BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG MAI HƯƠNG BƯỚC ĐẦU THIẾT KẾ MỒI ĐỂ PHÁT HIỆN ALEN ĐA HÌNH HLA-C*03:02 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG MAI HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1401302 BƯỚC ĐẦU THIẾT KẾ MỒI ĐỂ PHÁT HIỆN ALEN ĐA HÌNH HLA-C*03:02 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phùng Thanh Hương NCS Phạm Trần Thu Hà Nơi thực hiện: Viện Dinh dưỡng Quốc Gia HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin chân thành cám ơn giúp đỡ PGS.TS Phùng Thanh Hương, người cô giáo nhiệt huyết, bên hỗ trợ định hướng cho nhiều kiến thức, phương pháp cách trình bày đề tài Tiếp theo, muốn gửi lời cảm ơn tới NCS Phạm Thu Hà, người giúp đỡ nhiều kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm thực nghiệm đồng hành tơi vượt qua khó khăn suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn Phòng Thí nghiệm trung tâm - Viện Dinh dưỡng Phòng Thí nghiệm sinh học phân tử - Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho học tập tiến hành thực nghiệm Trân trọng cảm ơn tới thầy Bộ mơn Hóa sinh, phòng Đào Tạo Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, động viên bên cạnh ủng hộ Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Đặng Mai Hương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Human Leukocyte Antigen (HLA) .3 1.1.1 Giới thiệu gen HLA 1.1.2 Đặc điểm gen HLA 1.2 HLA-C alen HLA-C*03:02 1.2.1 Tổng quan HLA-C .5 1.2.2 Tổng quan alen HLA-C*03:02 1.3 Tổng quan kỹ thuật AS-PCR (Allele-specific polymerase chain reaction) 11 1.3.1 Giới thiệu AS-PCR 11 1.3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu alen 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị .15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu alen .16 2.3.2 Phương pháp thiết kế mồi chung 17 2.3.3 Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi .17 2.3.4 Phương pháp khuếch đại ADN PCR 18 2.3.5 Phương pháp điện di ADN gel agarose .19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 i 3.1 Kết thiết kế quy trình PCR alen HLA-C*03:02 công cụ tin sinh học 20 3.1.1 Kết thiết kế mồi kiểm tra tính đặc hiệu mồi PCR exon – exon gen HLA-C 20 3.2.2 Kết thiết kế cặp mồi PCR đặc hiệu alen HLA-C*03:02 .23 3.2 Kết bước đầu triển khai quy trình thực nghiệm 33 3.2.1 Kết triển khai thực nghiệm PCR bước 33 3.2.2 Kết triển khai thực nghiệm PCR bước 34 3.3 Bàn luận chung 38 3.3.1 Về kết thiết kế quy trình PCR alen HLA-C*03:02 cơng cụ tin sinh học 38 3.3.2 Về kết bước đầu triển khai quy trình thực nghiệm 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AS Allele-specific Đặc hiệu alen AS-PCR Allele-specific polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu allele BLAST Basic Local Alignment Search Tool Cơng cụ tìm kiếm trình tự tương đồng CTL Cytotoxic T Lymphocyte Tế bào lympho T độc HLA Human Leukocyte Antigen Kháng nguyên bạch cầu người Thụ thể giống kháng thể tế bào diệt tự nhiên MHC Killer-cell Imunoglobulin-like receptor Major Histocompability Complex NGS New generation sequencing Giải trình tự hệ PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase SCARs Severe Cutaneous Adverse Reactions Phản ứng bất lợi nghiêm trọng da SJS Stevens Johnson Syndrome Hội chứng Stevens-Johnson TEN Hoại tử biểu bì nhiễm độc SNP Toxic Epidermal Necrolysis Single Nucleotid Polymorphisms Ta Annealing Temperature Nhiệt độ bắt cặp Tm Melting Temperature Nhiệt độ biến tính UTR Untranslated Region Vùng khơng mã hóa KIRs iii Phức hợp hòa hợp tổ chức Đa hình đơn nucleotid DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Tần suất alen HLA-C cộng đồng người Kinh Việt Nam .7 Bảng 1.2 Cấu trúc alen HLA-C*03:02 Bảng 2.1 Quy tắc thiết kế mismatch .17 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR bước 18 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR bước 18 Bảng 3.1 Đặc điểm cặp mồi PCR exon – exon Cereb cộng 20 Bảng 3.2 Đặc điểm cặp mồi PCR exon – exon sau thiết kế điều chỉnh 22 Bảng 3.3 Vị trí nucleotid đặc trưng alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLAC*03:04 27 Bảng 3.4 Kết thiết kế mồi ngược đặc hiệu alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 mồi ngược đặc hiệu 15 alen 28 Bảng 3.5 Kết thiết kế mồi xuôi chung cho 18 alen HLA-C 28 Bảng 3.6 Vị trí nucleotid đặc trưng alen HLA-C*03:02 30 Bảng 3.7 Kết thiết kế mồi ngược đặc hiệu alen HLA-C*03:02 mồi ngược đặc hiệu alen HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 .31 Bảng 3.8 Kết thiết kế mồi xuôi chung cho alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 31 iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Vị trí cấu trúc gen HLA .4 Hình 1.2 Tên alen HLA có đủ cặp chữ số Hình 1.3 Cấu trúc gen HLA-C Hình 1.4 So sánh trình tự alen HLA-C*03 cộng đồng người Kinh Việt Nam Hình 1.5 Số lượng SNP alen HLA-C*03:02 exon intron Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 16 Hình 3.1 Vị trí gắn mồi ngược Cereb 3BCIn3-12 mồi ngược chỉnh sửa CRE2E3 18 alen HLA-C 21 Hình 3.2 Các vị trí thiết kế mồi xi CFE2E3 vùng intron 22 Hình 3.3 Kết blast cặp mồi PCR exon – exon 23 Hình 3.4 Kết so sánh trình tự exon – exon 18 alen HLA-C 26 Hình 3.5 Kết so sánh trình tự alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 .30 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình PCR xác định kiểu gen alen HLA-C*03:02 33 Hình 3.7 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước 34 Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu nghiên cứu mẫu trắng mức nhiệt độ bắt cặp mồi khác (63oC, 65oC, 67oC) .34 Hình 3.9 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước (28 chu kỳ) 35 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước cặp mồi đặc hiệu alen 28 vòng mức nhiệt độ bắt cặp khác (54oC, 56oC, 58oC) 35 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước cặp mồi đặc hiệu 15 alen 28 vòng mức nhiệt độ bắt cặp khác (54oC, 56oC, 58oC) 36 Hình 3.12 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước (27 chu kỳ) 36 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước cặp mồi đặc hiệu alen 27 vòng mức nhiệt độ bắt cặp khác (54oC, 56oC, 58oC) 37 Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước cặp mồi đặc hiệu 15 alen 27 vòng mức nhiệt độ bắt cặp mồi khác (54oC, 56oC, 58oC) 37 v ĐẶT VẤN ĐỀ Họ gen HLA (Human Leukocyte Antigen – HLA) biết đến với vai trò mã hóa cho phức hợp hòa hợp tổ chức (Major Histocompability Complex - MHC) [54] Chức chiếm ưu phân tử MHC lớp I lớp II liên kết peptid từ mơi trường tế bào trình diện peptid bề mặt tế bào để hệ thống miễn dịch kiểm tra Đây trình quan trọng phản ứng hệ thống miễn dịch để tiêu diệt mầm bệnh xâm nhập để ngăn ngừa hệ thống miễn dịch nhắm vào tế bào [45] Với chức quan trọng miễn dịch, trăm bệnh (đã xác định hầu hết hệ quan chính) có liên quan đến gen HLA lớp I II người, với số gen HLA khu vực (ví dụ, bổ thể C4) phần lớn số chúng coi bệnh tự miễn [15], [54] Trong đó, phản ứng mẫn thuốc mối quan tâm lớn gánh nặng cho hệ thống chăm sóc sức khỏe quốc gia mức độ thường nghiêm trọng, tỷ lệ nhập viện cao tỷ lệ tử vong cao, chứng minh có mối liên quan với alen HLA người [2] Phản ứng dị ứng thuốc phổ biến xảy da Mức độ phản ứng thay đổi đa dạng, từ ban ngứa dị ứng đến triệu chứng có khả đe dọa đến tính mạng Dị ứng thuốc nguyên nhân quan trọng bệnh suất tử vong thuốc Hội chứng Stevens Johnson (Stevens Johnson syndrome - SJS) hoại tử biểu bì nhiễm độc (toxic epidermal necrolysis -TEN) phản ứng bất lợi nghiêm trọng da gây thuốc, đặc trưng bong lan rộng lớp biểu bì (SJS: 30% diện tích bề mặt thể) bào mòn màng nhầy [2] Cho đến nay, có nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy mối liên quan chặt chẽ số alen cụ thể với phản ứng mẫn thuốc gây Trong đó, tiêu biểu phản ứng dị ứng thuốc abacavir, carbamazepin allopurinol chứng minh có mối liên quan với số alen HLA [13] Các phản ứng dị ứng phát triển thành phản ứng bất lợi nghiêm trọng da, SJS/TEN nhiều biến chứng nguy hiểm tỷ lệ tử vong dao động từ 10% đến 30% [13] Chính vậy, việc xác định alen HLA liên quan đến dị ứng thuốc có vai trò lớn chăm sóc lâm sàng, cho phép xác định có hay khơng có alen bệnh nhân trước định sử dụng thuốc, làm giảm nguy gặp phản ứng dị ứng nghiêm trọng cho bệnh nhân Do đó, số alen HLA chứng minh mối liên quan với phản ứng dị ứng thuốc xây dựng quy Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước cặp mồi đặc hiệu 15 alen 28 vòng mức nhiệt độ bắt cặp khác (54oC, 56oC, 58oC) Các mẫu 1,2,3,4 tương ứng với mẫu ADN nghiên cứu, mẫu tương ứng với mẫu trắng Giếng thang chuẩn DNA 100 bp giếng 2, 3, 4, 5, 6: mẫu với nhiệt độ bắt cặp 54oC; giếng 7, 8, 9, 10, 11: mẫu với nhiệt độ bắt cặp 56oC; giếng 12,13,14,15,16: mẫu với nhiệt độ bắt cặp 58oC Từ hình 3.10 3.11 cho thấy, phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu alen HLAC*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04 phản ứng PCR khuếch đại 15 alen lại nhiệt độ bắt cặp cho băng điện di kích thước 671 bp dự kiến khơng có băng phụ Tuy nhiên, băng điện di đậm, vệt chạy điện di sản phẩm nồng độ ADN cao Vì vậy, chúng tơi giảm số chu kỳ chạy phản ứng PCR bước từ 28 vòng xuống 27 vòng Chu trình nhiệt PCR bước thể hình 3.12 Hình 3.12 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR bước (27 chu kỳ) Thực lại hai phản ứng PCR chu kỳ mới, sau tiến hành điện di thu kết hình 3.13 3.14 36 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước cặp mồi đặc hiệu alen 27 vòng mức nhiệt độ bắt cặp khác (54oC, 56oC, 58oC) Các mẫu 1,2,3,4 tương ứng với mẫu ADN nghiên cứu, mẫu tương ứng với mẫu trắng Giếng thang chuẩn DNA 100 bp giếng 2, 3, 4, 5, 6: mẫu với nhiệt độ bắt cặp 54oC; giếng 7, 8, 9, 10, 11: mẫu với nhiệt độ bắt cặp 56oC; giếng 12,13,14,15,16: mẫu với nhiệt độ bắt cặp 58oC Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR bước cặp mồi đặc hiệu 15 alen 27 vòng mức nhiệt độ bắt cặp mồi khác (54oC, 56oC, 58oC) Các mẫu 1,2,3,4 tương ứng với mẫu ADN nghiên cứu, mẫu tương ứng với mẫu trắng Giếng thang chuẩn DNA 100 bp giếng 2, 3, 4, 5, 6: mẫu với nhiệt độ bắt cặp 54oC; giếng 7, 8, 9, 10, 11: mẫu với nhiệt độ bắt cặp 56oC; giếng 12,13,14,15,16: mẫu với nhiệt độ bắt cặp 58oC Trong kết điện di hình 3.13 3.14, cặp mồi với 27 vòng PCR nhiệt độ bắt cặp mồi cho băng có chiều dài 671 bp dự kiến, khơng có băng phụ Hơn nữa, vệt chạy điện di sản phẩm mờ khơng có Ở ba nhiệt độ bắt cặp nhận thấy nhiệt độ 58°C cho hiệu suất cao băng đậm Vì vậy, bước quy trình, chúng tơi lựa chọn điều kiện chu kỳ nhiệt PCR 58°C với 27 vòng Kết điện di PCR hình 3.13 3.14 cho thấy có mẫu ADN (mẫu 1, mẫu 2, mẫu 4) có băng xuất hai giếng L1 (khuếch đại đặc hiệu alen) R1 37 (khuếch đại đặc hiệu 15 alen), mẫu thuộc trường hợp bước quy trình: mẫu mang kiểu gen dị hợp tử gồm alen HLA-C*03:02 HLA-C*03:03 HLA-C*0304, alen khác 15 alen lại (alen X) Bên cạnh đó, mẫu có băng xuất giếng R1, đó, mẫu âm tính với HLA-C*03:02 3.3 Bàn luận chung 3.3.1 Về kết thiết kế quy trình PCR alen HLA-C*03:02 cơng cụ tin sinh học Cho đến nay, có hai báo cơng bố cặp mồi PCR exon – exon cho gen HLA-C: cặp thứ Cereb Z cộng với mồi xuôi 5’ – AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA – 3’ mồi ngược 5’ – GGAGATGGGGAAGGCTCCCCACT – 3’, cặp mồi thứ Peterson TA cộng với mồi xuôi 5’ – AGCGAGGTGCCCGCCCGGCGA – 3’ mồi ngược 5’ – CGTGGGAGGCCATCCCGGGAGAT – 3’ [8], [44] Cả hai cặp mồi có mồi xi nằm vùng intron mồi ngược vùng intron 3, đồng thời khuếch đại đặc hiệu gen HLA-C Tuy nhiên, phần trăm GC hai mồi xuôi (85,71% với mồi xuôi Cereb 80,95% với mồi xuôi Peterson) nhiệt độ bắt cặp Ta hai cặp mồi (71-73oC) lớn, dẫn đến làm giảm hiệu suất PCR đồng thời nguy cao trình bắt cặp mồi không đặc hiệu, khuếch đại đoạn ADN khơng phải khn đích [57] Ngồi ra, số nucleotid bắt cặp hai mồi số nucleotid bắt cặp mồi cao cặp mồi thiết kế, làm tăng cấu trúc thứ cấp mồi làm giảm lượng sản phẩm [16] Bằng việc sử dụng ba công cụ tin sinh học chủ yếu Batchprimer3, PrimerBLAST Multalin, đề tài thiết kế quy trình PCR cho alen HLA-C*03:02 Đây quy trình công bố đặc hiệu cho alen HLA-C*03:02 Trong tất nghiên cứu cơng bố, khơng có quy trình để xác định riêng alen HLA-C*03:02 mà dừng lại việc sàng lọc alen HLA-C phương pháp khác [5], [31], [51] Trong đó, alen HLA-C*03:02 biết đến với vai trò làm tăng nguy bệnh nhân viêm khớp dạng thấp bị viêm mạch, đặc biệt làm tăng nguy gặp phản ứng bất lợi nghiêm trọng da điều trị allopurinol Vì vậy, việc xây dựng quy trình xác định đặc hiệu alen HLA-C*03:02 có ý nghĩa quan trọng, giúp hỗ trợ dự đoán tiên lượng bệnh hay sàng lọc gen trước có định sử dụng allopurinol cho bệnh nhân 38 Ngồi ra, quy trình thiết kế có ưu điểm phương pháp khác phân biệt kiểu gen đồng hợp tử dị hợp tử alen Việc xác định kiểu gen đồng hợp tử dị hợp tử có vai trò quan trọng, góp phần dự đoán khả gặp bất lợi bệnh nhân, với kiểu gen đồng hợp tử (có mặt hai alen HLA-C*03:02 cặp nhiễm nhiễm sắc thể số 6) cho nguy cao kiểu gen dị hợp tử (chỉ có alen HLA-C*03:02 alen HLA-C khác) cho nguy thấp Cho đến nay, có nhiều nghiên cứu cho biết vai trò kiểu gen đồng hợp tử, dị hợp tử số bệnh cụ thể Ví dụ đột biến đồng hợp tử gen PINK1 cho thấy tăng nguy mặc bệnh Parkinson độ tuổi trẻ, đột biến dị hợp tử nguy chưa làm rõ [62] Gần đây, Drabkin M cộng công bố kết nghiên cứu đột biến đồng hợp tử gen MCR4 gây nguy béo phì từ nhỏ, với đột biến dị hợp tử, số cân nặng thừa giảm đáng kể [11] 3.3.2 Về kết bước đầu triển khai quy trình thực nghiệm Nhiệt độ bắt cặp phản ứng PCR thơng số quan trọng cho tính đặc hiệu phản ứng ảnh hưởng đến liên kết thành công mồi với ADN mục tiêu đầu khuếch đại Nếu Ta cao, mồi liên kết hiệu với mẫu, làm giảm hiệu suất phản ứng PCR Nếu Ta thấp, xảy liên kết không đặc hiệu mồi với nhiều vùng khác gen [16], [57] Nhiệt độ bắt cặp tối ưu theo lý thuyết thường thấp 5oC so với nhiệt độ biến tính Tm mồi (Ta tối ưu lý thuyết = Tm – 5) Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp građien nhiệt độ cho kết tốt [16], [37] Khoảng cách nhiệt độ Ta građien nhiệt độ thường khuyến cáo cần cách nhiệt độ Ta tối ưu từ 2oC đến 5oC [47] Vì vậy, đề tài sử dụng dải nhiệt Ta ± để tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp mồi với khuôn, gồm nhiệt độ Ta – (tức Tm – 7), Ta (tức Tm – 5) Ta + (tức Tm – 3) Dải nhiệt Ta ± nhiều tác giả sử dụng, tác giả Niens M cộng - để tối ưu hóa Ta cho phản ứng PCR vùng HLA liên quan đến bệnh Hodgkin, hay tác giả Heiat M cộng - để tối ưu hóa quy trình symmetric PCR (PCR đối xứng hai chiều) [18], [43] Như vậy, đề tài thiết kế quy trình dựa nguyên tắc phương pháp PCR đặc hiệu alen (AS – PCR) để xác định alen HLA-C*03:02 Quá trình thực nghiệm với bước bước lựa chọn chu trình nhiệt thích hợp cho thấy chiều dài sản phẩm PCR sau điện di tương ứng với dự kiến, bước đầu cho thấy tính xác quy trình Quy trình thiết kế cần trang thiết bị đơn giản máy PCR thường 39 quy, dễ thực hiện, có tiềm áp dụng phòng xét nghiệm bệnh viện, tốn so với phương pháp real-time PCR giải trình tự Tuy nhiên, hạn chế khóa luận giới hạn thời gian viết đề tài làm thực nghiệm, nhóm nghiên cứu chưa thử nghiệm bước quy trình so sánh kết thử nghiệm bước 1, bước với mẫu chứng dương – kiểu gen đồng hợp tử dị hợp tử alen HLAC*03:02 40 KẾT LUẬN Nghiên cứu thiết kế quy trình xác định kiểu gen đồng hợp tử dị hợp tử alen HLA-C*03:02 đồng thời bước đầu tiến hành thực nghiệm bước bước với kết cụ thể sau:  Kết thiết kế quy trình để xác định kiểu gen đồng hợp tử dị hợp tử alen HLA-C*03:02 gồm bước: o Bước 1: PCR đặc hiệu exon – exon gen HLA-C với mồi xuôi CFE2E3 5' - AGCGAGGGGCCCGCCCGGCGA - 3' mồi ngược CRE2E3 5’ – GGAGATGGGGAAGGCTCCCCACT – 3’ Chiều dài sản phẩm PCR 891 nucleotid o Bước 2: PCR đặc hiệu alen HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLAC*03:04 để phân biệt với 15 alen HLA-C lại Sử dụng mồi: mồi xi chung HLACB2F 5’- CTACGTGGACGACACGCAGTT – 3’, mồi ngược HLAC3CR 5’- GAGCCACTCCACGCACAG - 3’ mồi ngược HLAC15CR 5’- GAGCCACTCCACGCACGT - 3’ Chiều dài sản phẩm PCR 671 nucleotid o Bước 3: PCR đặc hiệu alen HLA-C*03:02 để phân biệt với alen HLAC*03:03 HLA-C*03:04 Cũng sử dụng mồi: mồi xuôi chung HLACB3F 5’ - AGTATTGGGACCGGGAGACA - 3’, mồi ngược HLAC02R 5’- AGCCATACATCCTCTGGGG - 3’, mồi ngược HLAC03/04R 5’- CAGCCATACATCCTCTGGGT - 3’ Chiều dài sản phẩm PCR 375 - 376 nucleotid  Kết thực nghiệm: xác định chu kỳ nhiệt với nhiệt độ gắn tối ưu cho PCR bước 67oC PCR bước 58oC đồng thời kiểm tra kích thước sản phẩm PCR bước bước quy trình dự kiến thực nghiệm KIẾN NGHỊ  Tiếp tục khảo sát bước quy trình để tiến tới hồn thiện tồn quy trình phát alen HLA-C*03 :02 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bình Trần Đình (2019), Hệ thống kháng nguyên bạch cầu người (hla: human leucocyte antigen) bệnh tăng huyết áp nguyên phát, Tạp chí tim mạch học Việt Nam Tiếng Anh Alfirevic A., Pirmohamed M (2011), "Drug Induced Hypersensitivity and the HLA Complex", Pharmaceuticals, 4(1), pp.69-90 Allcock R J (2012), "The major histocompatibility complex: a paradigm for studies of the human genome", Methods Mol Biol, 882, pp.1-7 Astle W J., Elding H., et al (2016), "The Allelic Landscape of Human Blood Cell Trait Variation and Links to Common Complex Disease", Cell, 167(5), pp 1415-1429e19 Bentley G., Higuchi R., et al (2009), "High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing", Tissue Antigens, 74(5), pp 393-403 Bottema C D., Sommer S S (1993), "PCR amplification of specific alleles: rapid detection of known mutations and polymorphisms", Mutat Res, 288(1), pp.93-102 Can T (2014), "Introduction to bioinformatics", Methods Mol Biol, 1107, pp.5171 Cereb N., Maye P., et al (1995), "Locus-specific amplification of HLA class I genes from genomic DNA: locus-specific sequences in the first and third introns of HLA-A, -B, and -C alleles", Tissue Antigens, 45(1), pp.1-11 Claverie Jean-Michel, Notredame Cedric (2007), "Bioinformatics FOR Dummies - nd Edition", Wiley Publishing, pp.201 10 Cristallo A F., Schroeder J., et al (2011), "A study of HLA class I and class II 4-digit allele level in Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis", Int J Immunogenet, 38(4), pp.303-309 11 Drabkin M., Birk O S., et al (2018), "Heterozygous versus homozygous phenotype caused by the same MC4R mutation: novel mutation affecting a large consanguineous kindred", BMC Med Genet, 19(1), pp.135 12 Espy M J., Uhl J R., et al (2006), "Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing", Clin Microbiol Rev, 19(1), pp.165256 13 13 Fan Wen-Lang, Shiao Meng-Shin, et al (2017), "HLA Association with DrugInduced Adverse Reactions", Journal of Immunology Research, 2017, pp 10 Fateh A., Aghasadeghi M., et al (2016), "Comparison of Three Different Methods for Detection of IL28 rs12979860 Polymorphisms as a Predictor of Treatment Outcome in Patients with Hepatitis C Virus", Osong Public Health Res Perspect, 7(2), pp.83-89 14 Gaudet M., Fara A G., et al (2009), "Allele-specific PCR in SNP genotyping", Methods Mol Biol, 578, pp.415-424 15 Ghodke Y., Joshi K., et al (2005), "HLA and disease", Eur J Epidemiol, 20(6), pp.475-488 16 Grunenwald H (2003), "Optimization of polymerase chain reactions", Methods Mol Biol, 226, pp.89-100 17 Hajeer A H., Al Balwi M A., et al (2013), "HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 allele and haplotype frequencies in Saudis using next generation sequencing technique", Tissue Antigens, 82(4), pp.252-258 18 Heiat M., Ranjbar R., et al (2017), "Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers", Biotechnol Appl Biochem, 64(4), pp.541-548 19 Hert D G., Fredlake C P., et al (2008), "Advantages and limitations of nextgeneration sequencing technologies: a comparison of electrophoresis and nonelectrophoresis methods", Electrophoresis, 29(23), pp.4618-4626 20 Hoa B K., Hang N T., et al (2008), "HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population in Vietnam", Tissue Antigens, 71(2), pp.127-134 21 Hoy Marjorie A (2013), "Chapter - DNA Amplification by the Polymerase Chain Reaction: Molecular Biology Made Accessible", Insect Molecular Genetics (Third Edition), Hoy Marjorie A., Academic Press, San Diego, pp.307372 22 Hung S I., Chung W H., et al (2005), "HLA-B*5801 allele as a genetic marker for severe cutaneous adverse reactions caused by allopurinol", Proc Natl Acad Sci U S A, 102(11), pp.4134-4139 23 Ishmael F T., Stellato C (2008), "Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician", Ann Allergy Asthma Immunol, 101(4), pp.437-443 24 Jiang D K., Ma X P., et al (2015), "Genetic variants in five novel loci including CFB and CD40 predispose to chronic hepatitis B", Hepatology, 62(1), pp.118128 25 Jiang R., Zhang X., et al (2013), "Basics of bioinformatics: Lecture notes of the graduate summer school on bioinformatics of China", Springer, pp.130 26 Jung J W., Song W J., et al (2011), "HLA-B58 can help the clinical decision on starting allopurinol in patients with chronic renal insufficiency", Nephrol Dial Transplant, 26(11), pp.3567-3572 27 Kamps R., Brandao R D., et al (2017), "Next-Generation Sequencing in Oncology: Genetic Diagnosis, Risk Prediction and Cancer Classification", Int J Mol Sci, 18(2), pp.1-5 28 Kang H R., Jee Y K., et al (2011), "Positive and negative associations of HLA class I alleles with allopurinol-induced SCARs in Koreans", Pharmacogenet Genomics, 21(5), pp.303-307 29 Keane N M., Pavlos R K., et al (2014), "HLA Class I restricted CD8+ and Class II restricted CD4+ T cells are implicated in the pathogenesis of nevirapine hypersensitivity", AIDS, 28(13), pp.1891-1901 30 Kim S H., Kim M., et al (2010), "HLA-B*5901 is strongly associated with methazolamide-induced Stevens-Johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis", Pharmacogenomics, 11(6), pp.879-884 31 Koehler R N., Walsh A M., et al (2010), "High-throughput high-resolution class I HLA genotyping in East Africa", PLoS One, 5(5), pp.e10751 32 Kolmodin L A., Birch D E (2002), "Polymerase chain reaction Basic principles and routine practice", Methods Mol Biol, 192, pp.3-18 33 Kratz R F , Siegfried D R (2010), "Using gel electrophoresis to separate molecules", Biology for dummies 2nd, pp.132 - 133 34 Kwok P Y., Chen X (2003), "Detection of single nucleotide polymorphisms", Curr Issues Mol Biol, 5(2), pp.43-60 35 Li Z., Zou H Y (2018), "The full-length sequence of the HLA-C allele, HLAC*03:02:01", HLA, 91(3), pp.204-207 36 Likanonsakul S., Rattanatham T., et al (2009), "HLA-Cw*04 allele associated with nevirapine-induced rash in HIV-infected Thai patients", AIDS Res Ther, 6, pp.22 37 Lorenz T C (2012), "Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies", J Vis Exp, (63), pp.e3998 38 Luscombe Nicholas, Greenbaum Dov, et al (2000), "What is bioinformatics? An introduction and overview", Yearbook of medical informatics, pp.83-99 39 Mahdieh N., Rabbani B (2013), "An overview of mutation detection methods in genetic disorders", Iran J Pediatr, 23(4), pp.375-388 40 McKay J D., Hung R J., et al (2017), "Large-scale association analysis identifies new lung cancer susceptibility loci and heterogeneity in genetic susceptibility across histological subtypes", Nat Genet, 49(7), pp.1126-1132 41 Moffett Ashley, Male Victoria H (2010), "Chapter Thirty - NK cells and reproduction", Natural Killer Cells, Lotze Michael T.,Thomson Angus W., Academic Press, San Diego, pp.403-416 42 Mullis K B (1990), "The unusual origin of the polymerase chain reaction", Sci Am, 262(4), pp.56-65 43 Niens M., Spijker G T., et al (2005), "A factorial experiment for optimizing the PCR conditions in routine genotyping", Biotechnol Appl Biochem, 42(Pt 2), pp.157-162 44 Peterson Trevor A., Bielawny Thomas, et al (2014), "Diversity and Frequencies of HLA Class I and Class II Genes of an East African Population", Open Journal of Genetics, Vol.04No.02, pp.26 45 Posch P E., Hurley C K (2011), "CHAPTER 39 - Histocompatibility: HLA and other systems", Blood and Bone Marrow Pathology (Second Edition), pp.641676 46 Ramírez E., Bellón T., et al (2017), "Significant HLA class I type associations with aromatic antiepileptic drug (AED)-induced SJS/TEN are different from those found for the same AED-induced DRESS in the Spanish population", Pharmacological Research, 115, pp.168-178 47 Roux K H (2009), "Optimization and troubleshooting in PCR", Cold Spring Harb Protoc, 2009(4), pp.1-6 48 Shen J., Guo T., et al (2018), "HLA-B*07, HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*12, and HLA-C*03:02 Strongly Associate With BMI: Data From 1.3 Million Healthy- Chinese Adults", Diabetes, 67(5), pp.861-871 49 Smith C J., Osborn A M (2009), "Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology", FEMS Microbiol Ecol, 67(1), pp.6-20 50 Tohkin M., Kaniwa N., et al (2013), "A whole-genome association study of major determinants for allopurinol-related Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in Japanese patients", Pharmacogenomics J, 13(1), pp.6069 51 Turesson C., Schaid D J., et al (2006), "Association of HLA-C3 and smoking with vasculitis in patients with rheumatoid arthritis", Arthritis Rheum, 54(9), pp.2776-2783 52 Uchiyama K., Kubota F., et al (2013), "Development of a simple method for detection of the HLA-A*31:01 allele", Drug Metab Pharmacokinet, 28(5), pp.435-438 53 Ugozzoli L., Wallace R (1991), "Allele-specific polymerase chain reaction", Methods, Volume Issue 1, pp.42-48 54 Viatte S (2017), "Human leukocyte antigens (HLA): A roadmap", Uptodate, pp.1-5 55 Virakyl S., Nakkuntod J., et al (2010), "Detection of HLA-B*5801 by In-House PCR-SSP ", Khon Kaen University, pp.960-963 56 Wangkumhang P., Chaichoompu K., et al (2007), "WASP: a Web-based AlleleSpecific PCR assay designing tool for detecting SNPs and mutations", BMC Genomics, 8, pp.275 57 Waters D L., Shapter F M (2014), "The polymerase chain reaction (PCR): general methods", Methods Mol Biol, 1099, pp.65-75 58 Xiong Jin (2006), "Essential Bioinformatics", Cambridge University Press, pp.63 59 Yang F., Xuan J., et al (2016), "HLA-B*59:01: a marker for Stevens-Johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis caused by methazolamide in Han Chinese", Pharmacogenomics J, 16(1), pp.83-87 60 Ye J., Coulouris G., et al (2012), "Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction", BMC Bioinformatics, 13, pp.134 61 You F M., Huo N., et al (2008), "BatchPrimer3: a high throughput web application for PCR and sequencing primer design", BMC Bioinformatics, 9, pp.253 62 Zadikoff C., Rogaeva E., et al (2006), "Homozygous and heterozygous PINK1 mutations: considerations for diagnosis and care of Parkinson's disease patients", Mov Disord, 21(6), pp.875-879 63 Zemmour J., Gumperz J E., et al (1992), "The molecular basis for reactivity of anti-Cw1 and anti-Cw3 alloantisera with HLA-B46 haplotypes", Tissue Antigens, 39(5), pp.249-257 Website 64 http://atlasgeneticsoncology.org 65 http://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html 66 http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ 67 http://www.allelefrequencies.net/ 68 http://www.genecards.org/ 69 https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genefamily/hla 70 https://probes.pw.usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi 71 https://www.ebi.ac.uk/ 72 https://www.ebi.ac.uk/gwas/genes/HLA-C 73 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ PHỤ LỤC Cách so sánh trình tự alen cơng cụ Multalin Trong trắng, dán trình tự cần so sánh dạng Fasta*, sau bấm Start MultAlin *Ví dụ dạng Fasta HLA-C*03:02: >HLAC0302 ATGCGT… (Trình tự alen HLA-C*03:02) Cách thiết kế mồi đặc hiệu alen công cụ Batchprimer3  Bước 1: Lựa chọn loại mồi muốn thiết kế  Bước 2: Paste trình tự cần thiết kế mồi đặc hiệu alen Trong đó, SNP lựa chọn để thiết kế mồi mã hóa theo danh pháp IUPAC: G/C  S, A/T  W, G/A R, T/C  Y, G/T K, A/C  M  Bước Lựa chọn điều kiện mong muốn mồi bấm “Pick primer” Cách thiết kế mồi chung cơng cụ Primer-BLAST  Bước Nhập trình tự đoạn ADN cần thiết kế mồi chung  Bước Lựa chọn vị trí mong muốn mồi xi mồi ngược chung  Bước Nhập trình tự mồi đặc hiệu alen  Bước Lựa chọn điều kiện mong muốn chiều dài sản phẩm PCR, số lượng kết quả, nhiệt độ nóng chảy chênh lệch nhiệt độ nóng chảy hai mồi Cách kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi công cụ Primer-BLAST  Bước Nhập trình tự mồi xi mồi ngược  Bước Tích chọn kiêm tra độ đặc hiệt mồi chọn sở liệu gen người  Bước Lựa chọn điều kiện đặc hiệu mồi (thường lựa chọn điều kiện đặc hiệu kết tối đa gen mà mồi khuếch đại) ... bày hình 2.1 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu alen 2.3.1.1 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu alen Nguyên tắc: Để thiết kế mồi. .. Kết thiết kế mồi xuôi chung cho 18 alen HLA-C 28 Bảng 3.6 Vị trí nucleotid đặc trưng alen HLA-C*03:02 30 Bảng 3.7 Kết thiết kế mồi ngược đặc hiệu alen HLA-C*03:02 mồi ngược đặc hiệu alen. .. sinh học 20 3.1.1 Kết thiết kế mồi kiểm tra tính đặc hiệu mồi PCR exon – exon gen HLA-C 20 3.2.2 Kết thiết kế cặp mồi PCR đặc hiệu alen HLA-C*03:02 .23 3.2 Kết bước đầu triển khai