HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THÚY “NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN IN VITRO VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM TỬ CUNG BÒ CỦA NANO BẠC VÀ DỊCH CHIẾT CÂY BỒ CÔNG ANH LACTUCA INDICA L.” Ngành: Thú Y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thanh Hải PGS.TS Nguyễn Văn Thanh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn, tài liệu tham khảo rõ nguồn gốc danh mục tài liệu tham khảo luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thúy i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nỗ lực thực thân, nhận giúp đỡ, bảo tận tình thầy cô giáo Khoa Thú y, Khoa Công nghệ Sinh học, Ban quản lý đào tạo - Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Thanh PGS.TS Ngyễn Thanh Hải tận tình giúp đỡ, bảo hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn quan tâm ban lãnh đạo, thầy cô giáo môn Ngoại Sản - Khoa Thú y, môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học; tập thể cán bộ, kỹ thuật viên phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Sinh học Thú y tạo điều kiện giúp đỡ trình thực đề tài nghiên cứu Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, người ln tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thúy ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ảnh viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Bệnh viêm tử cung trâu bị chẩn đốn bệnh .4 2.1.1 Viêm tử cung 2.1.1.1 Viêm nội mạc tử cung (Endometritis) 2.1.1.2 Viêm tử cung (Myomestritis Puerperalis) 2.1.1.3 Viêm tương mạc tử cung (Perimestritis Puerperalis) 2.1.2 Viêm cổ tử cung (Cervitis) 2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm tử cung bò sữa 2.2.1 Mùa vụ .7 2.2.2 Vệ sinh thú y 2.2.3 Phương pháp phối giống 2.2.4 Quá trình đẻ 2.3 Hiện tượng kháng thuốc vi khuẩn tồn dư kháng sinh sản phẩm chăn nuôi 2.3.1 Hiện tượng kháng thuốc vi khuẩn .8 2.3.2 Tồn dư kháng sinh sản phẩm chăn nuôi .11 2.4 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm tử cung giới Việt Nam .13 2.4.1 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm tử cung giới 13 2.4.2 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm tử cung Việt Nam 14 iii 2.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng sản phẩm thảo dược giới Việt Nam 15 2.5.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng sản phẩm thảo dược giới .15 2.5.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng sản phẩm thảo dược Việt Nam .16 2.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng thảo dược điều trị bệnh viêm tử cung .19 2.6 Dược liệu Bồ Công Anh 21 2.6.1 Nguồn gốc phân loại 21 2.6.2 Mô tả thực vật 22 2.6.3 Phân bố, thu hái bào chế 22 2.6.4 Thành phần hóa học .23 2.6.5 Tác dụng dược lý 23 2.7 Nano bạc ứng dụng nhân y thú y 24 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 30 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 30 3.2 Đối tượng nghiên cứu 30 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 30 3.2.2 Cao khô dược liệu Bồ công anh 30 3.2.3 Vi khuẩn nghiên cứu 30 3.2.4 Nano bạc 30 3.2.5 Thiết bị, dụng cụ hóa chất thí nghiệm .31 3.2.5.1 Thiết bị, dụng cụ 31 3.2.5.2 Hóa chất - môi trường 31 3.3 Nội dung nghiên cứu 31 3.3.1 Định tính flavonoid 33 3.3.2 Định tính tanin .33 3.3.3 Định tính alkaloid thuốc thử chung .33 3.3.4 Định tính carotenoid 34 3.3.5 Định tính polyphenol .34 3.3.6 Định tính đường khử 34 3.3.7 Định tính chất nhầy 34 3.3.8 Định tính coumarin 34 3.4 Phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn invitro nano bạc 34 3.5 Phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn in vitro dịch chiết thực vật phối trộn với nano bạc .35 iv Phần Kết thảo luận 36 4.1 Tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung bò sữa cố địa phương thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội 36 4.2 Kết phân lập giám định thành phần vi khuẩn dịch tử cung bò sữa .37 4.2.1 Kết xác định biến đổi tổng số vi khuẩn hiếu khí có dịch tử cung bò sữa .38 4.2.2 Kết xác định biến đổi thành phần vi khuẩn hiếu khí có dịch viêm tử cung bò sữa 39 4.3 Đánh giá hiệu suất định tính nhóm chất cao khơ dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng dung môi tách chiết khác .41 4.3.1 Hiệu suất tách chiết cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng dung môi tách chiết khác .41 4.3.2 Định tính xác định số nhóm hoạt chất hịa tan cao khơ dịch chiết Bồ Cơng Anh .44 4.4 Đánh giá khả ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết dung môi khác với vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò .48 4.4.1 Khả ức chế in vitro cao khô dịch chiết sử dụng dung môi khác vi khuẩn Staphylococcus spp phân lập từ dịch viêm tử cung bò 48 4.4.2 Khả ức chế in vitro cao khô dịch chiết sử dụng dung môi khác vi khuẩn Streptococcus spp phân lập từ dịch viêm tử cung bò 51 4.4.3 Khả ức chế in vitro cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethyl acetate vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò pha loãng 54 4.5 Đánh giá khả ức chế vi khuẩn Streptococcus spp Staphylococcus spp nano bạc 57 4.6 Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro phối hợp nano bạc cao dịch chiết Bồ Công Anh 59 Phần Kết luận kiến nghị 65 5.1 Kết luận 65 5.2 Kiến nghị 66 Tài liệu tham khảo 67 Tài liệu tiếng Việt 67 Tài liệu tiếng Anh 70 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt CFU Colony Forming Units DC Dịch chiết DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) DMSO Dimethyl sulphoxit ĐV Động vật NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) LB Luria–Bertani PƯ Phản ứng VTC Viêm tử cung VHHK Vi khuẩn hiếu khí VK Vi khuẩn NSP Nanosilver pratices HIV Human Immuno-deficiency Virus vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Tỷ lệ bò sữa mắc bệnh VTC số xã thuộc huyện Ba Vì, HN 36 Bảng 4.2 Tổng số vi khuẩn hiếu khí có dịch tử cung bò 38 Bảng 4.3 Tần suất xuất số VKHK dịch tử cung 39 Vi khuẩn 39 Bảng 4.4 Hiệu suất tách chiết Bồ công anh loại dung môi khác 42 Bảng 4.5 Kết định tính sơ thành phần hóa học cao khơ dịch chiết Bồ công anh sử dụng dung môi khác .44 Bảng 4.6 Khả ức chế in vitro cao khô dịch chiết Bồ công anh sử dụng dung môi khác với vi khuẩn Staphylococcus spp 48 Bảng 4.7 Khả ức chế in vitro cao khô dịch chiết Bồ công anh sử dụng dung môi khác với vi khuẩn Streptococcus spp 52 Bảng 4.8 Khả ức chế vi khuẩn pha lỗng cao khơ dịch chiết dược liệu Bồ công anh 55 Bảng 4.9 Kết khảo sát hoạt tính diệt khuẩn in vitro dung dịch nano bạc vi khuẩn Streptococcus spp Staphylococcus spp .58 Bảng 4.10 Khả ức chế VK pha lỗng cao khơ dịch chiết dược liệu Bồ công anh (sử dụng dung môi ethanol 70%) phối hợp với nano bạc 60 Bảng 4.11 Kết thử nghiệm điều trị bò mắc bệnh viêm tử cung 62 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 4.1 Tỷ lệ bị sữa mắc bệnh VTC số xã thuộc huyện Ba Vì, Hà Nội 37 Hình 4.2 Dược liệu Bồ công anh bột 41 Hình 4.3 Hiệu suất tách chiết Bồ công anh loại dung môi khác .42 Hình 4.4 Phản ứng định tính xác định nhóm hoạt chất có cao dịch chiết Bồ công anh 47 Hình 4.5 Khả ức chế in vitro cao khô dịch chiết sử dụng dung môi khác với vi khuẩn Staphylococcus spp 49 Hình 4.6 Khả ức chế vi khuẩn Staphylococcus spp in vitro cao khô dịch chiết Bồ công anh .51 Hình 4.7 Khả ức chế in vitro cao khô dịch chiết Bồ công anh sử dụng dung môi khác với vi khuẩn Streptococcus spp 52 Hình 4.8 Khả ức chế VK Streptococcus spp in vitro cao khô dịch chiết Bồ công anh 54 Hình 4.9 Khả ức chế vi khuẩn in vitro pha lỗng cao khơ dịch chiết Bồ cơng anh 56 Hình 4.10 Tác dụng ức chế VK in vitro Nano bạc pha loãng 58 Hình 4.11 So sánh khả ức chế vi khuẩn in vitro cao dịch chiết Bồ cơng anh, có khơng bổ sung nano bạc 60 Hình 4.12 Kết điều trị thử nghiệm bò mắc bệnh VTC 63 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Thúy Tên luận văn: “Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro ứng dụng điều trị bệnh viêm tử cung bị nano bạc dịch chiết Bồ Cơng Anh Lactuca indica L.” Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Phân lập đánh giá tỷ lệ lồi vi khuẩn có dịch tử cung bò Đánh giá khả ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng dung môi khác nano bạc vi khuẩn Staphylococus spp Streptococus spp phân lập từ dịch viêm tử cung bị Thử nghiệm hiệu điều trị cao khơ dịch chiết Bồ Công Anh nano bạc Phương pháp nghiên cứu Lấy mẫu dịch viêm tử cung bò Sau xác định vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung bò phương pháp phân lập vi khuẩn Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn dịch chiết phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán đĩa thạch Kirby-Bauer Pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml Phối trộn dịch chiết với nano bạc nồng độ pha loãng khác cho vào ống nghiệm Hút 100µl hỗn hợp dịch chiết thực vật nano bạc nhỏ lên lỗ thạch đĩa môi trường chang khuẩn Sau ni ủ điều kiện 370C, sau 24h lấy đo đường kính vịng vơ khuẩn, đánh giá khả kháng khuẩn hỗn hợp dịch chiết thực vật nano bạc dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn Kết kết luận Nghiên cứu tiến hành nhằm đánh giá khả ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết dược liệu Bồ Công Anh 02 chủng vi khuẩn (Staphylococcus spp., Streptococcus spp.) phân lập từ dịch Viêm tử cung bò Kết nghiên cứu cho thấy hiệu suất tách chiết dược liệu Bồ Công Anh sử dụng 05 dung môi khác dao động lớn từ 7,2 % (dung môi methanol) đến 12,34% (dung môi n-hexan) Cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng dung mơi ethyl acetate có hoạt tính ức chế vi khuẩn tốt hai chủng vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung Nồng độ ức chế tối thiểu cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethyl acetate vi khuẩn Streptococcus spp 0,20 mg/ml, với vi khuẩn Staphylococcus spp 0,78 mg/ml ix Kết nghiên cứu (bảng 4.9, hình 4.10) cho thấy, dung dịch nano bạc sử dụng phương pháp trộn với dịch khuẩn trước cấy chang có tác dụng diệt khuẩn tức thời Khi nồng độ nano bạc giảm dần tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn giảm Ở nồng độ 100ppm mặt thạch sau 24 h nuôi cấy xuất < khuẩn lạc chứng tỏ nồng độ bạc nano có tác dụng diệt khuẩn Ở nồng độ nhỏ pha loãng thấy xuất mặt thạch nhiều khuẩn lạc Ở nồng độ 50 ppm tức pha lỗng lần số lượng khuẩn lạc quan sát thấy sai khác rõ ràng so với đối chứng chủng vi khuẩn thử nghiệm Ở nồng độ nhỏ hơn, bề mặt thạch xuất nhiều khuẩn lạc khơng cịn quan sát thấy sai khác rõ ràng so với đối chứng (hình 4.10) Bằng phương pháp trộn dịch khuẩn nano bạc trước cấy chang nồng độ nano bạc nhỏ quan sát thấy sai so với đối chứng 50 ppm 4.6 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN IN VITRO KHI PHỐI HỢP NANO BẠC VÀ CAO DỊCH CHIẾT BỒ CƠNG ANH Tính kháng khuẩn bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học ion Ag+ Ion có khả liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn ức chế khả vận chuyển oxy vào bên tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn Nếu ion bạc lấy khỏi tế bào sau đó, khả hoặt động vi khuẩn lại phục hồi Do lượng nano bạc sử dụng nên đơi xảy tượng phục hồi vi khuẩn Việc nano bạc có kích thước nhỏ có khả liên kết với thành tế bào, quan quan trọng vi khuẩn việc ngăn cản tác nhân bên xâm nhập để tiêu diệt vi khuẩn Dựa tính việc phối hợp nano bạc có chức phá thành bào vi khuẩn với tác nhân bên ngồi dịch chiết thực vật nano bạc làm tăng khả diệt khuẩn dịch chiết thực vật Dựa lý trên, thí nghiệm phối hợp nano bạc cao khô dịch chiết dược liệu Bồ công anh tiến hành Cao khô dịch chiết dùng cao khô dịch chiết Bồ công anh sử dụng dung mơi ethyl acetate để tiến hành thí nghiệm cao có tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro tốt kh pha loãng Nồng độ nano bạc sử dụng 25 ppm, nồng độ theo thí nghiệm khơng có ảnh hưởng tức thời đến sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn thí nghiệm 59 Bảng 4.10 Khả ức chế VK pha lỗng cao khơ dịch chiết dược liệu Bồ Công Anh (sử dụng dung môi ethanol 70%) phối hợp với nano bạc Tên vi khuẩn Sta Strep Hệ số pha lỗng cao khơ dịch chiết Bồ Cơng Anh (100mg/ml) 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Có/Khơng bổ ½ 1/4 1/8 sung nano bạc Nồng độ cao khô dịch chiết Bồ Công Anh, mg/ml Không 50 25 12,50 6,25 3,13 1,56 + + + + + 0,78 0,39 0,20 0,10 + + - - - Có + + + + + + + + + - Không + + + + + + + + + - Có + + + + + + + + + - Ghi chú: (+) : Có đường kính vịng vơ khuẩn (-) : Khơng có đường kính vịng vô khuẩn A B A Streptococcus spp B Staphylococcus spp Hình 4.11 So sánh khả ức chế vi khuẩn in vitro cao dịch chiết Bồ Cơng Anh, có không bổ sung nano bạc Ghi chú: A- không bổ sung nano bạc; B- bổ sung nano bạc Kết thí nghiệm bảng 4.10 hình 4.11 cho thấy, có bổ sung nano bạc vào dịch chiết dược liệu Bồ Công Anh làm tăng khả ức chế vi khuẩn in vitro cao dịch chiết Khi dịch chiết nồng độ cao, tác dụng nano bạc làm tăng khả ức chế dịch chiết chưa rõ ràng, dịch chiết nồng độ nhỏ hiệu tăng khả ức chế dịch chiết rõ Khi bổ sung nano bạc vào dịch chiết, khơng đường kính vịng vơ khuẩn tăng lên mà vịng vơ khuẩn rõ ràng sắc nét so với không bổ sung nano bạc Đặc biệt sử dụng riêng lẻ cao khô dịch chiết Bồ Công Anh, nồng độ 0,39mg/ml (tương đương pha lỗng 256 lần) khơng quan sát thấy vịng vơ 60 khuẩn vi khuẩn Staphylococcus spp Trong cao dịch chiết bổ sung nano bạc nồng độ 0,20 cịn quan sát thấy vịng vơ khuẩn Cịn nồng độ 0,10mg/ml (tương đương pha lỗng 1024 lần) khơng quan sát thấy vịng vơ khuẩn vi khuẩn Streptococcus spp 4.7 SỬ DỤNG CAO DỊCH CHIẾT BỒ CÔNG ANH KẾT HỢP VỚI NANO BẠC ĐỂ ĐIỀU TRỊ THỬ NGHIỆM BÒ BỊ VIÊM TỬ CUNG Để kiểm chứng hiệu thực tế dịch chiết Bồ Công Anh dung môi ethyl acetate tiến hành điều trị thử nghiệm bò bị viêm tử cung Căn hiệu suất chiết xuất Bồ Công Anh dung môi ethyl acetate dựa theo phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược liệu (Viện dược liệu, 2006), lựa chọn liều dùng điều trị thử nghiệm cho bò 10 mg/kg thể trọng Chúng lựa chọn phác đồ điều trị viêm tử cung thường bác sỹ thú y sử dụng làm đối chứng Chúng tiến hành thử nghiệm theo 03 phác đồ sau * Phác đồ 1: Thụt rửa tử cung dung dịch Rivanol 0,1% ngày lần, sau thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ngồi, dùng Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân ADE, B.complex Liệu trình điều trị khơng q ngày * Phác đồ 2: Thụt rửa tử cung dung dịch Rivanol 0,1% ngày lần, sau thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ngồi, dùng cao khơ dịch chiết Bồ cơng anh 10 mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân ADE, B.complex Liệu trình điều trị khơng q ngày * Phác đồ 3: Thụt rửa tử cung dung dịch Rivanol 0,1% ngày lần, sau thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ngồi, dùng cao khơ dịch chiết Bồ cơng anh 10 mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất bổ sung nano bạc đến nồng độ 25 ppm bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân ADE, B.complex Liệu trình điều trị khơng q ngày Thử nghiệm thực 27 bò mắc bệnh viêm nội mạc tử cung, kết trình bày bảng 4.11 biểu diễn hình 4.12 61 Bảng 4.11 Kết thử nghiệm điều trị bò mắc bệnh viêm tử cung Thời gian điều trị Phác đồ Số bò thử nghiệm ngày Tổng hợp Số khỏi Tỷ lệ (%) Số khỏi Tỷ lệ (%) Số khỏi Tỷ lệ (%) Tổng số khỏi Tỷ lệ (%) Thời gian điều trị TB (ngày) I 22,22 55,56 22,22 100 4,00 II 0 55,56 33,33 88,89 4,38 III 11,11 66,67 11,11 88,89 4,00 62 Qua bảng 4.11 chúng tơi nhận thấy, tổng số 27 bị định điều trị, bò điều trị theo phác đồ II III có bị khỏi bệnh, đạt tỷ lệ thấp 88,89%; phác đồ I điều trị cho bị có khỏi bệnh đạt 100% Tuy nhiên, thời gian điều trị trung bình phác đồ I III ngắn nhất, có 04 ngày; phác đồ II có thời gian điều trị trung bình dài 4,38 ngày Hình 4.12 Kết điều trị thử nghiệm bò mắc bệnh VTC Ở phác đồ I, sau ngày điều trị với kháng sinh thuốc bổ trợ sức có bị khỏi bệnh đạt 22,22% Tỷ lệ điều trị khỏi cao phác đồ đạt ngày thứ với 5/9 bò khỏi bệnh, đạt 55,56% Số bò khỏi bệnh ngày thứ bò đạt tỷ lệ 22,22% Số ngày điều trị trung bình ghi nhận 04 ngày Ở phác đồ II sử dụng cao khô dịch chiết Bồ Công Anh thuốc bổ trợ sức, ngày điều trị thứ không ghi nhận ca khỏi bệnh Tỷ lệ điều trị khỏi cao phác đồ đạt ngày thứ với 5/9 bò khỏi bệnh, đạt 55,56% Số bò khỏi bệnh ngày thứ bò đạt tỷ lệ 33,33% Số ngày điều trị trung bình ghi nhận phác đồ 4,38 ngày Tuy nhiên theo phác đồ điều trị cịn bị khơng khỏi sau điều trị ngày Phác đồ III điều trị sử dụng cao khô dịch chiết Bồ Cơng Anh có bổ sung nano bạc kết hợp thuốc bổ trợ sức ngày điều trị thứ có bị khỏi bệnh đạt 63 11,11% Tỷ lệ điều trị khỏi cao phác đồ đạt ngày thứ với 6/9 bò khỏi bệnh, đạt 66,67% Số bò khỏi bệnh ngày thứ 1bò đạt tỷ lệ 11,11% Số ngày điều trị trung bình ghi nhận phác đồ 04 ngày Tuy nhiên theo phác đồ điều trị cịn bị khơng khỏi sau điều trị ngày Theo chúng tơi có kết hoạt chất có cao dịch chiết Bồ Công Anh gây tác dụng ức chế tiêu diệt lên vi khuẩn chậm, từ từ thuốc kháng sinh nên phác đồ I ghi nhận số ca khỏi bệnh sớm điều trị phác đồ II III Khi so sánh kết điều trị phác đồ II phác đồ III nhận thấy nano có tác dụng tăng cường khả diệt khuẩn cao khô dịch chiết Bồ công anh, thời gian điều trị trung bình ngắn Kết phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Văn Thanh Nguyễn Thanh Hải (2014) sử dụng cao khô dịch chiết Huyền diệp điều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy cho chó Trong nghiên cứu cao khô dịch chiết Huyền diệp có khả điều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy chó, tác dụng chậm kháng sinh gentamycin Tương tự nghiên cứu Nguyễn Văn Thanh Nguyễn Thanh Hải (2014), khẳng định khả điều trị bệnh tiêu chảy lợn theo mẹ sử dụng cao khơ mị hoa trắng 64 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ thí nghiệm kết nghiên cứu rút số kết luận sau: Tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung 03 xã thuộc huyện Ba Vì, Hà Nội chiếm tỉ lệ bình qn 24,61% có chênh lệch xã biến đổi từ 20,95% (Tản Lĩnh) đến 30,40% (Yên Bài) Tổng số vi khuẩn hiếu khí có dịch viêm tử cung tăng lên gấp 122,26 lần so với dịch tử cung bị sữa khơng bị viêm (7,69±3,31)x10 CFU/ml so (6,29±2,90)x106 CFU/ml Vi khuẩn Staphylococcus spp Streptococcus spp xuất 100% mẫu dịch viêm tử cung bò Trong dịch tử cung bị khơng bị viêm, tỷ lệ mẫu phát thấy Staphylococcus spp Streptococcus spp 20,00% Hiệu suất tách chiết dược liệu Bồ Công Anh sử dụng dung môi khác dao động lớn biến đổi từ 7,2 % (dung môi methanol) đến 12,34% (dung môi n-hexan) Cao khô dược liệu Bồ Cơng Anh có chứa nhóm hoạt chất sau alkaloid, flavonoid, phytosterol, polyphenol, đường khử, saponin, tanin, chất béo chất nhầy Cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng dung mơi ethyl acetate có hoạt tính ức chế vi khuẩn tốt nhât hai chủng vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung Nồng độ ức chế tối thiểu cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethyl acetate vi khuẩn Streptococcus spp 0,20 mg/ml, với vi khuẩn Staphylococcus spp 0,78 mg/ml Nano bạc có khả ức chế in vitro 02 chủng vi khuẩn nghiên cứu Nồng độ nano bạc nhỏ quan sát thấy sai khác so với đối chứng khả ức chế vi khuẩn in vitro 50 ppm Bổ sung nano bạc vào cao khô dịch chiết Bồ công anh làm tăng khả ức chế vi khuẩn in vitro cao dịch chiết 65 Có thể sử dụng cao dịch chiết Bồ Cơng Anh kết hợp với nano bạc điều trị bệnh viêm tử cung bò cho tỷ lệ khỏi bệnh đạt 88,89% thời gian điều trị trung bình 04 ngày 5.2 KIẾN NGHỊ Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn in vitro cao dược liệu Bồ Công Anh tách chiết nhiều phương pháp khác để lựa chọn phương pháp tách chiết đem lại hiệu suất chất lượng cao Các nghiên cứu sau cần tiến hành phân tích sâu thành phần hóa học dịch chiết đánh giá vai trị hoạt tính kháng khuẩn thành phần hóa học Tiến hành thử nghiệm điều trị bệnh viêm tử cung bò sử dụng dịch chiết Bồ Công Anh nano bạc quy mô thử nghệm, từ đưa khuyến cáo góp phần điều chế chế phẩm có nguồn gốc thảo dược ứng dụng phòng trị bệnh viêm tử cung bò 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Văn Thanh Nguyễn Thanh Hải (2014), "Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro dịch chiết Mò hoa trắng (Clerodendron fragrans Vent.) vi khuẩn E coli, Salmonella spp phân lập từ phân lợn theo mẹ mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy thử nghiệm điều trị", Tạp chí Khoa học Phát triển 2014.12(5) tr 683-689 Báo cáo chuyên sâu ngành Sữa Việt Nam Quý 2/2016 (2017), truy cập ngày 02/05/2017, trang web http://viracresearch.com/vi/standardreport/vietnamdairy-comprehensive-report-q22016/ Đỗ Huy Bích (2006), Cây Thuốc Và Động Vật Làm Thuốc Ở Việt Nam, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Nguyễn Mạnh Hiển Bùi Thị Tho (2006), "Tác dụng chế phẩm dạng mỡ từ hạt củ đậu trị bệnh ghẻ ", Báo KHKT Thú y 13 (4).tr 60-63 Nguyễn Thượng Chánh (2004), Hiện tượng kháng kháng sinh, truy cập ngày 20/5/2017, trang web http://www.advite.com/hientuongkhangkhangsinh.htm Lê Thị Ngọc Diệp (1999), Tác dụng dược lý số ứng dụng dược liệu actiso chăn nuôi thú y, Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Thượng Dong (2006), Nghiên cứu phát triển dược liệu đông dược Việt Nam, Nxb Khoa học kỹ thuật Phạm Thị Dung (2015), Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro ứng dụng điều trị bệnh viêm tử cung chó dịch chiết Đơn đỏ, Đại học Nông nghiệp Hà Nôi Đậu Ngọc Hào (2016), Tồn dư kháng sinh vật nuôi nguy kháng kháng sinh, truy cập ngày 20/5/2017, trang web http://baodatviet.vn/dien-dan-trithuc/ton-du-khang-sinh-vat-nuoi-va-nguy-co-khang-khang-sinh-3310834/ 10 Khúc Huy Hoàng (2015), Nghiên cứu sử dụng dịch triết huyền diệp điều trị thử nghiệm bệnh viêm vú bò khu vực Gia Lâm – Hà Nộiv, Đạ học Nông nghiệp Hà Nội 11 Trần Quang Hùng (1995), Thuốc bảo vệ thực vật, Nhà xuất Nông nghiệp 67 12 Phạm Trung Kiên (2012), Nghiên cứu thực trạng bệnh viêm tử cung đàn bị sữa ni khu vực đồng sơng Hồng thử nghiệm biện pháp phịng, trị , Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội 13 Nguyễn Hồng Loan (2010), " Sử dụng chất chiết từ hoàng kỳ (Astragalus membranaceus) để phòng bệnh mủ gan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra" 14 Đỗ Tất Lợi (1991), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y Học 15 Nguyễn Thị Như Miên (2006), "Tổng hợp bạc kim loại kích thước nano phương pháp khử hố với chất khử fomandehit.", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN.22(3A PT) 16 Nguyễn Hữu Ninh Bạch Đăng Phong (1994), Giáo trình bệnh sinh sản gia súc, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 17 Nguyễn Phương (2016), Cảnh báo lạm dụng kháng sinh chăn nuôi, truy cập ngày 20/5/2017, trang web http://biospring.com.vn/tin-tuc/canh-bao-lamdung-khang-sinh-trong-chan-nuoi.html 18 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2001), Vi sinh vật Thú Y, NXB Nông nghiệp Hà Nội 19 Nguyễn Văn Thanh (1996), Một số tiêu sinh sản thử nghiệm số biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao suất sinh sản đàn trâu nội số địa phương phía bắc Việt Nam, Trường Đại học Nơng nghiệp I-Hà Nội 20 Nguyễn Văn Thanh (1999), Một số tiêu sinh sản bệnh đường sinh dục thường gặp đàn trâu tỉnh phía bắc Việt Nam , Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội 21 Nguyễn Văn Thanh, Trần Tiến Dũng Dương Đình Long (2002), Giáo trình sinh sản gia súc, Nxb nông nghiệp 22 Nguyễn Văn Thanh cộng (2016), Giáo trình bệnh sinh sản gia súc, Nxb Đại Học Nông nghiệp 23 Nguyễn Văn Thanh Nguyễn Thanh Hải (2016), "Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất chiết tác dụng diệt khuẩn in vitro cao khô dịch chiết đơn đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.) với vi khuẩn Staphylococcus spp Streptococcus spp phân lập từ dịch viêm tử cung bò", TC Nông nghiệp Phát triển nông thôn – Kỳ – Tháng 3/2016 24 Nguyễn Văn Thanh Lê Trần Tiến (2007), "Khảo sát tỷ lệ mắc thử nghiệm điều trị bệnh viêm tử cung đàn bò sữa nuôi số địa phương ngoại thành 68 Hà Nội Bắc Ninh", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Hội Thú y Việt Nam 9(1).tr 50 - 54 25 Trần Danh Thế, Vũ Văn Độ Ngô Kế Sương (2010), "Bước đầu trồng thử nghiệm tách chiết hoạt chất miraculin Thần kỳ (Synsepalum dulcificum Daniell).", Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ.13(1T).tr 48 – 53 26 Nguyễn Trọng Thiện (2009), Nghiên cứu xác định số tiêu sinh sản, bệnh quan sinh dục thử nghiệm điều trị bệnh viêm tử cung bị sinh sản ni huyện Lập Thạch, tỉnh Vĩnh Phúc., Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội 27 Bùi Thị Tho (1996), Nghiên cứu tác dụng số thuốc hóa học trị liệu phytocid E.coli phân lập từ bệnh lợn phân trắng, Đại học Nông nghiệp Hà Nội 28 Bùi Thị Tho (2001), "Sự kháng thuốc E coli phytoncid tỏi, hẹ mật động vật so với số kháng sinh.", Tạp chí dược liêu.5(6).tr 147-152 29 Bùi Thị Tho (2003), "Thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng chăn nuôi", NXB Hà Nội 30 Bùi Thị Tho (2004), " Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian điều kiện bảo quản đến tác dụng dược lý dịch chiết củ Bách Bộ ", Báo KHKT Thú 11 (1).tr 52-55 31 Bùi Thị Tho Nguyễn Thị Thanh Hà (2009), Giáo trình dược liệu thú y 32 Bùi Thị Tho Nguyễn Thành Trung (2010), "Khảo sát tác dụng Xuân Hoa ((Pseuderanthemum palatiferum) điều trị bệnh tiêu chảy lợn con", Chi hội Thú y – Đại học Nông nghiệp Hà Nội 33 Lê Trần Tiến (2006), Nghiên cứu biến đổi số tiêu lâm sàng, phi lâm sàng, vi khuẩn học thử nghiệm điều trị bệnh viêm tử cung , Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội 34 Đặng Đình Tín (1985), Giáo trình sản khoa bệnh sản khoa thú y Nxb ĐHNNI- Hà Nội 35 Dương Quốc Tuấn (2013), Khảo sát số tiêu sinh sản bệnh thường gặp quan sinh dục đàn bị vàng ni số địa phương thuộc huyện Sông Lô tỉnh Vĩnh Phúc , Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội 36 Nguyễn Văn Tý (2002), Nghiên cứu tác dụng dược lý số dược liệu Việt Nam: Thuốc lào, bách bộ, hạt na ngoại ký sinh trùng thú y Ứng dụng điều trị thử nghiệm động vật nuôi, Đại học Nông nghiệp Hà Nội 69 Tài liệu tiếng Anh: 37 Chuffaux S.Y et al (1987), "Biopsies de l’endometre au cours dupost – partum pathologique chezlavache", Rec Med Vet, 163, pp 199 – 209 37 38 Settergreen (1986), "Some infertility problems in dairy cattle Uppsala Sweden", Technical Management A.I Programmes Swedish University of Agricutural Sciences 39 Black W.G (1983), "Inflammatory response of the bovine endometrium", Am Jour Vet Res 14: 179 40 Krishnamurthi A (1987), "The wealth of India Publication and information ", Directorate New Delhi,1987, 187 -188 41 Marquez A., Gonzalez M and Bonges H (2007), " Effects of intrauterine administration Montanoa tomentosa ectracts upon postpartum metritis in dairy cows ", AJOL 3.1 42 Samad A et al (1987), "Clinicalincidence of reproduction disoder in the buffaloes", Pakistan 91– Veterinary – Jounal 7; 8th, tr 16 – 19; 43 Sadeghi B, Garmaroudi FS and Hashemi M (2012), "Comparison of the antibacterial activity on the nanosilver shapes: nanoparticles, nanorods and nanoplates ", Adv Powder Technol 2012;23(1):22–26 44 Cui D et al (2013), "The antifungal activity of graphene oxide-silver nanocomposites", Biomaterials 2013;34:3882–3890 45 D Duricic, M Lipar and M Samardzija (2014), "Ozone treatment of metritis and endometritis in Holstein cows", Vet arhiv 84, 103-110 46 Ahmed F., Saxena M and Maini S (2014), "A herbal intrauterine infusion “Arasksha liquid” for treatment of reproductive disorders in cows", IJPRBS; Volume 3(2): 42-48 47 Bhat F.A., Bhattacharyya H.K and Hussain S.A (2014), "White side test: A simple and rapid test for evaluation of nonspecific bacterial genital infections of repeat breeding cattle.", Veterinary Research Forum, 5(3): 177 - 180 48 Dawson F.L.M (1983), "The microbial content and mophological character of the normal bovine uterus and oviduct", Agr Sci 40, tr 150 49 Athur G.H (1964), "Wrights Veterinary obsterics", The Williams and Wilkins Company 70 50 R.O Gilbert et al (2005), "Prevalence of endometritis and its effects on reproductive performance of dairy cows", Theriogenology, v.64, p.1879-1888 51 Nguyen Thanh Hai and Miyamoto Atsushi (2014), "Evaluation acaricidal efficacy of Camellia sasanqua thumb seed oil against the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus and the dog tick Rhipicephalus sanguineus ", International Journal of Medicinal Plants Research ISSN: 2169303X Vol (3), pp 284-289, 2014 52 Nguyen Thanh Hai et al (2014), "A study about anthelmintic effect of punica Gramatum Bark on veterinary endoparasites", Asian J Pharm Clin Res, 2014 Vol 7, Issue2, 148-152 53 Settergreen I (1986), "Investigation on infetious infertility diseases in bovine, especcialy vibriosis and trichomoniasis in Indian", Technical Management A.I Programmes, Swedish University of Agricutural Sciences Uppsala Sweden 54 Dubuc J et al (2011), "Effects of postpartum uterine diseases on milk production and culling in dairy cows.", Journal of Dairy Science 94, 1339-1346 55 Kopecky K.E., B Larsen and R.S Merkal (1977), "Uterine infection in bovine tuberculosis", Am J Vet Res 28, tr 1043 – 1045 56 K.R Kirtikar and B.D Basu (1993), "Indian Medicinal Plants" Vol 1-4 57 Kim KJ, Sung WS and Suh BK (2009), "Antifungal activity and mode of action of silver nano-particles on Candida albicans", Biometals 2009;22(2):235–242 58 Pimporn Leelapornpisid et al (2011), "StefaCaesalpenia sappan extract inhibits IL1 – mediated overexpression of matrix metalloproteinases in human chondrocytes", Gene and Nutrition Springer 59 Overton M and J Fetrow (2008), "Economics of postpartum uterine health In: Proceedings of Dairy Cattle Reproduction Council Convention", Omaha, Nebraska pp 39 - 43 60 Toufik Meziane et al (2013), "A clinical study of metritis in dairy cows in the region of Batna (east of Algeria) and their treatments using different therapeutic protocols", Original research 61 Ramakrishna NVS, Vijaya KEKS and Jain A K (2000), "Screening of natural Products for new leads as inhibitors", Indian J Chem.2000, 39: 801 – 802 71 62 Li P et al (2005), " Synergistic antibacterial effects of β-lactam antibiotic combined with silver nanoparticles.", Nanotechnology 2005;16(9):1912–1917 63 Rosakutty PJ and Roslin AS (2000), "Ethanobotany and Medicinal Plants of Indian Subcontinent", Scientific Publishers; 3:110-113 64 K W Pulfer and R L Riese (1991), "Treatment of Postpartum Metritis in Dairy Cows.", Iowa State University Veterinarian, 53(1): 27 - 31 65 Nair R, Kalariya T and Chanda S (2004), " Antibacterial activity of some selected plant from Khuzestan, Iran, as a potential source for discovery of new Indian medicinal flora", Turk J Biol.,2004, 29: 41 – 47 66 Dolezel R et al (2010), "Bacterial contamination of the uterus in cows with various clinical types of metritis and endometritis and use of hydrogen peroxide for intrauterine treatment.", Veterinary Medicine, 55(10): 504 - 511 67 K Raghunathan and M.K Mitra (2002), "Pharmacognosy of indigenous drugs", Central Council for Research in Ayurveda and Siddha; 4(1): 127 – 129 68 S.J Roberts (1980), "Dysmenorrhea", Nurse Practitioner 5:4:9-10 69 Sarkar S and R.L.Stoms (2006), " Biodiversity conservation planning tools: Present status and Challenges for the Futuer ", Annual review of Environment and resources 311: 123-159 70 Rokhsareh Sadeghi et al (2012), "An In Vitro Assessment of Antimicrobial and Cytotoxic Effects of Nanosilver", J Med Bacteriol Vol 1, No 3, : pp 44-52 71 Van Vuuren SF and Naiddo D (2010), "An antimicrobial investigation of plants used traditionally in southern Africa to treat sexually transmitted infections.", J ethnopharmacol 130 (3): 552-8 72 I M Sheldon and H Dobson (2004), "Postpartum uterine health in cattle Anim ", Reprod Sci., pp 82 - 83; 295 - 306 73 Harris T and Vlass AM (2015), "Can Herbal Medicines Improve Cellular Immunity Patterns in Endometriosis?", Medicinal & Aromatic Plants 74 Nguyen Van Thanh et al.(2015), "Study on the inhibition effects of some Vietnamese traditional medicinal on egg hatching and laval movement of goat Haemonchus contortus", International journal of Medicinal Plants Reseach ISSN 2169 – 303X Pharmacuetical, Vol (1) 309 -313 75 Wenk (2002), "Texture and anisotropy", Institute of physics publishing 72 76 Wu YC et al (1990), "Two new natural azofluorene alkaloids and a cytotoxicaporphine alkaloids from P Longifolia ", Journal of Natural Products 53, 1327– 1331 77 S Faizi et al (2003), "Evaluation of the antimicrobial property of Polyalthia longifolia var pendula: isolation of a lactone as the active antibacterial agent from the ethanol extract of the stem"(0951-418X (Print)) 78 D Cui et al (2014), "Efficacy of herbal tincture as treatment option for retained placenta in dairy cows", Anim Reprod Sci 145(1-2), tr 23-8 79 Mingxia Huang, Mackenzie J Parker and JoAnne Stubbe (2014), "Choosing the Right Metal: Case Studies of Class I Ribonucleotide Reductases", The Journal of Biological Chemistry 289(41), tr 28104-28111 80 Parinitha Mahishi, B H Srinivasa and M B Shivanna (2005), "Medicinal plant wealth of local communities in some villages in Shimoga District of Karnataka, India", Journal of Ethnopharmacology 98(3), tr 307-312 81 Farnaz Mohammadzadeh et al (2014), "Comparing the Therapeutic Effects of Garlic Tablet and Oral Metronidazole on Bacterial Vaginosis: A Randomized Controlled Clinical Trial", Iranian Red Crescent Medical Journal 16(7), tr e19118 82 Xiaofei Shang et al (2014), "Leonurus japonicus Houtt.: Ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine", Journal of Ethnopharmacology 152(1), tr 14-32 83 Nilima Thosar et al (2013), "Antimicrobial efficacy of five essential oils against oral pathogens: An in vitro study", European Journal of Dentistry 7(Suppl 1), tr S71-S77 73 ... 63 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Thúy Tên luận văn: ? ?Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro ứng dụng điều trị bệnh vi? ?m tử cung bò nano bạc dịch chiết Bồ Công Anh Lactuca. .. vi? ?m tử cung bò nano bạc dịch chiết Bồ Công Anh Lactuca indica L? ?? 1.2 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Đánh giá khả ức chế vi khuẩn in vitro cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng dung môi khác nano bạc vi khuẩn. .. dịch chiết Bồ Công Anh l? ?m tăng khả ức chế vi khuẩn in vitro cao dịch chiết Có thể sử dụng cao dịch chiết Bồ Cơng Anh kết hợp với nano bạc điều trị bệnh vi? ?m tử cung bò cho tỷ l? ?? khỏi bệnh đạt