Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Ngoại Sản thuộc Khoa Thú y và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật của Khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, cùng với các nông hộ tại huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội.
Đối tượng nghiên cứu
Bò sữa được nuôi tại các nông hộ thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội.
3.2.2 Cao khô dược liệu Bồ công anh
Lá cây Bồ Công Anh (Lactuca indica L.) sau khi thu hoạch được rửa sạch từ 2-3 lần dưới vòi nước, sau đó được sấy hoặc phơi khô ở nhiệt độ 40 độ C Sau khi khô, lá được nghiền thành bột mịn với kích thước nhỏ hơn 0,5mm và bảo quản trong túi nilong ở bình hút ẩm để giữ được chất lượng.
Bột dược liệu Bồ Công Anh được chiết xuất bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ 5g bột dược liệu trên 50ml dung môi, lắc đảo hai lần mỗi ngày Sau 72 giờ, dịch chiết được lọc qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1, sau đó cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi Khi khối lượng bình cô quay không đổi, tiến hành cân để tính hiệu suất tách chiết Cao cô toàn phần được bảo quản trong tủ mát 4°C để kiểm tra hoạt tính và khả năng ức chế vi khuẩn.
Vi khuẩn Staphylococcus spp và Streptococcus spp đã được phân lập từ dịch viêm tử cung của bò, với mẫu được cung cấp từ phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ Sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam (LAS – NN54; ISO 17025:2005).
- Nano bạc có nồng độ gốc 100 ppm, 90% các hạt nano bạc có kích thước 20 - 25 nm do bộ môn Sinh học khoa Công nghệ Sinh học cung cấp.
3.2.5 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
Trong quá trình thí nghiệm, các thiết bị cần thiết bao gồm tủ sấy, lò vi sóng, tủ ấm nuôi vi khuẩn, tủ nuôi vi khuẩn lỏng lắc, cân phân tích, nồi hấp khử trùng autoclave, box cấy vô trùng, máy đo pH, máy ly tâm, máy đo quang phổ và máy cô quay chân không.
Để thực hiện các thí nghiệm trong phòng lab, bạn cần chuẩn bị một số dụng cụ thiết yếu như bình ống nghiệm, pipet man, đĩa petri, ống nghiệm, eppendorf, đèn cồn, cốc thủy tinh, giá ống nghiệm, và bình định mức Những dụng cụ này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo quy trình thí nghiệm diễn ra suôn sẻ và chính xác.
Các dung môi chiết: axit acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, ethanol 96%, nước cất, aceton nitril 50%, aceton nitril 100%
Dung môi pha chất tan: Dimethyl sulphoxit (DMSO)
Các hóa chất định tính một số thành phần hóa học trong dịch chiết.
+ Môi trường Luria–Bertani (LB) dạng lỏng, được hấp tiệt trùng trong các bình tam giác
+ Môi trường LB rắn, được hấp tiệt trùng để nguội tới 40 0 - 50 0 C, đổ vào đĩa petri có đường kính 10 cm, với độ dày là 4 ± 0,2 mm.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa ở một số địa phương thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội
- Phân lập và giám định thành phần vi khuẩn trong dịch tử cung của bò sữa.
- Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau
Nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết trong các dung môi khác nhau đối với vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò Kết quả cho thấy các dung môi khác nhau có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả ức chế vi khuẩn, mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc điều trị viêm tử cung ở bò Việc xác định các phương pháp chiết xuất tối ưu sẽ giúp nâng cao hiệu quả kháng khuẩn và ứng dụng trong thực tiễn chăn nuôi.
- Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn Streptococcus spp và Staphylococcus spp của Nano bạc
- Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro khi phối hợp nano bạc và cao dịch chiết Bồ Công Anh
Khảo sát tỷ lệ bò sữa mắc bệnh viêm tử cung được thực hiện tại ba xã thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội nhằm đánh giá tình trạng sức khỏe của đàn bò và tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh.
Lấy mẫu dịch viêm tử cung bò được thực hiện trên đàn bò sữa tại ba xã thuộc huyện Ba Vì, Hà Nội Các mẫu sữa sau đó được chuyển đến phòng thí nghiệm của Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam để phân tích.
Xác định vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung ở bò bằng phương pháp phân lập vi khuẩn là một quy trình quan trọng Việc phân lập được thực hiện theo phương pháp thông thường, như đã được nghiên cứu bởi Nguyễn Như Thanh và Nguyễn Bá Hiên (2001) Các dịch cần chẩn đoán được nuôi cấy trong môi trường thông thường và môi trường đặc biệt để xác định các đặc tính nuôi cấy cũng như đặc tính sinh vật hoá học của từng loại vi khuẩn Để đảm bảo độ chính xác, mẫu dịch tử cung của bò khoẻ mạnh trong cùng đàn được sử dụng làm đối chứng.
Để pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml, bạn cần lấy 1g cao cô toàn phần và hòa tan trong 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sử dụng đũa thủy tinh để khuấy đều cho đến khi dung dịch hoàn toàn hòa tan, từ đó bạn sẽ có được dung dịch với nồng độ 100mg/ml.
Nuôi cấy vi khuẩn Staphylococus aureus và Streptococus spp trên môi trường rắn và lỏng: Vi khuẩn được cấy vạch trong môi trường
Để nuôi cấy vi khuẩn, đầu tiên, cần chuẩn bị môi trường LB đặc và ủ trong đĩa petri ở 37°C trong 24 giờ Sau đó, chọn khuẩn lạc đơn điển hình và chuyển chúng vào bình tam giác chứa môi trường LB lỏng Tiến hành ủ ở 37°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong khoảng 12 - 14 giờ Cuối cùng, thu dịch khuẩn với mật độ vi khuẩn đạt chuẩn 10^8 tế bào/ml.
Xác định mật độ vi khuẩn: Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường
LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở λ= 600ɳm.
+ Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Khi mật độ vi khuẩn đạt
Để tiến hành thí nghiệm, trước tiên cần chuẩn bị một dung dịch vi khuẩn với nồng độ 10^8 tế bào/ml Lắc đều bình chứa vi khuẩn và sử dụng pipetman để hút 100 µl vi khuẩn vào giữa đĩa thạch Dùng que thủy tinh trải đều vi khuẩn cho đến khi mặt thạch khô Sau 15 phút, tạo lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm, cách nhau khoảng 30mm Tại mỗi lỗ thạch, nhỏ 100 µl dịch chiết và đặt đĩa vào tủ ấm ở 37°C trong 24 giờ Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và tính số bình quân.
Để pha loãng các nồng độ cao, chuẩn bị 10 ống nghiệm sạch và vô trùng, mỗi ống chứa 5 ml DMSO, đánh số từ 1 đến 10 Thêm 5 ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100 mg/ml vào ống nghiệm 1 và trộn đều Sau đó, hút 5 ml từ ống nghiệm 1 chuyển sang ống nghiệm 2 và trộn đều Tiếp tục chuyển 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3 và trộn đều, lặp lại quy trình này cho đến ống nghiệm thứ 10, sau đó bỏ đi 5 ml.
Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết thực vật Định tính saponin trong thực vật
Tính tạo bọt là đặc điểm nổi bật của saponin, và hiện tượng này được sử dụng để xác định sự hiện diện của saponin trong dịch chiết.
Để quan sát hiện tượng tạo bọt, cho 5 g dịch chiết từ mẫu thực vật vào ống nghiệm lớn, thêm 5 ml nước và lắc mạnh trong 5 phút Sau đó, để yên ống nghiệm và theo dõi hiện tượng tạo bọt Nếu bọt vẫn bền vững sau 15 phút, có thể sơ bộ kết luận rằng thực vật chứa saponin.
Để kiểm tra phản ứng với kiềm, nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc và hơ khô Sau đó, đặt giấy lên miệng lọ amoniac đặc đã mở nắp, bạn sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết tăng lên Nhỏ thêm một giọt khác để làm chứng cho phản ứng.
- Phản ứng với FeCl 3 : Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl 3 5% Sẽ xuất hiện tủa xanh đen
- Tác dụng với dung dịch FeCl 3 5%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl 3 5% sẽ thấy kết tủa xanh đen
- Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng
3.3.3 Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
- Tác dụng với thuốc thử Mayer (100ml nước cất, 1.36g HgCl 2 , 5g KI): Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 -
3 giọt thuốc thử Mayer, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng.
Khi sử dụng thuốc thử Bouchardat (bao gồm 100ml nước, 2.5g I2 và 2.5g KI), lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat vào Nếu có sự hiện diện của alkaloid, sẽ xuất hiện tủa màu nâu đến đỏ nâu.
Thêm vào dịch chiết vài giọt H 2 SO 4 đậm đặc Nếu có carotenoid, dung dịch có màu xanh dương
Cho vào mỗi ống nghiệm 1 mẫu cao khô mỗi loại dịch chiết, thêm
2ml nước cất và hòa tan đều Nhỏ vào mỗi ống 1ml FeCl 3 2%, lắc đều Dung dịch chuyển sang màu xanh đen chứng tỏ có Polyphenol
Cho vào mỗi ống nghiệm một ít cao khô mỗi loại dịch chiết Cho
Để thực hiện thí nghiệm, cho 2 ml nước cất vào mỗi ống nghiệm và hòa tan, lắc đều Sau đó, nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào mỗi ống; nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch, điều này chứng tỏ có sự hiện diện của đường khử Tiến hành định tính chất nhầy.
Tác dụng với chì acetat 10%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% sẽ xuất hiện tủa bông
Dựa vào độ tan khác nhau khi đóng và mở vòng lacton, tiến hành thí nghiệm bằng cách cho vào ống nghiệm mỗi ống 1-2 ml dịch chiết Thêm 0.5 ml NaOH 10% vào ống thứ nhất và đun cách thủy cả hai ống; ống có coumarin thường xuất hiện màu vàng Sau khi để nguội, thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất Nếu ống 1 đục hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa mà độ đục hoặc kết tủa giống như ống 2, thì có thể sơ bộ xác định sự hiện diện của coumarin.
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn invitro của nano bạc
* Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các đĩa thạch Meuller-hinton có nồng độ nano bạc khác nhau
Mật độ vi khuẩn đem cấy trộn là 10 8 tế bào/ml
Nồng độ dung dịch nano được sử dụng là 100 ppm, và để pha loãng, cần sử dụng nước đề ion theo dãy pha loãng đã chỉ định Mỗi ống sẽ được bổ sung 10 µl dịch khuẩn, sau đó ngâm các dịch khuẩn trong các nồng độ nano trong khoảng thời gian 2 giờ, 4 giờ và 8 giờ.
Sử dụng 1 ống làm đối chứng không bổ sung nano
Trong nghiên cứu của Carvahol và cộng sự (2011), phương pháp khuyếch tán trên thạch được áp dụng để thử nghiệm khả năng ức chế vi khuẩn của nano bạc Sau thời gian 2h, 4h và 8h, 100µl nano bạc ở các nồng độ khác nhau được bổ sung vào dịch khuẩn cấy trên đĩa thạch nhằm quan sát hiệu quả ức chế vi khuẩn.
Nuôi tủ ấm 30 0 /24 giờ, lấy ra đọc kết quả: Xác định nồng độ nano pha loãng thấp nhất còn có khả năng ức chế vi khuẩn.
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết thực vật khi phối trộn với nano bạc
Phối trộn dịch chiết thực vật với nano bạc bằng cách lấy 5ml dịch chiết ở các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 5ml nano bạc ở nồng độ ức chế tối thiểu vào từng ống nghiệm và lắc đều để đảm bảo sự hòa trộn.
Hỳt 100àl hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc lên các lỗ thạch trong đĩa môi trường đã được chang khuẩn Sau 24 giờ ủ ở điều kiện 37°C, tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn để đánh giá khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp này.
Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007.