Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu bao gồm Phòng thí nghiệm bộ môn Ngoại Sản thuộc Khoa Thú y và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, cùng với các nông hộ tại huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội.
Đối tượng nghiên cứu
Bò sữa được nuôi tại các nông hộ thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội 3.2.2 Cao khô dược liệu Bồ công anh
Lá cây Bồ Công Anh (Lactuca indica L.) sau khi thu hoạch được rửa sạch nhiều lần dưới vòi nước, sau đó được sấy hoặc phơi khô ở nhiệt độ 40 độ C Sau khi khô, lá được nghiền thành bột mịn có kích thước nhỏ hơn 0,5mm Bột lá này được bảo quản trong túi nilong và đặt trong bình hút ẩm để đảm bảo chất lượng.
Bột dược liệu Bồ Công Anh được chiết xuất bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ 5g bột dược liệu/50ml dung môi, lắc đảo 2 lần mỗi ngày Sau 72 giờ, dịch chiết được lọc qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1, sau đó cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi Khi khối lượng bình cô quay không đổi, tiến hành cân để tính hiệu suất tách chiết Cao cô toàn phần được bảo quản trong tủ mát 4°C để thử nghiệm hoạt tính và khả năng ức chế vi khuẩn.
Vi khuẩn Staphylococus spp và Streptococus spp đã được phân lập từ dịch viêm tử cung của bò, với mẫu được cung cấp từ phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam (LAS – NN54; ISO 17025:2005).
- Nano bạc có nồng độ gốc 100 ppm, 90% các hạt nano bạc có kích thước
20 - 25 nm do bộ môn Sinh học khoa Công nghệ Sinh học cung cấp
3.2.5 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
Trong quá trình thí nghiệm, các thiết bị cần thiết bao gồm tủ sấy, lò vi sóng, tủ ấm nuôi vi khuẩn, tủ nuôi vi khuẩn lỏng lắc, cân phân tích, nồi hấp khử trùng autoclave, box cấy vô trùng, máy đo pH, máy ly tâm, máy đo quang phổ và máy cô quay chân không.
Một số dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm bao gồm bình ống nghiệm, pipet man, đĩa petri, ống nghiệm, eppendorf, đèn cồn, cốc thủy tinh, giá ống nghiệm, bình định mức và ống nghiệm.
Các dung môi chiết: axit acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, ethanol 96%, nước cất, aceton nitril 50%, aceton nitril 100%
Dung môi pha chất tan: Dimethyl sulphoxit (DMSO)
Các hóa chất định tính một số thành phần hóa học trong dịch chiết
+ Môi trường Luria–Bertani (LB) dạng lỏng, được hấp tiệt trùng trong các bình tam giác
+ Môi trường LB rắn, được hấp tiệt trùng để nguội tới 40 0 - 50 0 C, đổ vào đĩa petri có đường kính 10 cm, với độ dày là 4 ± 0,2 mm.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa ở một số địa phương thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội
- Phân lập và giám định thành phần vi khuẩn trong dịch tử cung của bò sữa
- Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau
Nghiên cứu này đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết từ các dung môi khác nhau đối với vi khuẩn được phân lập từ dịch viêm tử cung ở bò Kết quả cho thấy hiệu quả kháng khuẩn của các chiết xuất này, mở ra hướng đi mới trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm ở gia súc Việc lựa chọn dung môi phù hợp có thể tối ưu hóa khả năng ức chế vi khuẩn, góp phần nâng cao sức khỏe và năng suất cho đàn bò.
- Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn Streptococcus spp và Staphylococcus spp của Nano bạc
- Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro khi phối hợp nano bạc và cao dịch chiết Bồ Công Anh
Khảo sát tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung được thực hiện tại 03 xã thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội, nhằm kiểm tra tình trạng viêm tử cung ở bò sữa.
Lấy mẫu dịch viêm tử cung ở bò sữa được thực hiện tại các nông hộ ở 03 xã thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội, và các mẫu này sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm của Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam để phân tích.
Xác định vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung ở bò được thực hiện qua phương pháp phân lập vi khuẩn, theo nghiên cứu của Nguyễn Như Thanh và Nguyễn Bá Hiên (2001) Quá trình này bao gồm việc nuôi cấy các mẫu dịch cần chẩn đoán trên các môi trường thông thường và môi trường đặc biệt để xác định các đặc tính nuôi cấy và sinh vật hoá học của từng loại vi khuẩn Đối chứng được sử dụng là các mẫu dịch tử cung từ bò khỏe mạnh trong cùng đàn.
Để pha dịch chiết với nồng độ 100mg/ml, bạn cần lấy 1g cao cô toàn phần và pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sử dụng đũa thủy tinh để khuấy đều cho đến khi dung dịch hoàn toàn hòa tan, bạn sẽ thu được dung dịch có nồng độ 100mg/ml.
Nuôi cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus và Streptococcus spp được thực hiện bằng cách cấy vạch trên môi trường LB đặc trong đĩa petri và ủ ở 37°C trong 24 giờ để chọn khuẩn lạc đơn điển hình Sau đó, khuẩn lạc đơn được chuyển vào bình tam giác chứa môi trường LB lỏng, ủ ở 37°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14 giờ Cuối cùng, thu dịch khuẩn với mật độ vi khuẩn đạt chuẩn 10^8 tế bào/ml.
Mật độ vi khuẩn được xác định sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng λ= 600nm Để kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết, phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch Kirby-Bauer được áp dụng.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Khi mật độ vi khuẩn đạt
Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên chuẩn bị 10^8 tế bào/ml và lắc đều bình chứa vi khuẩn Sử dụng pipetman hút 100µl vi khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, sau đó dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô Sau 15 phút, đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm, cách nhau khoảng 30mm Tại mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, rồi đặt đĩa vào tủ ấm ở 37°C trong 24 giờ Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và tính số bình quân.
Để pha loãng các nồng độ cao, chuẩn bị 10 ống nghiệm sạch và vô trùng, mỗi ống chứa 5 ml DMSO, đánh số từ 1 đến 10 Thêm 5 ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100 mg/ml vào ống nghiệm 1, trộn đều Sau đó, hút 5 ml từ ống nghiệm 1 chuyển sang ống nghiệm 2 và trộn đều Tiếp tục chuyển 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều, và lặp lại quy trình này cho đến ống nghiệm thứ 10, sau đó bỏ đi 5 ml.
Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết thực vật Định tính saponin trong thực vật
Tính tạo bọt là đặc trưng quan trọng của saponin, và hiện tượng này được sử dụng để định tính sự hiện diện của saponin trong dịch chiết.
Để quan sát hiện tượng tạo bọt, cho vào ống nghiệm lớn 5 g dịch chiết từ mẫu thực vật, thêm 5 ml nước và lắc mạnh trong 5 phút Sau đó, để yên và theo dõi sự hình thành bọt Nếu bọt vẫn bền vững sau 15 phút, có thể kết luận sơ bộ rằng thực vật chứa saponin.
Để kiểm tra phản ứng với kiềm, nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc và hơ khô Sau đó, đặt giấy lên miệng lọ amoniac đặc đã mở nút, bạn sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết tăng lên rõ rệt Nhỏ thêm một giọt khác để làm chứng cho kết quả.
- Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Sẽ xuất hiện tủa xanh đen
- Tác dụng với dung dịch FeCl3 5%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% sẽ thấy kết tủa xanh đen
- Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng
3.3.3 Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
- Tác dụng với thuốc thử Mayer (100ml nước cất, 1.36g HgCl2, 5g KI): Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 -
3 giọt thuốc thử Mayer, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng
Thuốc thử Bouchardat, gồm 100ml nước, 2.5g I2 và 5g KI, được sử dụng để phát hiện alkaloid trong dịch chiết Khi thêm 2-3 giọt thuốc thử vào 1ml dịch chiết trong ống nghiệm, nếu có sự hiện diện của alkaloid, sẽ xuất hiện tủa màu nâu đến đỏ nâu.
Thêm vào dịch chiết vài giọt H 2 SO 4 đậm đặc Nếu có carotenoid, dung dịch có màu xanh dương
Để kiểm tra sự hiện diện của Polyphenol, cho vào mỗi ống nghiệm 1 mẫu cao khô của từng loại dịch chiết, sau đó thêm 2ml nước cất và khuấy đều Tiếp theo, nhỏ vào mỗi ống 1ml dung dịch FeCl 3 2% và lắc đều Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh đen, điều này chứng tỏ có sự hiện diện của Polyphenol.
Cho một ít cao khô của mỗi loại dịch chiết vào từng ống nghiệm Thêm 2 ml nước cất vào mỗi ống, sau đó khuấy đều để hòa tan Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào mỗi ống; nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch, điều này chứng tỏ có sự hiện diện của đường khử.
Tác dụng với chì acetat 10%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% sẽ xuất hiện tủa bông
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn invitro của nano bạc
* Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các đĩa thạch Meuller-hinton có nồng độ nano bạc khác nhau
Mật độ vi khuẩn đem cấy trộn là 10 8 tế bào/ml
Nồng độ dung dịch nano đem cấy trộn là 100 ppm (nồng độ gốc)
Pha loãng nano theo dãy pha loãng đã nêu, sử dụng nước đề ion để pha loãng nano, và bổ sung vào mỗi ống 10 µl dịch khuẩn Sau đó, tiến hành đo lường các dịch khuẩn trong các nồng độ nano ở các thời điểm 2h, 4h và 8h.
Sử dụng 1 ống làm đối chứng không bổ sung nano
Trong nghiên cứu của Carvahol và cộng sự (2011), phương pháp khuyếch tán trên thạch được sử dụng để thử nghiệm khả năng ức chế vi khuẩn của nano bạc Sau thời gian 2h, 4h và 8h, 100µl nano bạc ở các nồng độ khác nhau đã được pha loãng và bổ sung dịch khuẩn cấy trên đĩa thạch để quan sát hiệu quả ức chế vi khuẩn.
Nuôi tủ ấm 30 0 /24 giờ, lấy ra đọc kết quả: Xác định nồng độ nano pha loãng thấp nhất còn có khả năng ức chế vi khuẩn.
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết thực vật khi phối trộn với nano bạc
Phối trộn dịch chiết thực vật với nano bạc bằng cách hút 5ml dịch chiết ở các nồng độ khác nhau vào ống nghiệm, sau đó thêm 5ml nano bạc ở nồng độ ức chế tối thiểu vào từng ống nghiệm và lắc đều.
Hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc được áp dụng lên các lỗ thạch trong đĩa môi trường đã được chang khuẩn Sau 24 giờ ủ ở nhiệt độ 37°C, đường kính vòng vô khuẩn được đo để đánh giá khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp này Phương pháp xử lý số liệu sẽ được áp dụng để phân tích kết quả.
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007.