VŨ THỊ MAI LAN bước đầu ỨNG DỤNG hệ DUNG môi EUTECTI TRONG bào CHẾ THUỐC bôi tại CHỖ để điều TRỊ BỆNH DO NHIỄM LEISHMANIA THỂ DA KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

TỔNG QUAN

Hệ dung môi eutecti

1.1.1 Khái niệm hệ dung môi eutecti

Hệ dung môi eutecti (DES) là hỗn hợp các chất có điểm nóng chảy thấp hơn so với các thành phần của nó Các thành phần này có khả năng cho hoặc nhận electron hoặc proton, hình thành liên kết hydro và tạo ra trạng thái lỏng ở nhiệt độ dưới 150°C, hoặc thậm chí dưới 100°C theo một số tài liệu khác.

[29] Tuy nhiên, hầu hết các DES ở trạng thái lỏng ở khoảng nhiệt độ phòng đến 70°C

1.1.2 Thành phần hệ dung môi eutecti

Thành phần của DES bao gồm các chất cho liên kết hydro (HBD) và chất nhận liên kết hydro (HBA), trong đó không xảy ra phản ứng hóa học giữa các thành phần, dẫn đến việc không hình thành các sản phẩm phụ.

Hình 1.1 Giản đồ pha của DES

HBA thường là muối hữu cơ như amoni bậc bốn hoặc muối phospho, kết hợp với các HBD đa dạng như đường (glucose, fructose), rượu đường (glycerol, sorbitol, manitol), acid hữu cơ (acid malic, acid oxalic, acid citric, acid tartaric) và amino acid (prolin, acid glutamic) Những chất này không chỉ đóng vai trò là chất cho liên kết hydro mà còn là chất nhận liên kết hydro, do đó chúng được coi là các thành phần cơ bản trong việc hình thành DES.

DES được hình thành ở nhiệt độ và tỉ lệ mol nhất định của các thành phần Trong quá trình bào chế, một lượng nhỏ nước thường được thêm vào công thức để giảm độ nhớt, và trong một số trường hợp, nước còn giúp hạ nhiệt độ tạo thành DES.

Việc sử dụng nước trong quá trình tạo thành cấu trúc của DES có thể làm tăng độ tan của dược chất Tuy nhiên, nếu cho quá nhiều nước, các liên kết hydro hiện có có thể bị mất, dẫn đến việc không hình thành được cấu trúc đặc biệt của DES.

Bảng 1.1 Sự kết hợp các thành phần tạo DES [11]

Thành phần Ti lệ mol

ChCl Prolin DL-Acid malic 1:1:1

Acid citric DL-Acid malic 1:1

1.1.3 Phân loại hệ dung môi eutecti

Dựa trên thành phần của DES, nhiều nghiên cứu đã đưa ra các khái niệm mới như hệ dung môi eutecti trị liệu (THEDES) và hệ dung môi eutecti tự nhiên (NADES).

Hệ dung môi eutecti tự nhiên (NADES) bao gồm các phân tử như acid hữu cơ đơn giản (acid malic, acid citric, acid lactic), acid amin, đường, cholin và ure, được tìm thấy trong tế bào và cơ thể sống Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng NADES là dung môi thân thiện với môi trường, không gây hại cho sức khỏe và có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như chiết xuất, tổng hợp hóa học và dược phẩm.

NADES được coi là giải pháp thay thế an toàn cho các dung môi hữu cơ truyền thống, giúp giảm thiểu nguy cơ trong quá trình xử lý và độc tính.

Hệ dung môi eutecti trị liệu (THEDES) là loại dung môi eutecti trong đó dược chất là một thành phần chính Hầu hết các dược chất có thể hoạt động như HBD (hydrogen bond donor) và/hoặc HBA (hydrogen bond acceptor), cho phép THEDES được bào chế từ hai dược chất khác nhau THEDES đầu tiên được ghi nhận bao gồm menthol và ibuprofen Nhiều nghiên cứu tiếp theo đã mô tả quá trình hình thành THEDES, với một số công thức được trình bày trong bảng 1.2.

Bảng 1.2 Một số công thức THEDES

Dược chất (Thành phần 1) Thành phần 2 TLTK

Ibuprofen hoặc Paracetamol Cholin clorid [3]

Acid phenyl acetic Acid cinnamic [33]

1.1.4 Phương pháp bào chế hệ dung môi eutecti

Các phương pháp bào chế DES bao gồm: làm bay hơi ở điều kiện chân không, nhiệt, nghiền và đông khô Mỗi phương pháp có nguyên tắc, ưu điểm và nhược điểm riêng, được trình bày chi tiết trong bảng 1.3.

Bảng 1.3 Nguyên tắc, ưu, nhược điểm của các phương pháp bào chế DES

Nguyên tắc Ưu điểm Nhược điểm

Phương pháp làm bay hơi ở điều kiện chân không

- Hòa tan các thành phần vào trong nước

- Sử dụng máy cất quay chân không ở 50°C để loại nước

- Chất lỏng tạo thành được đặt trong máy hút ẩm với silicagel cho đến khối lượng không đổi

- Hạn chế sự phân hủy các thành phần trong hệ do thực hiện ở nhiệt độ thấp

- Quá trình thực hiện phức tạp

- Chỉ áp dụng với các thành phần hòa tan được trong nước

- Sấy chân không các thành phần trước khi sử dụng

Để tạo ra một chất lỏng trong suốt và đồng nhất, bạn cần cho các thành phần vào một bình có nắp và có con khuấy Thêm một lượng nước nhất định và đun nóng hỗn hợp ở nhiệt độ dưới 80°C trong khoảng thời gian từ 30 đến 90 phút.

- Kĩ thuật đơn giản, dễ thực hiện

- Các thành phần trong hệ có thể bị phân hủy hoặc bay hơi ở nhiệt độ cao

- Trộn các thành phần ở nhiệt độ phòng

- Nghiền hỗn hợp đó cho đến khi tạo thành chất lỏng trong suốt [6]

- Các thành phần trong hệ có thể bị phân hủy hoặc bị biến đổi do lực tác động khi nghiền

- Khó tìm thiết bị thích hợp để làm trong quy mô phòng thí nghiệm

- Hòa tan các thành phần vào trong nước

- Sử dụng máy đông khô để loại nước [15]

- Khó loại hết nước ra khỏi hỗn hợp

- Thiết bị đắt tiền, phức tạp

- Chỉ áp dụng với các thành phần hòa tan được trong nước

1.1.5 Đánh giá cơ chế tương tác giữa các thành phần trong hệ dung môi eutecti 1.1.5.1 Phân tích nhiệt

 Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC)

DSC (Differential Scanning Calorimetry) là một phương pháp phân tích nhiệt, trong đó độ chênh lệch nhiệt độ giữa mẫu chuẩn và mẫu nghiên cứu được giữ ổn định ở mức không Thay vào đó, phương pháp này xác định sự chênh lệch nhiệt lượng (mW) cần thiết để duy trì hai mẫu ở cùng một nhiệt độ.

Các thành phần trong mẫu tương tác, dẫn đến sự thay đổi trong quá trình nhiệt Kết quả là, trên giản đồ pha DSC xuất hiện các pic thu nhiệt hoặc tỏa nhiệt Dựa vào đặc điểm của các pic này, chúng ta có thể dự đoán được sự tương tác giữa các thành phần.

 Phương pháp kính hiển vi nhiệt

Mẫu đặc được đặt trên một bản trượt và được đun nóng với tốc độ gia nhiệt cụ thể, sau đó được làm lạnh Nhiệt độ bắt đầu nóng chảy và nhiệt độ bắt đầu kết tinh của mẫu được xác định thông qua quan sát hình ảnh và được ghi lại bằng phần mềm.

1.1.5.2 Đánh giá tương tác phân tử

Các phương pháp đánh giá tương tác phân tử bao gồm phổ hồng ngoại FT-IR, phổ nhiễu xạ tia X, phương pháp Raman để đo độ tán xạ phổ hợp, và phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR).

1.1.6 Một số ứng dụng của hệ dung môi eutecti trong bào chế

1.1.6.1 Cải thiện độ tan của dược chất

Tổng quan về bệnh do nhiễm Leishmania thể da

Bệnh Leishmaniasis, do ký sinh trùng Leishmania gây ra, lây nhiễm qua muỗi cát Phlebotomus, ảnh hưởng đến tế bào của hệ võng mô Biến đổi khí hậu và môi trường đã tạo điều kiện cho vector truyền bệnh này mở rộng phạm vi hoạt động, dẫn đến sự gia tăng sự lây lan của Leishmania.

Leishmaniasis ở người có nhiều hình thức khác nhau, bao gồm Leishmaniasis thể da, thể nội tạng, và thể niêm mạc Trong đó, Leishmaniasis thể da là dạng phổ biến nhất, chiếm từ 50-75% các trường hợp mới mắc, gây ra các tổn thương da với nhiều hình thức như nốt, mảng và loét Sự khác biệt giữa các hình thức này phụ thuộc vào loại ký sinh trùng gây bệnh và tình trạng miễn dịch của người bệnh.

Hình 1.6 Tổn thương do Leishmania

Bệnh Leishmaniasis có thể tự khỏi trong một số trường hợp, nhưng cũng có nguy cơ để lại sẹo vĩnh viễn và những khiếm khuyết nghiêm trọng Leishmania thể da có thể tiến triển thành thể niêm mạc, gây ra các biến chứng nguy hiểm như sụp cầu mũi hoặc loét nghiêm trọng ở vùng tai mũi họng, thậm chí dẫn đến tử vong Để ngăn ngừa Leishmaniasis thể da và niêm mạc, việc điều trị hiệu quả nhiễm trùng da ban đầu là rất quan trọng.

Bệnh do Leishmania thể da có thể được điều trị hiệu quả bằng nhiều phương pháp, bao gồm tiêm tĩnh mạch antimon, amphotericin B, và sử dụng các loại thuốc bôi tại chỗ như berberin, paromomycin, azol, và metronidazol Việc sử dụng thuốc bôi tại chỗ mang lại nhiều ưu điểm, giúp cải thiện tình trạng bệnh một cách an toàn và hiệu quả.

Thuốc bôi tại chỗ có nhiều ưu điểm trong điều trị bệnh Leishmaniasis thể da, khi ký sinh trùng Leishmania cư trú trong đại thực bào ở lớp hạ bì Khi da bị nhiễm trùng, cấu trúc da thay đổi, làm tăng khả năng thẩm thấu dược chất, từ đó việc điều trị bằng thuốc bôi trở nên thuận lợi hơn Thuốc bôi tiếp xúc trực tiếp với vùng da nhiễm trùng, tăng cường nồng độ thuốc tại chỗ và giảm thiểu sự hấp thu vào tuần hoàn chung, giúp hạn chế tác dụng phụ Ngoài ra, thuốc bôi cũng dễ sử dụng cho bệnh nhân Nghiên cứu cho thấy paromomycin, một loại thuốc kháng Leishmania, khi được áp dụng qua da bằng thuốc bôi có hiệu quả tương tự như khi tiêm tĩnh mạch.

- Lựa chọn dược chất kháng Leishmania

Berberin, paromomycin khi dùng tại chỗ có hiệu quả vượt trội so với những thuốc kháng Leishmania khác cũng dùng tại chỗ như: amphotericin B, co-trimoxazol,

14 neomycin, metronidazol, allopurinol,…[14] Itraconazol cũng được chứng minh về tác dụng điều trị Leishmaniasis thể da, thậm chí trong các trường hợp không đáp ứng với antimon và amphotericin B [5], [12], [13], [21]

Do vậy, đề tài được thực hiện trên ba dược chất: paromomycin sulfat, itraconazol, berberin clorid.

Thông tin về dược chất

Hình 1.7 Công thức cấu tạo phân tử berberin clorid

- Công thức phân tử: C20H18NO4Cl 2H2O

- Khối lượng phân tử: 407,9 g/mol

- Tên khoa học: 5,6 dihydro-8,9-dimethoxy-1,3-dioxa-6a-azoniaindeno(5,6-a) anthracen clorid dihydrat

- Độ tan: Tan trong nước nóng, độ tan trong nước ở nhiệt độ phòng là khoảng 2,10 mg/g

[9], trong ethanol là khoảng 3,47 mg/g [30], trong methanol > 25,26 mg/g

- Tính thấm qua da kém

Hình 1.8 Công thức cấu tạo phân tử paromomycin sulfat

- Công thức phân tử: C23H45N5O14.H₂SO₄

- Khối lượng phân tử: 713,71 g/mol

- Tên khoa học: (2S,3S,4R,5R,6R)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2R,3S,4R,5S)-5- [(1R,2R,3S,5R,6S)-3,5-diamino-2-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-

(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-

(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol sulfat

- Độ tan: Tan tốt trong H₂O, khoảng 50 mg/mg

- Không thấm qua vùng da lành nhưng có khả năng thấm qua vùng da nhiễm trùng, tuy nhiên tính thấm kém

Hình 1.9 Công thức cấu tạo phân tử itraconazol

- Công thức phân tử: C35H38Cl2N8O4

- Khối lượng phân tử: 705,64 g/mol

- Tên khoa học: 4-[4-[4-[4-[[cis-2-(2,4-diclorophenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-yl methyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl]piperazin-1-yl]phenyl]-2-[( 1RS )-1- methylpropyl ]-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-on [24]

- Độ tan: Itraconazol rất ít tan trong nước, độ tan khoảng 0,001 - 0,004 μg/g [1], [24]; tan ít trong alcol với độ tan là 378,024 μg/g [17]

- Tính thấm qua da kém

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị

Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Berberin clorid Viện dược liệu TW TCNSX

3 Paromomycin sulfat Alfa Aesar TKHH

4 Cholin clorid Alfa Aesar TKHH

5 Acid levunilic Alfa Aesar TKHH

6 L-Acid malic Alfa Aesar TKHH

7 Betain anhydrid Alfa Aesar TKHH

13 Acid glycolic Alfa Aesar TKHH

14 L-(+)-acid tartaric Trung Quốc TCNSX

15 Acid citric Trung Quốc TCNSX

19 Methanol Mỹ Tinh khiết phân tích

20 Kali dihydrophosphat Trung Quốc TCNSX

21 Natri hydroxyd Trung Quốc TCNSX

22 Nước cất 2 lần Trường Đại học Dược Hà Nội TCNSX

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu

STT Tên thiết bị Nguồn gốc

1 Cân kĩ thuật Sartorius TE3102S Đức

2 Cân phân tích Sartorius BP121S Đức

3 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent HP 1260 Mỹ

4 Cột sắc ký Inertsustain C18 (150 x 4,6 mm; 5 àm) Nhật

5 Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H Đức

6 Máy quét nhiệt vi sai Mettler-Toledo DSC1 Mỹ

7 Máy đo lưu biến Discovery Hybrid Rheometer HR-1 Mỹ

8 Máy đo pH Mettler Toledo Nhật

9 Máy votex IKA Genius 3 Nhật

10 Màng lọc cellulose acetat kích thước 0,2μm và 0,45 μm Việt Nam

11 Bể điều nhiệt WISD DAIHAN Sicentific Hàn Quốc

12 Tủ sấy chân không Vacuum Drying LV 02040 Hàn Quốc

13 Máy khuấy từ Wisd MSH-20A Hàn Quốc

14 Máy đo độ bền gel Texture Analyzer CT3 1500 Mỹ

15 Tủ lạnh, tủ sấy tĩnh, các dụng cụ thủy tinh

Chuột nhắt trắng, khỏe mạnh nhận từ bộ môn Dược lý - trường Đại học Dược Hà Nội

Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu (THEDES) từ thành phần có hoạt tính kháng Leishmania (berberin clorid, paromomycin sulfat)

- Khảo sát và lựa chọn tỉ lệ thành phần tạo DES ở nhiệt độ 80°C trong khoảng thời gian 30 - 90 phút

Đánh giá các đặc tính lưu biến, tính kết dính và khả năng hòa tan của một số dược chất có hoạt tính kháng Leishmania là rất quan trọng Nghiên cứu này tập trung vào một số DES đã được lựa chọn, nhằm xác định hiệu quả và tiềm năng ứng dụng của chúng trong điều trị bệnh Leishmaniasis Việc hiểu rõ các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa công thức dược phẩm và nâng cao hiệu quả điều trị.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế hệ dung môi eutecti

- Sấy chân không các thành phần rắn ở nhiệt độ 55°C; áp suất 0,8 mPa; thời gian sấy 2 tiếng

Cân chính xác các thành phần vào một bình có nắp và thanh khuấy, sau đó đun nóng ở nhiệt độ 80°C trong khoảng 30 - 90 phút cho đến khi đạt được chất lỏng trong suốt và đồng nhất Thời gian đun nóng sẽ tùy thuộc vào từng thành phần của hệ, và khi chất lỏng trong suốt đã hình thành, cần dừng quá trình đun Nếu sau 90 phút vẫn chưa tạo ra chất lỏng trong suốt, cũng cần dừng lại.

- Trong trường hợp DES tạo thành không ổn định, ví dụ xuất hiện vẩn đục, có thể thêm vào hệ một tỉ lệ nước nhất định

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu Đánh giá khả năng tạo THEDES giữa dược chất berberin clorid với các tá dược: ure, glycerin, L-acid malic, acid levunilic, acid glycolic, sorbitol, manitol, glucose, L- (+)-acid tartaric, acid citric; dược chất paromomycin sulfat với các tá dược: ure, cholin clorid, betain anhydrid, L-cartinin, L-acid malic, acid citric, ở các tỉ lệ dược chất là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 (mol/mol) Đánh giá trên các tiêu chí: khả năng tạo eutecti (có tạo thành dạng lỏng trong suốt, đồng nhất không), thể chất: đặc/sánh nhớt, màu sắc: biến màu/màu không đổi, các tiêu chí được xác định bằng mắt thường

2.3.3 Phương pháp khảo sát tỉ lệ các thành phần tạo hệ dung môi eutecti

Based on references [10], [11], and [36], the ability to form Deep Eutectic Solvents (DES) was evaluated using choline chloride as the hydrogen bond acceptor (HBA) and ure, glycerin, levulinic acid, L-malic acid, and sorbitol as hydrogen bond donors (HBD) at molar ratios of 1:2, 1:1, 1:1, 1:1, and 1:1, respectively The assessment was conducted according to specific criteria.

Cảm quan của sản phẩm được đánh giá qua màu sắc (bao gồm biến màu và màu không đổi), thể chất, độ trong, độ nhớt và bọt khí Những đặc điểm này được xác định bằng mắt thường ngay sau khi đun và sau 24 giờ ổn định ở nhiệt độ phòng, cũng như ở nhiệt độ 4ºC trong mùa đông.

 Mùi: dễ chịu/khó chịu

2.3.4 Phương pháp đánh giá độ tan của dược chất trong hệ dung môi eutecti

2.3.4.1 Phương pháp đánh giá độ tan của berberin clorid và itraconazol trong DES a Thiết kế thí nghiệm đánh giá độ tan

Để hòa tan một lượng dư dược chất, cần khuấy ở nhiệt độ phòng ít nhất 24 giờ và kết hợp với siêu âm nhằm tăng tốc độ tan Đối với mẫu DES có độ nhớt cao như ChCl:Sor, nếu không thể khuấy ở nhiệt độ phòng, hãy nâng nhiệt độ lên 50°C để thực hiện quá trình khuấy.

- Ở các thời điểm sau khuấy 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ,… để ổn định 24 giờ với mẫu có nâng nhiệt độ, những mẫu còn lại bỏ qua bước “để ổn định”

- Li tâm lấy dịch trong đem đi định lượng

- Dừng khuấy khi kết quả định lượng dược chất giữa 2 lần kế tiếp là không đổi Xác định thời gian khuấy tối ưu cho các DES

- Từ kết quả định lượng sau thời gian khuấy tối ưu, tính ra độ tan của dược chất trong DES b Phương pháp định lượng:

Phương pháp đo quang phổ UV-Vis được xây dựng để định lượng berberin clorid trong các mẫu DES:

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, bạn cần cân chính xác 10 mg berberin clorid và hòa tan trong ethanol tuyệt đối Sau đó, chuyển dung dịch vào bình định mức 10 ml để thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ 1000 µg/ml.

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các nồng độ 4; 5; 6; 8; 10 g/ml bằng ethanol 50°

Xác định bước sóng hấp thụ cực đại của berberin clorid: Quét phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn nồng độ 8 g/ml

Mẫu thử: Cân chính xác một lượng dịch sau li tâm, pha loãng bằng ethanol 50° Mẫu trắng: Ethanol 50°

Tiến hành đo quang ở bước sóng hấp thụ cực đại để xác định nồng độ dược chất trong dung dịch DES đã pha loãng (Ct) Tiếp theo, tính toán độ tan của berberin clorid trong DES bằng công thức phù hợp.

Ct : nồng độ dược chất trong DES đó pha loóng (àg/ml)

S: độ tan berberin clorid trong DES (mg/g) m cân: khối lượng mẫu thử cân trên thực tế (g)

D: hệ số pha loãng của mẫu thử

 Đánh giá các chỉ tiêu:

Đánh giá tác động của tá dược đến khả năng hấp thụ quang của các mẫu DES chứa dược chất bằng cách thực hiện song song các mẫu DES không chứa dược chất với các mẫu chứa dược chất để kiểm tra độ tan Quá trình này bao gồm việc quét phổ các mẫu DES không chứa dược chất nhằm so sánh và phân tích kết quả.

 Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp định lượng bằng đo quang, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu dưới đây:

Độ tuyến tính được xác định bằng cách đo quang các dung dịch chuẩn theo thứ tự nồng độ tăng dần Kết quả sẽ được biểu diễn qua đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang và nồng độ dược chất, với hệ số tương quan R đạt mức ≥ 0,995.

Để đánh giá độ lặp lại, tiến hành thẩm định ở nồng độ 8 g/ml bằng cách đo quang 6 mẫu với cùng nồng độ Độ lặp lại được xác định thông qua giá trị RSD, với yêu cầu RSD phải nhỏ hơn 2%.

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) được xây dựng để định lượng itraconazol trong các mẫu DES

Qua tài liệu tham khảo [31], lựa chọn điều kiện sắc kí như sau:

Thiết bị: Sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu

Cột sắc ký Inertsustain C18 với kớch thước cột 150 x 4,6 mm x 5 àm

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 263 nm

Pha động là dung dịch đệm phosphat 0,01M pH 5,0 - MeOH (20:80) (tt/tt) Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl

Để chuẩn bị pha động, cần pha dung dịch đệm phosphat 0,01M với pH 5,0 theo tiêu chuẩn DĐVN V Tiếp theo, chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc bằng cách cân chính xác khoảng 50 mg itraconazol, sau đó hòa tan trong methanol trong bình định mức 100 ml để thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ mong muốn.

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các nồng độ 0,5; 25; 50; 75; 100 àg/ml bằng methanol

 Đánh giá các chỉ tiêu

21 Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp định lượng bằng HPLC, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu dưới đây:

Để xác định độ tuyến tính của phương pháp, tiến hành tiêm các dung dịch chuẩn theo thứ tự nồng độ tăng dần Kết quả được biểu diễn qua đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ itraconazol, với hệ số tương quan R đạt giá trị ≥ 0,995.

Để đánh giá độ lặp lại, tiến hành thẩm định trên nồng độ 50 μg/ml bằng cách tiêm lặp lại 6 mẫu với cùng nồng độ Độ lặp lại được xác định thông qua giá trị RSD, với yêu cầu RSD phải nhỏ hơn 2%.

2.3.4.2 Phương pháp đánh giá độ tan của paromomycin sulfat trong DES

Paromomycin sulfat không có vòng thơm hay liên kết đôi trong công thức, dẫn đến khả năng hấp thụ UV kém và gây khó khăn trong việc định lượng dược chất Trên thị trường hiện có chế phẩm chứa paromomycin sulfat với nồng độ 15% (kl/kl) Do đó, cần tiến hành đánh giá khả năng hòa tan của paromomycin sulfat ở nồng độ này trong các dung môi DES, thay vì đánh giá độ tan chính xác của nó.

- Hòa tan một lượng paromomycin sulfat đã tính toán (15% kl/kl) vào DES, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

- Đánh giá khả năng hòa tan bằng cách quan sát bằng mắt thường

2.3.5 Phương pháp đánh giá đặc tính lưu biến

 Điều kiện đo lưu biến

Các phép đo lưu biến trong nghiên cứu sử dụng mô hình côn - đĩa với đường kính côn 4 cm, góc côn 4º, đĩa có khả năng điều nhiệt

Các phép đo được thực hiện ở hai nhiệt độ: 32ºC và 20ºC, mô phỏng nhiệt độ trên da và nhiệt độ trong bảo quản

Các mẫu cần được ổn định ở nhiệt độ trong khoảng 120 giây để loại bỏ tác động của ngoại lực và đảm bảo mẫu đồng đều về nhiệt Lượng mẫu cần thiết cho mỗi phép đo lưu biến chỉ khoảng 1,2 – 1,5 g Sau mỗi lần đo, cần vệ sinh dụng cụ và thay mẫu mới lên đĩa.

 Cách đưa mẫu lên đĩa

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát sự tạo thành hệ dung môi eutecti trị liệu

Cách tiến hành được trình bày ở 2.3.1 và các tiêu chí khảo sát theo mục 2.3.2: khả năng tạo eutecti, thể chất và sự biến đổi màu sắc

3.1.1 Kết quả khảo sát khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu của berberin clorid

Bảng 3.1 Khảo sát khả năng tạo THEDES của berberin clorid

Tá dược Tỉ lệ berberin clorid (mol/mol)

(Chú thích: “0”: không tạo eutecti, “x”: tạo eutecti, “ ”: không chuyển màu,

Hình 3.1 Hình ảnh khảo sát khả năng tạo THEDES của berberin clorid

(Chú thích: A: berberin clorid:acid levunilic, B: berberin clorid:ure, berberin clorid:glycerin, berberin clorid:manitol, berberin clorid:L-acid malic, đều ở tỉ lệ 0,1)

Berberin clorid là một muối amoni bậc 4, có khả năng hoạt động như chất nhận liên kết hydro trong quá trình hình thành THEDES Kết quả nghiên cứu cho thấy

26 bảng cho thấy berberin clorid không có khả năng tạo THEDES khi phối hợp với các tá dược khảo sát

3.1.2 Kết quả khảo sát khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu của paromomycin sulfat

Bảng 3.2 Khảo sát khả năng tạo THEDES của paromomycin sulfat

Tá dược Tỉ lệ paromomycin sulfat(mol/mol)

(Chú thích: “0”: không tạo eutecti; “x”: tạo eutecti, thể chất rất đặc; “”: tạo eutecti, thể chất sánh, nhớt; “ ”: màu không đổi; “ ”: biến màu)

Paromomycin sulfat có nhóm chức –OH hoặc –NH2, cho phép nó hoạt động như chất nhận hoặc chất cho liên kết hydro trong quá trình hình thành THEDES Kết quả nghiên cứu cho thấy paromomycin sulfat có khả năng tạo THEDES khi kết hợp với ure, cholin clorid, acid citric, L-acid malic, và L-cartinin Tuy nhiên, các THEDES được tạo thành có thể rất đặc, không phù hợp cho thuốc bôi tại chỗ, hoặc có thể bị biến màu do sự phân hủy của dược chất hoặc tá dược, đặc biệt là khi phối hợp với acid citric hoặc cholin clorid.

Kết luận: Không thích hợp để bào chế THEDES từ paromomycin sulfat với các tá dược khảo sát.

Đánh giá hệ dung môi eutecti

3.2.1 Khảo sát sự tạo thành hệ dung môi eutecti

Cách tiến hành được mô tả trong mục 2.3.1, với thành phần và tỉ lệ các công thức DES được trình bày trong bảng 3.3 Đánh giá khả năng tạo thành DES dựa trên các tiêu chí như thể chất, độ trong, bọt khí, độ nhớt, màu sắc, và mùi ở nhiệt độ phòng và 4ºC (nhiệt độ mùa đông) Kết quả cho thấy sự tương đồng giữa nhiệt độ phòng và 4ºC, được thể hiện trong bảng 3.4.

Hình 3.2 Thành phần tạo DES

Chú thích: A: L-Acid malic, B: Cholin clorid

Hình 3.3 DES cholin clorid:L-acid malic 1:1 (mol/mol)

(Chú thích: C: ngay sau khi đun nóng, D: ổn định sau 24h ở nhiệt độ phòng)

Bảng 3.3 Thành phần của các công thức DES

Công thức Thành phần Tỉ lệ (mol/mol)

ChCl:Gly Cholin clorid:Glycerin 1:1

ChCl:Levu Cholin clorid:Acid levunilic 1:1

ChCl:L-Mal Cholin clorid:L-Acid malic 1:1

ChCl:Sor Cholin clorid:Sorbitol 1:1

ChCl:Ure Cholin clorid:Ure 1:2

Bảng 3.4 Khảo sát khả năng tạo DES

Các mẫu DES ChCl:Gly ChCl:Levu ChCl:L-Mal ChCl:Sor ChCl:Ure

Hơi vàng Hơi vàng Không màu Không màu

Mùi Dễ chịu Hơi chua Hơi chua Dễ chịu Khó chịu

Thể chất Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng

28 Độ trong Trong suốt, không có vẩn đục

Trong suốt, không có vẩn đục

Trong suốt, không có vẩn đục

Trong suốt, không có vẩn đục

Sau khi đun, sản phẩm có độ trong suốt và cần được ổn định trong vòng 24 giờ Trong thời gian này, sản phẩm xuất hiện vẩn đục và có độ nhớt cao hơn so với các mẫu khác, thể hiện tính sánh nhớt rõ rệt.

Bọt khí Không có bọt khí

Không có bọt khí (Lúc đầu nhiều bọt khí, tăng thêm thời gian khuấy để loại bọt khí)

DES chứa thành phần ChCl:Ure với tỷ lệ 1:2, tạo ra một chất lỏng đồng nhất khi đun nóng Tuy nhiên, khi để nguội, nó sẽ kết tinh trở lại và xuất hiện vẩn đục Việc thêm nước với các tỷ lệ khác nhau sẽ ảnh hưởng đến tính chất của dung dịch này.

%H2O/DES (kl /kl), kết quả được trình bày ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Cảm quan của DES ChCl:Ure khi thêm các tỉ lệ nước khác nhau

Tỉ lệ nước thêm vào

Nhận xét: Kết quả cho thấy DES có thể được tạo thành với các thành phần

ChCl:Sor 1:1, ChCl:Gly 1:1, ChCl:Levu 1:1, và ChCl:L-Mal 1:1 được tạo ra ở nhiệt độ 80°C trong khoảng thời gian 30 - 90 phút Đối với hệ ChCl:Ure, cần bổ sung một tỉ lệ nước nhất định để tạo thành DES ổn định ở 4°C và 20°C, với tỉ lệ nước tối ưu là 10% (kl/kl) Các thành phần tạo DES hoàn toàn tan chảy, và các DES thu được là chất lỏng nhớt, trong suốt Việc thêm nước có thể cần thiết trong trường hợp DES chưa ổn định, như với ChCl:Ure Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung nước có thể tăng khả năng hình thành DES, nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến các tính chất như độ nhớt, độ phân cực và khả năng cải thiện độ tan dược chất Hơn nữa, tỉ lệ nước cao hơn 50% có thể làm phá vỡ các liên kết hydro và hủy hoại cấu trúc đặc biệt của DES, vì vậy cần tính toán cẩn thận khi thêm nước.

Các phép đánh giá được tiến hành trên năm hệ DES bao gồm ChCl:Gly 1:1, ChCl:Levu 1:1, ChCl:L-Mal 1:1, ChCl:Sor 1:1, và ChCl:Ure 1:2, cùng với 10% H2O Hệ DES ChCl:Ure sẽ được viết tắt trong các phần tiếp theo.

3.2.2 Đánh giá đặc tính lưu biến

3.2.2.1 Ảnh hưởng của tần số dao động đến cấu trúc mẫu

Kết quả khảo sát với mẫu DES ChCl:Sor được trình bày ở hình 3.4

Hình 3.4 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của tần số dao động đến cấu trúc mẫu

DES ChCl:Sor ở các nhiệt độ khác nhau

Các kết quả từ các DES khác cũng tương tự như mẫu DES ChCl:Sor Trong dải tần số dao động từ 0,1 Hz đến 100 Hz, cấu trúc của các DES vẫn được bảo toàn, thể hiện qua giá trị độ nhớt phức hợp η * gần như không thay đổi.

Cấu trúc của các DES khảo sát không bị ảnh hưởng bởi tần số trong khoảng 0,1 Hz đến 100 Hz Vì vậy, tần số f = 1 Hz được lựa chọn để thực hiện các phép đánh giá lưu biến thông qua chế độ đo dao động.

3.2.2.2 Ảnh hưởng của tốc độ trượt đến đặc tính lưu biến a Sử dụng chế độ đo trượt liên tục

Theo dõi sự biến thiên độ nhớt của mẫu ChCl:Sor ở các tốc độ trượt từ 0,1 s⁻¹ đến 100 s⁻¹ tại nhiệt độ 20ºC và 32ºC, theo phương pháp đã nêu trong mục 2.3.5.2.a Kết quả về sự biến thiên độ nhớt theo tốc độ trượt được thể hiện rõ trong hình 3.5.

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn độ nhớt theo tốc độ trượt của mẫu DES ChCl:Sor ở các nhiệt độ khác nhau

Nhận xét: Nhìn vào hình 3.5 ta thấy ở tốc độ trượt thay đổi từ nhỏ đến lớn:

Độ nhớt của DES ChCl:Sor hầu như không thay đổi trong khoảng từ 0,1 s^-1 đến 100 s^-1 Các mẫu DES khác như ChCl:Gly, ChCl:L-Mal, ChCl:Levu và ChCl:Ure cũng cho thấy xu hướng tương tự (PHỤ LỤC 2) Điều này cho thấy rằng ở nhiệt độ 20°C (nhiệt độ bảo quản) và 32°C (nhiệt độ của da), độ nhớt của DES vẫn ổn định ở các tốc độ trượt khác nhau.

Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tốc độ trượt được trình bày ở mục 2.3.5.1.a Kết quả khảo sát với mẫu DES ChCl:Sor được trình bày ở hình 3.6 và 3.7

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn G”, η* theo tốc độ trượt của mẫu DES ChCl:Sor ở nhiệt độ 20°C

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn G”, η* theo tốc độ trượt tốc độ trượt của mẫu DES

Kết quả từ các DES còn lại tương tự như mẫu DES ChCl:Sor, với tốc độ trượt từ 0,1 s^-1 đến 100 s^-1 Giá trị mô đun nhớt G” và độ nhớt phức hợp η* của các hệ gần như không thay đổi, trong khi giá trị mô đun đàn hồi G’ quá nhỏ, nằm ngoài giới hạn đo.

Nhận xét: Các DES không bị phá hủy cấu trúc thể hiện qua sự ổn định của giá trị

G” và η* Các hệ này thể hiện tính lỏng nhớt (G”) >> tính chất gel cứng (G’)

Kết quả khảo sát cho thấy, các mẫu DES ổn định ở nhiều tốc độ trượt khác nhau, cho thấy tính chất lưu biến của chúng không bị ảnh hưởng bởi lực tác động Điều này chứng tỏ rằng các DES này là chất lỏng Newton, với độ nhớt chỉ phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất, mang lại lợi ích đáng kể cho ứng dụng của chúng.

Các chế phẩm dùng trên da không bị lực tác dụng làm biến đổi độ nhớt, ảnh hưởng đến tính bám dính Vì là chất lỏng Newton, các chế phẩm này dự đoán sẽ không có tính xúc biến (thixotropy).

3.2.2.3 Độ nhớt của một số DES

Việc xác định độ nhớt là rất quan trọng để đánh giá tính phù hợp của DES khi sử dụng trên da, vì các chế phẩm này cần có độ nhớt cao để đảm bảo khả năng bám dính tốt trên bề mặt da Độ nhớt của các mẫu được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.5.2.b, và kết quả độ nhớt của một số DES được tổng hợp trong bảng 3.6.

Bảng 3.6 Độ nhớt của một số DES ở các nhiệt độ khác nhau

DES ChCl:Gly ChCl:Levu ChCl:L-Mal ChCl:Sor ChCl:Ure Độ nhớt (Pa.s)

Độ nhớt của các DES được trình bày trong bảng 3.6 cho thấy mức độ cao, phù hợp cho việc sử dụng trong chế phẩm trên da Nguyên nhân chính dẫn đến độ nhớt cao của DES là sự hiện diện của mạng lưới liên kết hydro rộng lớn, hạn chế sự di chuyển của các phân tử tự do Bên cạnh đó, kích thước phân tử lớn và khối lượng riêng cao, cùng với các lực tác động như lực tĩnh điện và lực van der Waals, cũng góp phần làm tăng độ nhớt Đặc biệt, độ nhớt ở nhiệt độ 20ºC cao hơn so với 32ºC, điều này hợp lý do sự tương tác giữa các phân tử chất lỏng Khi nhiệt độ tăng, các phân tử di chuyển nhanh hơn, dẫn đến sự phân tách và làm suy yếu lực giữa chúng, từ đó giảm độ nhớt.

3.2.2.4 Kết quả đánh giá tính xúc biến Đánh giá tính xúc biến được tiến hành theo mục 2.3.5.2.c Sự thay đổi độ nhớt theo các giai đoạn của mẫu DES ChCl:Sor ở 32ºC được trình bày trong bảng 3.7 Đồ thị xác định tính xúc biến của DES này được thể hiện trong hình 3.8

Bảng 3.7 Sự thay đổi độ nhớt theo thời gian của mẫu DES ChCl:Sor

Giai đoạn 1 2 3 Độ nhớt (Pa.s) 21,49 21,28 21,24

Hình 3.8 Đồ thị xác định tính xúc biến của mẫu DES ChCl:Sor ở nhiệt độ 32°C