sinh tân dịch, mát gan, lương huyết giải độc [2]

Toàn cây được dùng làm thuốc, dùng ngoài, sắc uống, có thể làm phẩm nhuộm màu Lá non, ngọn cây làm thực phẩm.[4, 6]

Theo dân gian, dùng cả cây Gan heo với hàm lượng dùng 30-60g cây khô hay 60-120g cây tươi sắc uống, có tác dụng như sau:

2 Viêm phổi nhẹ, viêm ruột thừa cấp

3 Viêm gan cấp, viêm kết mạc

6 Giảm niệu, đái ra dưỡng trấp Dùng lá cây với các trường hợp bệnh:

1.Dùng ngoài trị lở sưng, rôm sẩy, mụn nhọt, bỏng rạ, dùng lá tươi giã nát xoa lên vùng da bị lở

2.Dùng lá để nấu canh, nấu với thịt lợn, ăn rất mát và bổ gan

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Nguyên v ậ t li ệ u

Mẫu lá cây Gan heo (Dicliptera chinensis L Nees) được thu hái vào tháng 6 năm 2016 tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định với số hiệu Vũ Đức Lợi 09 Mẫu tiêu bản này là cây tươi, bao gồm ảnh chụp chi tiết về dạng sống, hoa và lá Nó đáp ứng đủ tiêu chuẩn để giám định tên khoa học, bao gồm cả cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản.

Mẫu thực vật được giám định bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật có tên khoa học là Dicliptera chinensis (L.) Nees, thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) Thông tin chi tiết về mẫu thực vật này được trình bày trong phiếu giám định tên khoa học tại phụ lục 1.

Lá Gan heo được rửa sạch, sau đó được làm khô hoặc sấy khô ở nhiệt độ khoảng 40°C và thái nhỏ để bảo quản, phục vụ cho việc nghiên cứu thành phần hóa học, chiết xuất và phân lập.

Hình 2.1 Mẫu cây Gan heo

Các dung môi sử dụng trong quá trình chiết xuất và phân lập bao gồm n-hexan, etyl acetat, dicromethan, etanol, cloroform, toluen và dimethyl sulfoxide (DMSO) Tất cả các dung môi này đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi sử dụng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả trong các ứng dụng nghiên cứu và sản xuất.

- Dung môi tinh khiết bao gồm: nước cất 2 lần, dimetylsulfosid (DMSO)

- Các dung môi phân tích gồm: MeOH, n-hexan, EtOAc, H₂O dùng để phân tích sắc ký đều đạt tiêu chuẩn phân tích

- Sắc ký lớp mỏng: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60

Bản mỏng F 254 Merck với độ dày 0,2mm được kiểm tra sau khi sắc ký bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 365nm Để hiện màu, sử dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.

Sắc ký cột là phương pháp sử dụng silica gel với kích cỡ hạt từ 0.063-0.200mm và 0.040-0.063 mm do Merck cung cấp Phương pháp này áp dụng cho các loại cột sắc ký có kích thước đa dạng, phù hợp với nhiều nhu cầu phân tích khác nhau.

Trang thi ế t b ị , d ụ ng c ụ , máy móc

- ác dụng cụ thí nghiệm thủy tinh: ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, pipet

- Các thiết bị khác: Tủ sấy, tủ hút, cân phân tích, kính hiển vi

- Phổ khối ESI-MS đo trên máy Varian gilent 1100 L -MSD tại

Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

- Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 io ote, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phương pháp nghiên cứ u

2.2.1 Phương pháp chiế t xu t, phân l ậ p h ợ p ch t

Mẫu nghiên cứu sau khi được rửa sạch và phơi khô, thái nhỏ và ngâm chiết 3 lần trong dung môi ethanol, sử dụng chiết bằng thiết bị siêu âm (50 o C,

3 giờ) Dịch chiết thu được lọc qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao toàn phần

Cao chiết này được phân tán trong nước và chiết xuất bằng các dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực, bao gồm n-hexan và ethyl acetat Các phân đoạn n-hexan và ethyl acetat sau đó được cất để loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao tương ứng cho từng phân đoạn.

Hình 2.2: Sơ đồ chiết tách phân đoạn

Lắc phân đoạn với n-hexan Thu hồi dung môi

Phân đoạn n- hexan Phân đoạn nước

Phân đoạn ethyl acetat Phân đoạn H2O

Để lựa chọn các phân đoạn tiềm năng, chúng ta sử dụng sắc ký lớp mỏng và tiến hành xử lý, phân lập Quá trình nghiên cứu này chủ yếu áp dụng phương pháp sắc ký cột để tách biệt các hợp chất từ các phân đoạn đã chọn Việc theo dõi các phân đoạn trong quá trình phân lập được thực hiện thông qua sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng điều chế.

Sắc ký cột là phương pháp sử dụng silica gel làm chất hấp phụ, bao gồm cả pha thường và pha đảo, với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần Silica gel pha thường có kích thước hạt từ 0,063-0,200 mm và 0,040-0,063 mm (Merck), phù hợp với nhiều loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau.

Sắc ký lớp mỏng TL được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng silica gel 60 F 254 Merck với độ dày 0,2 mm và RP-18 F 254 s có độ dày 0,25 mm Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng sẽ được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, tiếp theo là phun thuốc thử bằng dung dịch.

H 2 SO 4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ

Sắc ký lớp mỏng pTL được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng silica gel 60G F 254 với độ dày 1,0 mm (Merck) Sau khi sắc ký, bản mỏng được kiểm tra dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm Ngoài ra, có thể cắt rìa bản mỏng để phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, sau đó đốt nóng trên bếp điện từ và ghép lại bản mỏng để xác định vùng chất bằng dung môi thích hợp.

2.2.2 Phương pháp xác đị nh c u trúc h ợ p ch t

Cấu trúc của các chất phân lập được xác định thông qua phân tích phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) Bên cạnh đó, các thông số vật lý như phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS), góc quay cực đo bằng máy DIP-360 và điểm nóng chảy cũng được kết hợp để hỗ trợ quá trình phân tích.

Mp và so sánh các dữ liệu thực nghiệm và các dữ liệu được công bố để đưa ra kết quả chính xác nhất a, Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion

Ion được xác định bởi tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của nó, ký hiệu là m/z Để tính toán khối lượng phân tử (M), việc biết số điện tích của ion là điều cần thiết.

Trong điều kiện ion hóa nhất định, sự phân mảnh của ion mẹ thành các ion con tuân theo quy luật cụ thể, với các chất có cấu trúc tương tự tạo ra những phân mảnh giống nhau Bằng cách phân tích khối lượng các phân mảnh và áp dụng các phương pháp phổ khác, có thể xác định cấu trúc của các chất chưa biết So sánh phổ khối của chất chưa biết với phổ khối của chất đã biết sẽ hỗ trợ trong việc định danh chất đó một cách chính xác và dễ dàng Bên cạnh đó, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cũng là một công cụ quan trọng trong việc phân tích cấu trúc hóa học.

Khi đặt chất có hạt nhân với số spin lẻ như 1H và 13C trong từ trường ngoài, các spin hạt nhân sẽ sắp xếp theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường, tạo ra trạng thái cân bằng giữa hai hướng này Khi chiếu bức xạ điện từ với tần số phù hợp, các spin hấp thu năng lượng và chuyển lên mức năng lượng cao, ngược chiều với từ trường Sau khi ngưng chiếu xạ, các spin sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng Để xác định năng lượng mà các hạt nhân trong phân tử hấp thu hoặc giải phóng, ta thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân Có hai phương pháp để xác định năng lượng cộng hưởng: phương pháp quét tần số cộng hưởng theo từng tần số và phương pháp biến đổi Fourier, hay còn gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (FT-NMR), hiện đang được sử dụng phổ biến.

Nguyên thuỷ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân phản ánh tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử Tần số hấp thu của hạt nhân có sự thay đổi đáng kể, ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

Để loại bỏ ảnh hưởng của từ trường ngoài B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với chất chuẩn trimethyl silan (TMS) cho tần số cộng hưởng của TMS Kết quả thu được thường rất nhỏ (phần triệu), vì vậy giá trị cộng hưởng của các hạt nhân được biểu thị bằng ppm, gọi là chuyển dịch hoá học Giá trị chuyển dịch hoá học của proton thường nằm trong khoảng 0-14 ppm, trong khi của carbon-13 dao động từ 0-240 ppm.

Tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy, với từ trường cao hơn dẫn đến dải tần số kích thích hạt nhân rộng hơn, từ đó cải thiện độ nhạy, chính xác và độ phân giải của phép đo Do đó, các phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân thường được gọi theo tần số kích thích các proton, như 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz.

Tùy thuộc vào mục đích và độ phức tạp của cấu trúc, có thể đo một hoặc nhiều loại phổ khác nhau Việc xác định phổ của cùng một loại hạt nhân như 1H là rất quan trọng trong nghiên cứu và phân tích hóa học.

13 như trong các phổ một chiều ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [16]

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

Phổ proton (1H-NMR) cung cấp thông tin về môi trường hóa học của proton trong phân tử Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ xuất hiện với sự dịch chuyển hóa học khác nhau trên phổ Một proton hoặc một nhóm proton có cùng môi trường hóa học sẽ hiển thị dưới dạng một đỉnh trên phổ, có thể là đỉnh đơn, đôi, ba, hoặc lên đến bảy đỉnh thành phần Diện tích của mỗi đỉnh tương ứng với số lượng proton của đỉnh đó, cho phép xác định số lượng proton thông qua diện tích đỉnh.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp thông tin quan trọng về môi trường hóa học của nguyên tử carbon Carbon có lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm, trong khi carbon liên kết đơn với oxy có những đặc điểm riêng biệt.

K Ế T QU Ả VÀ BÀN LU ẬN

K ế t qu ả chi ế t xu ấ t, phân l ậ p h ợ p ch ấ t

Mẫu lá cây Gan heo được chiết xuất như sau:

Mẫu lá cây Gan heo được phơi khô và nghiền thành bột với khối lượng 6,5 kg, sau đó chiết xuất bằng ethanol ba lần, mỗi lần sử dụng 8 lít dung môi Quá trình chiết được thực hiện bằng thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 50°C trong 3 giờ Dịch chiết sau đó được lọc qua giấy lọc, gộp lại từ ba lần chiết và tiến hành cất dung môi dưới áp suất giảm, thu được 630,0 g cặn chiết ethanol.

Chiết xuất 120 g cặn chiết vào 1,2 lít nước cất, sau đó tiến hành chiết phân bố với n-hexan và ethyl acetat Mỗi dung môi được chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần sử dụng khoảng 1,5 lít dung môi, thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng Sau khi cất, thu hồi dung môi, kết quả thu được là 31,0 g cặn n-hexan (H), 56,0 g cặn ethyl acetat (E) và 33,0 g lớp nước (N).

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá cây Gan heo

Chiết với EtOH (3 lần × 8 lít)

Thu hồi dung môi, h a tan thành nhũ dich trong H₂O

Lắc phân đoạn với n-hexan (3 lần × 1,5 lít)

Thu hồi dung môi Phân đoạn n-hexan

Lắc phân đoạn với EtOAc (3 lần × 1,5 lít)

Thu hồi dung môi Phân đoạn EtOAc

Thu hồi dung môi Phân đoạn EtOH Phân đoạn H₂O

Phân đoạn ethyl acetat từ lá cây Gan heo được phân lập thô bằng cột silica gel như sau:

Sử dụng phương pháp sắc kí cột

+ Cặn chiết ethyl acetat (50,0 g được triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, trộn cặn với lượng tối thiểu silicagel, sấy khô và nghiền mịn

Cột được làm sạch và lót một lớp bông mỏng ở đáy Tiếp theo, đổ 40ml chloroform vào cột, mở khóa để dung môi chảy từ từ, giúp đẩy hết bọt khí trong lớp bông ra ngoài Khi dung môi còn khoảng 3 cm trong cột, tiến hành khóa lại.

Cột được nhồi bằng phương pháp nhồi cột ướt, trong đó silica gel được trộn với dung môi chloroform để tạo thành hỗn dịch Hỗn dịch này được đổ lên cột, đồng thời nhẹ nhàng gõ quanh cột để nén hạt, loại bỏ bọt khí và đảm bảo phân bố đều Cuối cùng, cột được rửa bằng chloroform để hoàn thiện quá trình.

Sau khi luyện cột, cần kiểm tra xem cột có thẳng và không còn bọt khí Nếu đạt yêu cầu, hãy đậy nắp cột và để ổn định trong 24 giờ.

- Tiến hành sắc kí cột hấp thụ + Mở khóa cột cho dung môi chloroform chảy đến sát bề mặt silica gel, khóa cột lại

Để chuẩn bị cột, hãy đổ phần cặn đã trộn với silica gel lên trên, vừa dội vừa gõ nhẹ để đảm bảo cặn bám sát bề mặt silica gel Sau đó, lót một lớp bông mỏng lên bề mặt silica gel để hoàn thiện quá trình.

+ Sau đó rửa giải bằng dung môi và bắt đầu chạy cột Hệ dung môi rửa giải là chloroform/methanol, tỉ lệ thay đổi từ 30:1 đến 1:1

+ Điều chỉnh tốc độ rửa giải là 1ml/1 phút

Mỗi ống nghiệm có khả năng chứa khoảng 10ml dung dịch Sau khi kiểm tra các dịch rửa giải bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng, chúng tôi thu được bốn phân đoạn tương đồng với khối lượng lần lượt là E1 (6,0 g), E2 (14,2 g), E3 (6,3 g) và E4 (8,4 g).

Phân đoạn E4 được tách biệt bằng phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường, sử dụng dung môi rửa giải là hỗn hợp chloroform, aceton và nước theo tỷ lệ 3:4:0,1 Quá trình này đã thu được 5 phân đoạn nhỏ: E4.1 (1,6 g), E4.2 (1,4 g), E4.3 (1,2 g), E4.4 (0,8 g) và E4.5 (0,6 g).

+ Tinh chế phân đoạn E4.1 bằng cột sắc ký pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải aceton/nước 3:2, v/v thu được hợp chất 1 (23 mg)

Phân tách phân đoạn E4.3 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan/ aceton 7:3, v/v thu được hợp chất 2 (11 mg).

Xác đị nh c ấ u trúc các h ợ p ch ấ t phân l ập đượ c t ừ cây Gan heo

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từphân đoạn ethyl acetat

3.2 Xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây Gan heo

Tính chất: Chất bột màu trắng, vô định hình. Độ quay cực: [α 25 D = -64,2(c =0,1, MeOH)

Khối lượng phân tử: 276 Công thức phân tử: C 16 H 22 O 4

Phổ NMR trình bày ở Bảng 3.1

Silica gel pha thuận Cloroform/ methanol (30:1 đến 1:1)

Silica gel pha thuận Cloroform/aceton/H₂O (3:4:0.1)

Pha đảo RP18 Aceton/H₂O ( tỉ lệ 3:2)

Silica gel pha thuận Hexan/ aceton ( tỉ lệ 7:3)

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp ch t C 16 H 22 O 4 và ch t so sánh L

C DEPT C (1) H (1) ppm J: Hz H (L)ppm J:Hz

Hợp chất 1 được thu nhận dưới dạng bột màu trắng, với phổ ESI-MS cho thấy pic ion phân tử tại m/z 277,0 [M+H]+, tương ứng với M= 276 và công thức phân tử có thể là C16H20O4 Phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của 2 proton olefin, 1 nhóm methoxy và 3 nhóm methyl Phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra có 16 carbon, bao gồm 1 carbonyl, 4 carbon không liên kết với hydro, 4 carbon methin, 3 carbon methylen và 4 carbon methyl Trên phổ HMBC, có sự tương tác giữa H-10 và H-11 với các carbon C-3a, C-4 và C-4a; cũng như giữa H-3 với C-2, C-3a và C-9a.

106,8 đã xác định vị trí của 2 nhóm methyl tại C-4, liên kết đôi tại C-3/C-3a

Tương tác giữa nhóm methoxy (δH 3,20) và C-9a (δC 106,8) xác định vị trí gắn kết của nhóm methoxy tại C-9a Dựa vào dữ liệu phổ của hợp chất 1 và so sánh với số liệu đã công bố của hợp chất O-methyl-6-oxofurodysinin lacton, các vị trí tương ứng cho thấy sự trùng khớp rõ rệt.

Vì vậy, xác định hợp chất 1 là O-methyl-6-oxofurodysinin lacton

Tính chất:Hợp chất 2 có dạng tinh thể không màu, tan trong CHCl 3

Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3 δ ppm có kết quả như sau: 7,59 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-3′ , 7,09 1H, dd, J = 8,1, 1,8 Hz, H-9′ , 7,05 1H, d, J = 1,8

Hz, H-5′ , 6,93 1H, d, J = 8,1 Hz, H-8′ , 6,30 1H, d, J = 16,1 Hz, H-2′ , 5,85 (1H, br s, OH-7′ , 4,72 1H, d, J = 8,8 Hz, H-3), 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz, H-

24), 3,94 (3H, s, OCH3-6′ , 1,68 3H, s, H3-26), 1,62 (3H, s, CH3-27), 0,98 (3H, s, CH 3 -29), 0,97 (3H, s, CH 3 -18), 0,91 (3H, s, CH 3 -30), 0,90 (3H, s,

CH 3 -28), 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH 3 -21), 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz, CH 2 -19), 0,38 (1H, d, J = 4,4 Hz, CH 2 -19)

Phổ 1 H-NMR của hợp chất 2 cho thấy đây là hợp chất triterpenoid có dạng khung cycloartane Các tín hiệu của cyclopropane methylene tại δH 0,38 (1H, d, J =4,4 Hz, CH 2 -19) và 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz, CH 2 -19); bốn nhóm methyl bậc ba tại δH 0,98 (3H, s, CH 3 -29), 0,97 (3H, s, CH 3 -18), 0,91 (3H, s,

CH 3 -30), 0,90 (3H, s, CH 3 -28); một nhóm methyl bậc hai tại δH 0,89 (3H, d,

Trong nghiên cứu này, các tín hiệu proton quan trọng được ghi nhận, bao gồm nhóm methylene tại δH 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz, H-24) và nhóm feruloyl với các tín hiệu tại δH 7,59 (1H, d, J = 8 Hz, H-3′), 7,08 (1H, dd, J = 8,1, 1,8 Hz, H-9′), 7,04 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-5′), 6,92 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-8′), 6,30 (1H, d, J = 16,1 Hz, H-2′), 5,85 (1H, br s, OH-7′) và 3,94 (3H, s, O H3-6′) liên kết với C-3.

Với độ chuyển dịch hóa học ở trường thấp của H-3 (δH 4,72) so với cycloartenol (δH 4,72), nhóm feruloyl được xác định định hướng β dựa trên hằng số ghép cặp proton-proton giữa H-2ax và H-3ax (J = 8,8 Hz) Dựa vào dữ liệu phổ của hợp chất 3 và so sánh với dữ liệu phổ đã công bố của cycloartanyl ferulat, hợp chất 2 được xác định là Cycloartenyl ferulat.

Bàn lu ậ n

Đề tài nghiên cứu đã tiến hành chiết xuất cao toàn phần từ lá cây Gan heo bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ 50°C với dung môi cồn 96° Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và sử dụng thiết bị rẻ tiền, cho khối lượng cắn toàn phần đạt 9,69% so với lượng dược liệu ban đầu Sau đó, cắn toàn phần được chiết lỏng – lỏng với các dung môi n-hexan và ethyl acetat, thu được các cắn phân đoạn với khối lượng lần lượt là 0,48% và 0,86% so với nguyên liệu khô Nghiên cứu đã phân lập được hai hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat, dựa trên các đặc điểm lý hóa như cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, cùng với các phương pháp phân tích hiện đại như phổ khối APCI-MS, ESI-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C-NMR).

V NU được xác định lần lượt là: O-methyl-6-oxofurodysinin lacton (1) và

Cycloartenyl ferulat (2) là hai hợp chất chưa từng được công bố trong các nghiên cứu trước đây liên quan đến lá Gan heo Đóng góp này mang lại kiến thức mới, làm phong phú thêm hiểu biết về thành phần hóa học của cây Gan heo.

Hợp chất o-methyl-6-oxofurodysinin lacton

Hợp chất o-methyl-6-oxofurodysinin lacton được tìm thấy ở hai loài

Hải miên Dysidea Fragilis và Haliclona Oculata [5] và trong da của loài

Hợp chất o-methyl-6-oxofurodysinin lacton, được chiết xuất từ loài hải miên Dysidea fragilis, đã cho thấy khả năng chống lại hoạt tính gây độc tế bào ung thư Trong nghiên cứu sàng lọc sơ bộ, hợp chất này được thử nghiệm ở nồng độ 100 g/mL và cho thấy hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư, bao gồm KB, LU-1, HL-60, LnCaP, SK-MeI2, HepG2, MCF-7 và PC-3.

Kết quả cho thấy, hợp chất có khả năng ức chế >50% sự phát triển tế bào ung thư [5]

Hợp chất cycloartenyl ferulat, một loại -Oryzanol có nguồn gốc từ dầu cám, được hình thành từ este axit ferulic và rượu triterpene kết hợp với phytosterols Nghiên cứu cho thấy hợp chất này mang lại nhiều lợi ích sức khỏe, bao gồm khả năng chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u và giảm kali máu Cycloartenyl ferulat đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị mất cân bằng thần kinh và rối loạn mãn kinh.

Hợp chất cycloartenyl ferulate, một thành phần của gamma-oryzanol từ dầu cám gạo, có khả năng làm giảm sự phân hủy của tế bào Mast Nghiên cứu này tập trung vào việc kiểm tra ảnh hưởng của cycloartenyl ferulate (CAF) đối với phản ứng dị ứng.

Khi CAF và gamma-oryzanol được tiêm dưới da với DNP (phức DNA và

Protein V NU chống lại IgE trên da lưng chuột, làm giảm phản ứng quá mẫn do thụ thể kháng nguyên DNP-HSA F và gamma-oryzanol ức chế sự giải phóng hạt từ tế bào Mast IgE kết hợp với CAF không thể được phát hiện bằng kháng thể chống IgE trong phân tích ELISA Mặc dù ủ IgE với CAF không làm giảm lượng Ig, nhưng IgE có thể được kết tủa qua ly tâm Kết quả cho thấy CAF đã bắt giữ IgE, ngăn cản sự gắn kết với FcepsilonRI và giảm sự giải phóng hạt của tế bào Mast, do đó có tác dụng trong điều trị viêm dị ứng.

Nghiên cứu cho thấy cycloartenyl ferulate có tác dụng đa dạng, với chiết xuất methanol từ cám gạo và gamma-oryzanol ngăn chặn tình trạng viêm do TPA ở chuột Các hợp chất hoạt tính trong cám gạo như sitosterol ferulate, 24-methylcholesterol ferulate, cycloartenyl ferulate và 24-metylenecycloartanol ferulate đều ức chế rõ rệt viêm do TPA gây ra, với liều ức chế 50% khoảng 0,2-0,3 mg/con Đặc biệt, cycloartenyl ferulate còn làm giảm đáng kể tác động thúc đẩy khối u của TPA, khẳng định hoạt tính chống viêm và chống phát triển khối u ở chuột.

Hai hợp chất phân lập được đã được chứng minh có tác dụng sinh học, mở ra hướng nghiên cứu mới về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của lá cây Gan heo.

K ế t lu ậ n

Qua quá trình hoàn thành thực nghiệm, luận văn đã thu đươc kết quả sau đây:

- Đã phân lập được 02 chất bằng phương pháp chiết bằng dung môi ethanol và sắc ký từ phân đoạn ethylacetat của dịch chiết lá Gan heo

Cấu trúc hóa học của o-methyl-6-oxofurodysinin lacton (1) và cycloartenyl ferulat (2) đã được xác định dựa trên dữ liệu phổ thực nghiệm và so sánh với tài liệu đã công bố Đây là lần đầu tiên hai hợp chất này được phân lập từ lá cây Gan heo.

Ki ế n ngh ị

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Gan heo, bao gồm cả lá và phần trên mặt đất, là bước đầu tiên quan trọng Dựa trên kết quả phân tích hóa học, chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu tác dụng sinh học của cây Gan heo trên con người.

1 Nguyễn á 2014 , điển ách h a thực vật h c iệt Nam, NX Giáo dục Việt Nam, tr 393.

2 ĐỗHuy ích, Đặng Quang hung, ùi Xuân hương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai,

Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2011) đã biên soạn cuốn "Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam," tập III, do Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật phát hành tại Hà Nội, trang 479-480 Cuốn sách này cung cấp thông tin chi tiết về các loại cây thuốc và động vật được sử dụng trong y học truyền thống Việt Nam.

3 Võ Văn hi, Trần Hợp 1999 , Câ c c ch ở iệt Nam,tập I, NX

4 Võ Văn hi 2003 , điển thực vật th ng dụng, tập I, NX Khoa học và kỹ thuật, tr 957.

5 Nguyễn Thị Cúc (2017) Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa h c và hoạt tính diệt tế ung thư của hai loài hải miên Dysidea fragilis và alicl na culata (tt)”, luận án Tiến sĩ hóa học, học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

6 Lưu Đàm ư (2005), “Nghiên cứu chiết tách nhuộm màu thực phẩm t kinh nghiệm s dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số”, Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu hâu , Đại học Quốc gia Hà Nội

7 Nguyễn Thượng Dong (2006), Nghiên cứu thuốc t thả dược, NXB

Khoa học và Kỹ thuật

8 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1990), Phương pháp nghiên cứu hóa h c cây thuốc, NXB y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Dược

9 Đỗ Văn Hải, Dương Đức Huyến (2011 , Đặc điểm hình thái các chi thuộc họ Ô Rô ( Acanthaceae Juss) ở Việt Nam ộ ị

V NU toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 4,Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, tr 104-108

10 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây c Việt Nam, tập III, Nhà xuất bản trẻ, tr.73-74

11.Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.518-520

12.Nguyễn hí Tôn 2015 , Đ ng Na ược- vị thuốc chữa ệnh, tập I, NX Y học, tr 542.

13 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc v động vật làm thuốc ở Việt Nam,

NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr.432-438

14 Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc t thả dược, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr 139-141

15 Phạm Kim Thoa (2017) Khóa luận “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa h c của cây Lá Diễn”, khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội

16.Nguyễn Văn Thu và Trần Hùng (2011), ược liệu h c, I, NXB Y học

17 Nguyễn Tiến Vững, Vũ Đức Lợi (2017), Một số hợp chất phân lập từ lá cây Gan Heo (Dicliptera chinensis (L.) Nees) Tạp ch ược h c, T

18 Abdullahi, S.M, Musa, A.M, Abdullahi, M.I, Sule M.Iand Sani, Y.M 2013 , Isolation of Lupeol from the Stem-bark of Lonchocarpus sericeus Papilionaceae , Scholars Academic Journal of Biosciences

19 hmad 1, Khan MR, Shah N , Khan R 2013 In vitro antioxidant potential of Dicliptera roxburghiana BMC Complement Altern Med, 13:140

20 Ankita Wal, Pranary Wal, A.K Rai, Kanwal raj (2010), Isolation and modification of pseudohybrid plant Lupeol , J.Pharm Sci & Res

21 Bibhu Prasad Sahu, Panchanan Gouda and Chakrapani Patnaik (2016), Pandanus Odaritissimus Linn Prasad Sahu, Panchanan Gouda and Chakrapani Patnaik (2016), Pandanus Odaritissimus Linn: Isolation of Stigmast-5, 22-dien-3-β-ol from ethanolic extra of stem bark and study of antimicrobial activity , Journal of Chemistry and chemical Sciences, Vol.6(6), 574-585

22 Charoenchai P, Vajrodaya S, Somprasong W, Mahidol C, Ruchirawat

S, Kittakoop P (2010), “Antiplasmodial, cytotoxic, radical scavenging and antioxidant activities of Thai plants in the family Acanthaceae ,

23 Eric J Dumdei, Julia Kubanek, John E Coleman, Jana Pika, Raymond

J Andersen, Jorge Rios Steiner and Jon Clardy (1997), New terpenoid metabolits from the skin extracts, an egg mass, and dietary sponges of the Northeastern Pacific dorid nudibranch Cadlina luteomarginata", Canadian Journal of Chemistry, 75 (6):773-789

24 Gao Ya, Zhong Mingli, Zhong Jialiang, Zhang Kefeng (2014) Oestrogenicity and effect on hepatic metabolism of the aqueous extract of the leaf mixture of Aloe buettneri, Dicliptera verticillata, Hibiscus macranthus and Justicia insularis , Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, 6, 953-956

25.Gao YT, Yang X , i TM 2006 , Studies on the chemical constituents in herbs of ethanolic extract from herbs of Dicliptera chinensis , Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 31(12), 985-987

26 Gao YT1, Yang X , i TM 2007 Dicliptercerebroside, a novel cerebroside from Dicliptera chinensis.” Journal of Asian Natural

27 Oka T, Fujimoto M, Nagaska R 2010 , ycloartenyl ferulate, a component of rice bran oil-derived gamma-oryzanol, attenuates mast cell degranulation , Phytomedicine, 17(2):152-6

28 P.S Jain, S ari 2010 , Isolation of lupeol, stigmatsterol and campesteron from petrolium ether extract of woody stem of Wrightia tinctoria , Asian Journal of plant Sciences, 9(3): 1-5

29 Rita Aquino, Isabella Behar, Francesco de Simone, Cosimo Pizza,Mario d'Agostino (1985), "Dioscin and Gracillin from Tamus communis", Journal of Natural Products, 48 (3): 502–502

30 Takhtajan A.L (1997), Diversity and Classification of Flowering Plants, Columbia University Press, New York, USA

31 Telefo PB1, Moundipa PF, Tchana AN, Tchouanguep Dzickotze C, Mbiapo FT 1998 , ffects of an aqueous extract of Aloe buettneri, Justicia insularis, Hibiscus macranthus, Dicliptera verticillata on some physiological and biochemical parameters of reproduction in immature female rats , J Ethnopharmacol, 63(3):193-200

The study by Telefo et al (2002) investigates the estrogenic properties and hepatic metabolic effects of an aqueous extract derived from a leaf mixture consisting of Aloe buettneri, Dicliptera verticillata, Hibiscus macranthus, and Justicia insularis Published in Fitoterapia, this research provides insights into the potential health benefits and biochemical interactions of these plant species.

33.Yasukawa K, Akihisa, Kimura Y 1998 , Inhibitory effect of cycloartenol ferulate, a component of rice bran, on tumor promotion in two-stage carcinogenesis in mouse skin , Biological & Pharmaceutical Bulletin, 21(10):1072-6

34.Zhang K, Gao Y, Zhong M, Xu Y, Li J, Chen Y, Duan X, Zhu H(2016), Hepatoprotective effects of Dicliptera chinensis polysaccharides on dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis rats and its underlying mechanism , Journal of Ethnopharmacol, 179, 38-44.