BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘÌV :. ----------------„„oOo------ ’---------NGUYỄN TIẾN THÀNH NGHIÊN c ú u TÁC DỤNG CỦA ASLEM LÊN KHẢ NẢNG CHUYỂN DẠNG VÀ CHẾ TIÊT CYTOKIN CỦA TẾ BÀO LYMPHO MÁU NGOẠI VI ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRựC TRÀNG • • • (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 1998-2003) Giáo viên hướng dẫn 1. PGS.TS Đào Kim Chi 2. Ths Nơi thực hiện Nguyễn Hoàng Anh 1. Labo Trung tâm Y sinh học, Đại học Y Hà nội 2. Khoa Phẫu thuật Tiêu hóa, Bệnh viện Việt Đức 3. Khoa Huyết học và Truyền máu, Bệnh viện Việt Đức Thcd gian thực hiện Tháng 6 năm 2002 - Tháng 4 năm 2003 Hà nội tháng 6 - 2003 LỜI CẨM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu ỗắc tói PGS.T5 Đào Kim Chi, The Nguyễn Hoàng Anh, những người thầy luôn tận tình hướng dẫn em thực hiện luận văn nầy. Em xin cảm ơn 5ự hướng dẩn, hấ trợ kỹ th uậ t của GS.T5KH Phan Thị Phi Phi, TS Bạch Khánh Hòa cùng các cán bộ, kỹ th u ậ t viền tại Labo Trung tâm y sinh học- Đại học Y Hà nội. Em xin cảm ơn ỗự giúp đỡ của GS.TS Đẽ Đức Vằn, tập th ể các bác õTvà y tá Khoa Phẫu th u ậ t tiêu hóa, cắc bác sĩ và y tá Khoa Huyết học và Truyền máu E3ệnh viện Việt Đức. Cuối cùng em xin cầm ơn I3an giám hiệu, cấc phòng ban, bộ môn trường Đậ\ học Pược Hà nội ảã tạo mọi điểu kiện thuận lợi cho em trong ơịuấ trình học tập và thực hiện khóa luận tạ i trường. Hà Nội tháng 6 năm 2003 Nguyấn Tiấn Thành CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADCC A. Phản ứng gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể '1 / j (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) ^ “ BCGF Yếu tố phát triển tế bào B (B Cell Growth Factor) CD Cụm biệt hóa (cluster of differenciation) CMI Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (Cell Mediated Immune response) CRP Protein c Phản ứng (C Reactive Protein) cs cộng sự ĐTB Đại thực bào ĐTT Đại trực tràng ICAM Phân tử kết dính tế bào (Inter-Cellular Adhesion Molecule) EL Interleukin LAK Các tế bào diệt được hoạthóa bởi lymphokin (Lymphokin Activated Killer cell) LFA Kháng nguyên chức năng của tế bào lympho (Lymphocyte Functional Antigen) ị -l NK Phức hơp hòa hơp tổ chức (Major Histo-compatibility Complex) fc Tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer Cell) PBMC Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (Peripheral blood mononuclear cell) RPMI Roswell Park Memorial Institute TAA Kháng nguyên liên kết vói khối u (Tumor Associated Antigen) Tc Tế bào lympho T gây độc (T Cytotoxic) TCGF Yếu tố phát triển tế bào T (T Cell Growth Factor) TCR Receptor của tế bào T (T cell receptor) TGF Yếu tố kích thích chuyển dạng và phát triển (Transform Growth Factor) Th Tế bào T trợ giúp (T Helper) Ts Tế bào T ức chế (T Suppressor) TSA Kháng nguyên đặc hiệu cho khối u (Tumor Specific Antigen) MHC MỤC LỤC Trang Danh mục các chữ viết tắt ĐẬT VẤN ĐỀ PHẦN 1. TỔNG 1.1. Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch................................. 1 1 1.1.1. Tếbàolym phoT.................................................................. 1 1.1.2. Các tế bào trình diện khángnguyên....................................... 2 1.1.3. Tế bào lympho B .................................................................. 4 1.1.4. Các tế bào hiệu ứng của đápứng miễn dịch tế bào................. 5 Cytokin........................................................................................ 5 1.2. 1.2.1. Khái niệm về cytokin .......................................................... 6 1.2.2. Cytokin receptor................................................................... 9 1.2.3. Cytokin type I và cytokin type n ........................................... 12 1.2.4. Interleukin-2 ........................................................................ 14 1.2.5. IFNy...................................................................................... 15 1.2.6. Interleukin-4 ........................................................................ 16 1.2.7. Interleukin-10...................................................................... 17 1.3. Miễn dịch trong ung thư .............................................................. 18 1.3.1. Kháng nguyên ung thư ........................................................ 18 1.3.2. Đáp ứng miễn dịch chống lại khối u ..................................... 19 1.3.3. Suy giảm miễn dịch trong ung thư........................................ 23 Miễn dịch trị liệu trong ung thư.................................................... 25 1.4. 1.4.1. Mục đích của miễn dịch trị liệu............................................ 25 1.4.2. Cơ chế chung của các thuốc kích thích miễn dịch.................. 26 1.4.3. Aslem................................................................................... 27 PHẦN 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 30 2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................. 30 2.2. Phương pháp nghiên cứu........................... ................................... 31 2.2.1. Ghi nhận thông tin và lấy m ẫu.............................................. 31 2.2.2. Tách và nuôi cấy PBMC........................................................ 32 2.2.3. Thu hoạch môi trường và tế bào sau 48giờ nuôi cấy.............. 34 2.2.4. Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng........................................ 34 2.2.5. Định lượng cytokin trong môi trường nuôi cấy...................... 35 2.2.6. Sử lý số liệu .......................................................................... 37 PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN c ú u 38 3.1. Đặc điểm nhóm bệnh nhân và nhóm chứng................................. 38 3.2. Tỷ lệ chuyển dạng tế bào lympho sau 48 giờ nuôi cấy.................. 40 3.3. Nồng độ cytokin trong nước nổi nuôi cấy.................................... 41 PHẦN 4. BÀN LUẬN 50 4.1. 50 Về suy giảm đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng 4.1.1. Suy giảm đáp ứng chuyển dạng............................................ 50 4.1.2. Rối loạn cân bằng T hl-T h2............................................... 51 4.2. Về tác dụng của thuốc................................................................... KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 54 59 ĐẶT VẤN ĐỂ Ung thư là bệnh lý ác tính đang chiếm tỷ lệ khá cao và tử vong là chắc chắn nếu không được điều tn tốt. Mặc dù có nhiều tiến bộ trong từng lĩnh vực điều trị: phẫu thuật, tia xạ và hóa chất, song cho tới nay tiên lượng bệnh vẫn chưa được cải thiện đáng kể. Vì vậy, xu hướng của thế giới hiện nay là sử dụng phác đồ đa trị liệu để phối hợp và nâng cao hiệu quả cao nhất của mỗi phương pháp. Kể từ khi Bumet đưa ra thuyết “cảnh giác miễn dịch” (1957), miễn dịch trị liệu đã chính thức được công nhận là một trong những phương pháp bổ trợ chủ yếu điều trị ung thư. Với sự phát triển của sinh học phân tử và miễn dịch học, người ta đã hiểu biết nhiều hơn về cấu tạo cũng như chức năng của hệ thống miễn dịch, cơ chế bệnh sinh cũng như vai trò của miễn dịch trong sinh bệnh học ung thư. Đây cũng là cơ sở để sử dụng các chất kích thích miễn dịch, đặc biệt là những chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu trong điều trị ung thư. Ở Việt Nam, Aslem là một aminoacylsteroid tổng hợp đã được sử dụng trên lâm sàng ung thư từ hơn 20 năm nay với tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu, cho thấy những kết quả rất đáng khích lệ. Tuy nhiên, những nghiên cứu về dược lý đặc biệt là miễn dịch còn rất khiêm tốn. Vì vậy, với mong muốn nghiên cứu sâu thêm về dược lý miễn dịch lâm sàng của Aslem trong ung thư đại trực tràng, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của Aslem lên khả năng chuyển dạng và chê tiết cytokine của tế bào lympho máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng” vời hai mục tiêu cụ thể như sau: 1. Nghiên cứu tình trạng suy giảm miễn dịch ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thông qua khả năng chuyển dạng và chế tiết cytokin của tế bào lympho máu ngoại vi. 2. Nghiên cứu in vitro khả năng phục hồi đáp ứng miễn dịch nói trên của Aslem ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. Các tê bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch Con người sống được và tồn tại được trong môi trường có rất nhiều tác nhân gây bệnh chính là nhờ có hệ thống miễn dịch. Miễn dịch là khả năng nhận biết và loại bỏ các tác nhân lạ đối với cơ thể để giúp cho cơ thể chống đỡ lại bệnh tật. Có hai hình thức đáp ứng miễn dịch: đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. - Miễn dịch không đặc hiệu là đáp ứng chung đối vói mọi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể thông qua các cơ chế không đặc hiệu, trong đó có sự tham gia của các yếu tố thể dịch (lysozome, protein c phản ứng, bổ thể, interferon...) và tế bào (đại thực bào, bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ưa acid, bạch cầu ưa bazơ, tế bào diệt tự nhiên..). - Miễn dịch đặc hiệu là đáp ứng đặc hiệu với kháng nguyên, có sự tham gia và tương tác giữa các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, trong đó tế bào lympho T trợ giúp (Th) đóng vai trò trung tâm điều khiển các đáp ứng. 1.1.1. Tế bào lympho T Lympho T phát triển từ tế bào gốc ở tủy xương thành tiền tế bào T, được gọi là tế bào tiền ức; sau đó được “huấn luyện”, chọn lọc và biệt hóa tại tuyến ức thành các dưới nhóm tế bào T trưởng thành, đưa vào lưu hành trong máu ngoại vi. Màng tế bào lympho T có các thụ thể gọi là TCR (T Cell Receptor) có chức năng gắn kháng nguyên đã được bộc lộ trên bề mặt các tế bào trình diện kháng nguyên. TCR đặc hiệu cho từng tế bào T, có nhiều dòng tế bào T trong máu ngoại vi đủ để đáp ứng với sự đa dạng của kháng nguyên. Dấu ấn kháng nguyên CD3+ (CD: Cluster of Differentiation) đặc trưng cho các lympho T. Ngoài ra, các dưới nhóm lympho T có thêm những dấu ấn đặc trưng riêng: • TCD4+ là tế bào T trợ giúp (THelper- TH). Phân tử CD4 có chức năng nhân diện kháng nguyên được trình diện bởi phức hợp hòa hợp tổ chức lớp II, (MHC n - Major Histocompatibility Complex class n). • TCD8+ biệt hóa thành tế bào T gây độc (Tcyt0t0xic-Tc) hoặc tế bào T ức chế (Tsuppressor-Ts). Phân tử CD8 có chức năng nhận diện kháng nguyên được trình diện bởi phức hợp hòa hợp tổ chức lớp I, (MHCI). Sau khi trưởng thành từ tuyến ức, mỗi tế bào T chỉ mang một dấu ấn của dưới nhóm CD4 hoặc CD8. Quần thể tế bào T trợ giúp được phân chia thành hai dưới nhóm là Thl và Th2, điều hòa đáp ứng miễn dịch đặc hiệu theo hai hướng khác nhau và điều biến lẫn nhau: đáp ứng miễn dịch thể dịch (HI - Humoral Immune Response) và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (CMI - Cell Mediated Immune Response). Ngoài các cụm biệt hóa, màng tế bào lympho T còn có các phân tử đồng kích thích (Costimulator molecule), receptor của bổ thể, cytokin, hormon... 1.1.2. Các tế bào trình diện kháng nguyên (APC - Antigen Presenting Cell) Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu được khởi động bởi việc thâu tóm và trình diện kháng nguyên của các tế bào trình diện kháng nguyên, quá trình này có thể đặc hiệu hoặc không đặc hiệu. APC là những tế bào có khả năng xử lý, trình diện kháng nguyên cho lympho T bao gồm đại thực bào, lympho B, tế bào tua (dendritic cell),... Chức năng trình diện kháng nguyên được thực hiện bởi các phức hợp hòa hợp tổ chức cùng với các phân tử đồng kích thích trên màng tế bào. MHC n trình diện kháng nguyên cho tế bào T CD4+, MHCI trình diện kháng nguyên cho tế bào T CD8+. • Đại thực bào (ĐTB) ĐTB thuộc loại đơn nhân thực bào (mononuclear phagocyte), phát triển từ tế bào gốc ở tủy xương thành monoblast, promonocyte sau đó trở thành monocyte lưu hành trong máu ngoại vi. Các monocyte di chuyển vào các mồ phát triển thành đại thực bào. Tại các tổ chức, đại thực bào mang nhiều tên gọi khác nhau: tế bào histocyte, tế bào Kuffer, tế bào microglia... Đại thực bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, đổng thời trình diện kháng nguyên để khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Các kháng nguyên lạ bị đại thực bào nuốt vào nội bào, chứa trong phagosome. Sau đó các lyzosome tiến tói hòa màng vói phagosome tạo thành phagolyzosome. Lyzosome giải phóng ra enzym, các yếu tố gây độc với kháng nguyên để tiêu diệt kháng nguyên, thủy phân kháng nguyên phức tạp thành các mảnh nhỏ. Sau khi được thâu tóm và sử lý, các mẩu kháng nguyên đặc trưng cho tác nhân gây bệnh sẽ được trình diện lên màng ĐTB tại nơi có MHC lớp n. Các .nhóm quyết định kháng nguyên này được gắn đặc hiệu với TCR của tế bào T thích hợp tạo thành liên kết KN-TCR giữa đại thực bào và tế bào T. Phân tử CD4 trên màng tế bào T cũng đến gắn với MHC trến màng ĐTB, tạo thành phức hợp bền vững. Tuy nhiên, phức hợp này chưa đủ để kích thích tế bào T mà còn cần có thêm liên kết giữa các phân tử đồng kích thích với phối tử (ligand) tương ứng trên màng hai tế bào như: ■ LFA1 (Lymphocyte Functional Antigen: kháng nguyên chức năng của tế bào lympho) trên màng tề bào T gắn với ICAM 1 (Intercellular Adhesion Molecule: phân tử liên kết tế bào) trên màng đại thực bào. t- ■ CD2 trên màng tế bào T gắn với LFA3 trên màng đại thực bào. Phức hợp tạo thành sẽ kích thích đại thực bào giải phóng IL-1 đồng thời kích thích lympho T giải phóng IFNy và IL-2. IFNy hoạt hóa đại thực bào, làm tăng độc tính của ĐTB vói kháng nguyên, tăng tổng hợp và biểu hiện MHC lớp n để tăng cường trình diện kháng nguyên. IFNy cũng kích thích các đại thực bào khác sẵn sàng tiêu diệt kháng nguyên. IL-2 được tế bào T chế tiết hoạt động theo kiểu autocrin kích thích phát triển dòng tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên đó. Quá trình này được gọi là “nhân dòng tế bào” (colonal expansion). IL-2 cũng tác dụng theo kiểu paracrin, kích thích đại thực bào, gây tăng độc tính sẵn sàng tiêu diệt kháng nguyên. 1.1.3. Tế bào lympho B Tế bào lympho B đóng vai trò trung tâm trong đáp ứng miễn dịch thể dịch. Tế bào lympho B lưu hành trong máu chưa có khả năng sinh kháng thể, chỉ khi có đáp ứng với sự kích thích của kháng nguyên thì mới phát triển và biệt hóa thành các tương bào (plasma cell) có khả năng tổng hợp và tiết kháng thể đặc hiệu. Màng tế bào lympho B có thụ thể của lympho B (BCR: B Cell Recetor), các phân tử MHC lớp I và MHC lớp n. BCR là các globulin miễn dịch bề mặt (SIg-Surface Immunoglobulin) hoạt động như các thụ thể tiếp nhận kháng nguyên đặc hiệu với tế bào B. Các kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức (thường là các polysaccarid có các nhóm quyết định kháng nguyên lặp lại nhiều lần) có thể trực tiếp kích thích lympho B biệt hóa và sinh kháng thể. Lympho B đáp ứng với các kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức qua trung gian của tế bào lympho TH. KN vào cơ thể cũng bị thâu tóm bởi lympho B thích hợp do liên kết đặc hiệu của kháng nguyên với BCR trên màng lympho B. Kháng nguyên bị nuốt vào nội -4- bào, xử lý và trình diện trên màng tế bào cùng với phân tử MHC lớp n. Quá trình diễn ra như đối với ĐTB, nghĩa là cũng tạo ra phức hợp liên kết bền vững MHCKN-TCR và CD4. Tuy nhiên có sự khác biệt về các phân tử đồng kích thích và cytokin tham gia vào đáp ứng, ví dụ : ■ LFA1 trên màng lympho T gắn với ICAM 1 trên màng lympho B ■ CD40 ligand trên màng lympho T gắn với CD40 trên màng lympho B ■ CD28 trên màng lympho T gắn vói CD80 trên màng lympho B Phức hợp tạo thành có tác dụng kích thích lympho T tiết IL-4, IL-6 và IL-10. Các cytokin này sẽ hoạt hóa lympho B, kích thích sự biệt hóa thành tương bào sản xuất ra kháng thể đặc hiệu. 1.1.4. Các tế bào hiệu ứng (effector cell) của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Các tế bào được coi là có tác dụng gây đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bào gồm : - Lympho B phát triển thành các tương bào sản xuất kháng thể đặc hiệu chống lại kháng nguyên, gây ra đáp ứng miễn dịch thể dịch. - Các tế bào như đại thực bào, NK, tế bào Tc gây ra đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. 1.2. Cytokin Khi nghiên cứu hiện tượng tế bào chống lại sự xâm nhập của virus lần thứ hai sau lần nhiễm đầu tiên, hai nhà khoa học người Anh là Isaac và Lindenmann đã phát hiện ra một protein có tác dụng kháng virus. Họ đã chứng minh rằng nếu thêm vào mồi trường nuôi cấy tế bào các virus chết thì mồi trường nuôi cấy đó cố khả năng kích thích các tế bào khác chống lại sự xâm nhập của virus đó. Sau đố, năm 1957 họ đã tách được protein có tác dụng kháng virus nói trên và đặt tên là interferon . Đó là Cytokin đẩu tiên được phát hiện [61]. Hình 1.1. Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 1.2.1. Khái niệm về cytokin - Định nghĩa, vai trò Khi gặp một tín hiệu kích thích (các kháng nguyên vi khuẩn, virus, ung thư,..), tế bào miễn dịch chế tiết ra các protein truyền tin đóng vai trò điều hòa đáp ứng miễn dịch. Các protein đó được gọi là cytokin [20],[43],[61]. Cytokin là những glycoprotein có trọng lượng phân tử thấp (8-80 kDa), do nhiều loại tế bào trong đó có tế bào lympho sản xuất khi có đáp ứng với một sự trình diện kháng nguyên. Cytokin kích thích sự phát triển, biệt hóa và hoạt hóa các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, điều hòa (âm hay dương) các đáp ứng miễn dịch thể dịch và đáp ứng miễn dịch tế bào. -6- - về danh pháp Cytokin là từ ghép của “cyto” và “kin” (Kinin like), nghĩa là các chất có nguồn gốc tế bào và có tác dụng kiểu kinin. Các cytokin được đặt tên dựa theo nguồn gốc. Những cytokin được lymphocyte chế tiết gọi là lymphokin, được monocyte chế tiết gọi là monokin. Song cũng có các cytokin do nhiều loại tế bào chế tiết, vì vậy danh từ cytokin vẫn được ưa dùng hơn cả. Mặt khác, do được sản xuất chủ yếu bởi bạch cầu (leucocyte) và có tác dụng lên các bạch cầu khác trong hệ thống miễn dịch nên một số cytokin được gọi là Interleukin (EL) (yếu tố trung gian giữa các bạch cầu). Tuy nhiên cũng có những cytokin có nguồn gốc và tác dụng tương tự nhưng không được gọi là Interleukin (ví dụ các interferon, các yếu tố hoại tử khôi u TNF,..), ngược lại có các cytokin được gọi là interleukin nhưng lại có nguồn gốc và tác dụng lên các tế bào khác chứ không phải bạch cầu. Vì vậy Interleukin không thể thay thế hoàn toàn thuật ngữ cytokin. Để tạo thuận lợi trong thông tin và cho các nghiên cứu sau này, hội nghị quốc tế về Miễn dịch học lần thứ 6 (1986) đã qui định giữ nguyên danh pháp ban đầu của các cytokin (thường được đặt theo tác dụng sinh học khi mói phát hiện), sau khi đã xác định được cấu trúc phân tử và trình tự acid amin thì các cytokin đó sẽ được đặt thêm một tên gồm hai thành phần kiểu IL-X trong đó X là chữ số chỉ thứ tự của các cytokin mới được phát hiện. Hiện nay, cytokin được sử dụng ngày càng nhiều trong các nghiên cứu cũng như ứng dụng trên lâm sàng với tác dụng kích thích hoặc ức chế miễn dịch. Vì vậy chúng còn được xếp vào nhóm các chất điều biến sinh học (biological response modifiers). - Đặc điểm của cytokin • Sản xuất và chế tiết : Trong cơ thể các cytokin thường được sản xuất vói lượng nhỏ, hơn nữa lại có thời gian bán hủy ngắn nên nồng độ trong máu ngoại vi thường rất thấp, nhiều khi không thể phát hiện được. Chỉ khi có tín hiệu kích thích tới tế bào thì gen mã hóa cho cytokin mới được hoạt hóa, sao mã và giải mã. Cytokin được tổng hợp trong khoảng thòi gian rất ngắn và nhanh chóng giải phóng ra ngoại bào để có những đáp ứng thích hợp. • Nguồn gốc và tác dung: Cytokin có thể tác dụng lên nhiều loại tế bào, gây ra các đáp ứng sinh học khác nhau. Đây là một trở ngại lớn khi đưa cytokin vào trị liệu bởi để có được một tác dụng mong muốn thì thuốc có bản chất cytokin sẽ gây ra nhiều tác dụng không mong muốn. Ngược lại, có nhiều cytokin có thể cùng thể hiện một tác dụng lên một loại tế bào. Do đó nếu phát triển một thuốc đối kháng đặc hiệu với một cytokin nào đó thì sẽ khó thu được tác dụng mong muốn vì sẽ có tác dụng bù trừ của các cytokin khác. • Mốt cvtokin thường cổ ảnh hưỏng tới sư tổng hơp và tác dung của các cvtokin khác. Nó. có thể kích thích hoặc ức chế tổng hợp các cytokin khác, gây ra “dòng thác” các đáp ứng sinh học (cascade of biological effects). Các cytokin chế tiết sau có thể điều hòa (âm hoặc dương) tác dụng của cytokin được chế tiết trước đó. Hai cytokin có thể có tác dụng đối lập (antagonize) hoặc hiệp đồng cộng (additive effect) hoặc hiệp đồng tăng cường (synergistic effect) • Cvtokin tác dung lẽn tế bào đích thống qua các receptor đăc hiẽu. Receptor của cytokin gắn ligand với ái lực cao, hằng số phân ly Kd khoảng 10'12 đến 10'10 M (thấp hơn nhiều so với hằng số phân ly của phức hợp KN-KT khoảng 10'11 10-7M). Vì vậy chỉ cần có một lượng nhỏ cytokin gắn vào receptor là đã gây ra tác dụng sinh học. Thông thường mỗi tế bào có khoảng 100 đến 1000 receptor của cytokin. Các túi hiệu ngoại bào điều hòa sự biểu hiện receptor của cytokin sẽ làm thay đổi đáp ứng của tế bào với cytokin. Phần lớn cytokin gây tác dụng thông qua thay cách đổi biểu hiện gen của các tế bào đích, dẫn đến thay đổi chức năng, kích thích hoặc ức chế sự phát triển tế bào đích. Tuy nhiên cũng có hai trường hợp ngoại lệ : các chemokin có tác dụng hóa ứng động bạch cầu, gây di chuyển các tế bào mà không cần sao mã gen và tổng hợp protein; các yếu tố hoại tử khối u (TNF: Tumor Necrosis Factor) gây chết tế bào mà không làm thay đổi biểu hiện gen. • Vé pham vi tác dung: Các cytokin thể hiện tác dụng lên những tế bào lân cận (tác dụng kiểu paracrine), tác dụng lên chính tế bào tiết ra cytokin đó (tác dụng kiểu autocrine), ít khi gây tác dụng toàn thân (systemic) nghĩa là tác dụng lên những tế bào của các cơ quan ở xa (tác dụng kiểu telecrine như các hormon). 1.2.2. Cytokin receptor Để gây tác dụng, các cytokin phải gắn vào receptor trên màng tế bào đích. Các cytokin receptor đều có cấu tạo chung là các proteine xuyên màng vói hai vùng chức năng (functional domain) ở ngoại bào và nội bào. Vùng ngoại bào gồm có hai tiểu đơn vị chức năng (functional subunit), một liên kết với ligand, một để truyền túi hiệu vào nội bào. Vùng nội bào làm nhiệm vụ truyền tin vào tới nhân tế bào. Đã có nhiều cách phân loại ra đời để hộ thống hóa các cytokin và các cytokin receptor. Nhưng cách phân loại dựa vào cấu trúc phần ngoại bào được sử dụng rộng rãi nhất, trong đó cytokin receptor được chia thành 5 nhóm chính (bảng 1.1 trang 11) [20]. Việc phân loại các cytokin receptor theo cấu trúc của vùng ngoại bào thuận tiện cho việc nghiên cứu tương tác giữa cytokin receptor và ligand, nhưng không nêu lên được các con đường truyền tin vì nhiệm vụ truyền tin vào tận nhân tế bào là do vùng nội bào đảm nhiệm. Các cytokin gắn receptor và truyền tin theo nhiều cách khác nhau, trong đó con đường JAK/STAT được biết đến nhiều nhất [18],[19]. Có thể tóm tắt như sau: Cytokin gắn vào receptor sẽ hoạt hóa các tyrosine kinase liên kết với receptor JAK (Janus Kinase), sau đó dẫn đến hoạt hóa các yếu tố truyền tin và I kích thích sao mã STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription). Các protein STAT đi qua màng nhân gắn trên ADN kích thích sao mã, tổng hợp các protein đáp ứng [18],[19]. Các cytokin liên kết với receptor loại 1 và loại 2 truyền tin qua con đường này. Hình 1.2. Cytokin Receptor Bảng 1.1. Phân loại cytokin receptor theo cấu tạo phần ngoại bào (theo Abul K.A.(2000). Cellular and Molecular Immunology [20]) Tên Cytokin receptor loại 1 Cytokin receptor loại 2 Cấu tạo Một receptor có thể cấu tạo bởi một hoặc nhiều tiểu đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị gồm 2 thành phần: Ligand IL-2, IL-3, • Phần thứ nhất có hai cặp cystein ở hai đầu tận EL-4, EL-5, • Phần thứ hai nằm ở phía gần màng tế bào, là đoạn IL-6, IL-7, peptid gồm tryptophan-serin-X-tryptophan-serin IL-9, IL-11, (WSXWS) trong đó X là một acid amin nào đó. IL-12, IL-13, IL-15, Receptor loại này thường gắn với những cytokin có cấu trúc 4 chuỗi xoắn a helix, sự gắn đặc hiệu phụ GM-CSF, G-CSF thuộc acid amin X của chuỗi peptid phía gần màng tế bào. Giống các receptor type I ở chuỗi peptid gồm hai cặp cystein ở hai đầu tận, tuy nhiên không có chuỗi peptid WSXWS như type I. Một receptor chỉ cấu tạo bởi một tiểu đơn vị gắn ligand và một tiểu đơn vị truyền tin. Receptor Có cấu trúc như Ig kiểu Ig IFNa/p IFNy IL-10. EL-1, M-CSF Receptor Có rất nhiều phân tử cysteine ở phần ngoại bào. của TNF Cấu tạo bởi 7 chuỗi xoắn a helix xuyên màng có các Serpentin đoạn xoắn từ trong ra ngoài và ngoài vào trong màng Receptor tế bào. Các receptor thuộc nhóm này gắn và truyền các tín hiệu ngắn và nhanh từ các chemokin. - 11 - TNFa, Fas Ligand. chemokin 1.2.3.Các cytokin type I và cytokin type II Như đã nói ở trên, hai dưới nhóm của tế bào T trợ giúp có tác dụng thúc đẩy đáp ứng miễn dịch theo hai hướng khác nhau và điều hòa lẫn nhau: Thl đẩy mạnh đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, còn Th2 thì lại đẩy mạnh đáp ứng miễn dịch thể dịch là chủ yếu. Sự tương tác giữa Thl và Th2 được thực hiện thông qua các cytokin chức năng của hai dòng là cytokin type I và cytokin type n • Các cytokin type I gồm có: IL-2, IFNy, IL-12, TNFỊ3,.. • Các cytokin type n gồm có: IL-4, IL-5, IL6, LL-10, IL-13 Tương tác giữa cytokin type I và n được tóm tắt trong hình 1.3 Các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) Clone tế bào T trợ giúp Thl/Th2 ' IFNy, DL-12 (-) IFNy (-) (-) IFNy n:-2 (+) Ỷ Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Th2 Thl Th2 Thl IL-4 (-) IL-4, IL-10 IL-4 EL-5 IL-6 11-10 (+) ìr IFNy BL-2 IL-12 ^' Đáp ứng miễn dịch thể dịch (+) Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Hình 1.3. Cytokin type I và type n (Theo Daniel R.L [27]) - 12- EL-4 IL-5 EL-6 11-10 IL-13 (+) 1 Đáp ứng miễn dich thể dich Các cytokin type I và n điều hòa tương hỗ sự chế tiết và tác dụng của nhau, nhóm nào chiếm ưu thế thì đáp ứng miễn dịch sẽ phát triển chủ yếu theo xu hướng nhóm đó. Kết quả tương tác giữa Thl và Th2 không chỉ phụ thuộc vào những cytokin hai dòng tế bào này tự chế tiết ra mà thực tế phụ thuộc vào các cytokin của mỗi nhóm trong môi trường xảy ra tương tác, có thể các tế bào khác của cơ thể tiết ra hoặc cũng có thể do chính bệnh nguyên tiết ra (khối u, vi khuẩn, virus...). Bảng 1.2 tóm tắt nguồn gốc của một số cytokin type I và n. Bảng 1.2. Các bạch cầu tiết cytokin type I và n (Theo Daniel R.L [27]) Cytokin Nguồn gốc Type I Type n IL-2, IFNy, IL-12, IL-4, IL-5, IL6, TNFp EL-10, IL-13 TCD8+ IL-2, IFNỵ EL-4, IL-5, EL-10 Tế bào diệt tự nhiên (NK) IFNy, TNFỊ3 Tế bào Mono/ Đại thực bào IL-12 IL6, EL-10 Lympho B EL-12, TNFị3 IL6, IL-10 Tế bào tua (Dendritic Cell) IL-12 Bạch cầu đa nhân trung tính IL-12 T CD4+ Bạch cầu ưa acid IL-4, EL-5, DL6 Tế bào Mast IL-4, EL-5, BL6 -13- Tóm lại, sự tương tác giữa Thl-Th2 giúp cho cơ thể có hình thức đáp ứng thích hợp vói từng loại kháng nguyên, đồng thời điều hòa ngăn chặn những đáp ứng xảy ra quá mức có thể gây tổn thương cho cơ thể. 1.2.4. Interleukin-2 (IL-2) Interleukin-2 được mô tả đầu tiên bởi Morgan, Ruscetti và Gallo (1976), được gọi là yếu tố phát triển tế bào Lympho T (TCGF-T Cell Growth Factor). IL-2 là một proteine hình cầu có phân tử lượng 15-17,5 kDa, cấu tạo bởi 133 acid amin cuộn thành 4 chuỗi xoắn a helices, về mặt phân tử, receptor của EL-2 gồm có 3 chuỗi polypeptid a,p,y, mỗi chuỗi đều có phần nằm ngoài tế bào gồm 25 acid amin. Các chuỗi oc,ị3,Ỵcó trọng lượng phân tử 55, 75, 64 kDa và phần nội bào là các đoạn peptid gồm 13, 186, 64 acid amin. Sự kết hợp các đoạn peptiđ a, p, Ỵtạo nên 3 loại receptor của IL-2 (IL-2R) khác nhau về ái lực với IL-2 và khả năng truyền tín hiệu vào nội bào. ctIL-2R là recetor có ái lực với JL-2 thấp nhất (lOnM), và không có khả năng truyền túi hiệu vào nội bào. P+Ỵ IL-2R có ái lực trung bình (lnM) và phức hợp a+ị3+Y BL-2R có ái lực mạnh nhất (10 pM); chỉ có hai loại recetor này mới có khả năng truyền túi hiệu vào nội bào, trong đó chuỗi y có tác dụng truyền tin. Trong đáp ứng miễn dịch, IL-2 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình phát triển và biệt hóa các dòng tế bào lympho T đặc hiệu vói kháng nguyên. Ngoài tác dụng autocrine lên chính tế bào tiết ra nó, DL-2 còn có tác dụng lên các tế bào lân cận (paracrine), kích thích gây độc tế bào (cytotoxicity) của các tế bào T gây độc và tế bào NK, kích thích sự phát triển và biệt hóa của tế bào lympho B, kích thích tế bào PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) tổng hợp và chế tiết các cytokin khác như : IL-1, IL6, TNF, IFNy. - 14- IL-2 có tác dụng kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại vi khuẩn, virus, cảm ứng kích thích sự thải loại trên mô hình ghép da và ghép tim ở chuột. Người ta thấy nồng độ IL-2 tăng cao trong huyết tương ở các bệnh tự miễn như lupus ban đỏ hệ thống, xơ cứng bì, viêm khớp dạng thấp. IL-2 cũng làm thoái triển một số khối u thực nghiệm trên chuột. JL-2 được tổng hợp và chế tiết chủ yếu bởi tế bào lympho T trợ giúp (THelper), ngoài ra cũng được chế tiết phần lớn bởi các tế bào T ung thư [19]. Khi có sự kích thích của kháng nguyên cùng vói tín hiệu từ các phân tử đồng kích thích khác như : MHC n, ICAMI-LFA I, LFA m-CD2,..., gen mã hóa IL-2 sẽ sao mã, tổng hợp và tiết IL-2. Sự tổng hợp IL-2 được kích thích bcd một số chất như: phytohemaglutinin (PHA), anti-CD2, anti-CD3, các hợp chất có cấu trúc tương tự như diacyl glycerol (DAG). Các chất như hydrocortison, các prostaglandine, cyclosporin A , AMP vòng ức chế sự tổng hợp IL-2. Do làm tăng độc tính của các tế bào lympho thâm nhiễm khối u (TĨL-Tumor Infiltrating Lymphocyte), LAK (Lymphokin Activated Killer), NK với khối u, IL-2 đã và đang được nghiên cứu để điều trị một số bệnh ung thư như ung thư biểu mô thận (renal adenocarcinoma), u hắc tố (melanoma) , u lympho không Hodgkin và ung thư đại trực tràng. 1.2.5. Interferon gamma (IFN y) IFNy là cytokin hoạt hóa chính của đại thực bào, có chức năng quan trọng trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu cũng như miễn dịch đặc hiệu qua trung gian tế bào. EFNy còn được gọi là interferon miễn dịch (immune interferon) hay interferon type II trong họ các interferon được phát hiện vào năm 1957 bởi Alic Isaac [20]. -15- IFNy là một homodimer protein có trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa, có receptor trên nhiều loại tế bào. Receptor của IFNy gồm hai chuỗi peptid giống nhau về cấu trúc, thuộc nhóm cytokin receptor loại 2, một chuỗi gắn phối tử và một chuỗi truyền tín hiệu vào nội bào. IFNy được chế tiết chủ yếu từ Thl, TCD8+, tế bào NK. IFNỵ hoạt hóa đại thực bào, tăng cường biểu hiện các phân tử MHC I, MHC n, các phân tử đồng kích thích trên màng tế bào trình diện kháng nguyên (APC), kích thích biệt hóa TCD4+ thành Thl, ức chế sự phát triển của Th2, hoạt hóa bạch cầu trung tính, tăng cường độc tính của tế bào NK. 1.2.6. Interleukin-4 (IL-4) Lần đầu tiên năm 1982 người ta phân lập được yếu tố tăng trưởng tế bào B, BCGF (B Cell Growth Factor), sau đó giải mã được gen mã hóa cho cytokin này và đặt tên là interleukin 4. IL-4 là một glycoprotein có trọng lượng phân tử 20 kDa, được chế tiết bởi tế bào Th2 hoạt hoá, hoạt động như một cytokin cảm ứng theo kiểu autocrine cũng như là một cytokin chức năng của tế bào Th2. IL-4 receptor có cấu tạo gồm một chuỗi ec thuộc nhóm receptor loại 1 có chức năng gắn phối tử và một chuỗi y giống receptor Ỵcủa IL-2 có chức năng truyền tín hiệu vào nội bào. IL-4 truyền tin qua con đường JAK/STAT. IL-4 tác dụng lên nhiều loại tế bào như lympho T, lympho B, đại thực bào, tế bào Mast; kích thích TCD4+ biệt hóa thành Th2 đồng thời kìm hãm sự phát triển của tế bào Thl, kích thích tế bào lympho B phát triển, biệt hoá và chế tiết Ig, chủ yếu là IgE ; ức chế độc tính của đại thực bào, ức chế sự hoạt hóa đại thực bào của IFNy. IL-4 đối kháng tác dụng của phần lớn các cytokin type I. - 16 - 1.2.7. Interleukin-10 (EL-10) IL-10 lần đầu tiên được, mô tả vào năm 1989 như là một yếu tố được sản xuất bởi tế bào T trợ giúp nhóm 2 (Th2) và ức chế tế bào Thl tổng hợp các cytokin kích thích miễn dịch khác. Người ta gọi nó là yếu tố kìm hãm tổng hợp cytokin (CSEF : Cytokin Synthesis Inhibitory Factor). IL-10 được sản xuất bởi các tế bào lympho B, T, đại thực bào (macrophage), các bạch cầu đơn nhân (monocyte)... EL-10 có phân tử lượng 18kDa, cấu tạo bởi 178 acid amin có cấu trúc 3 chiều là một homodimer, hai monomer liên kết vói nhau bằng dây nối không đổng hóa tri (non-covalent) tạo thành phân tử hình chữ V, mỗi cánh tay của chữ V được cấu tạo từ 6 chuỗi xoắn a-helices. IL-10 receptor là một heterodimer: IL-10R1 và IL-10R2. IL-10R2 thuộc nhóm cytokin receptor loại 2. IL-10 gắn vào recetor theo hai giai đoạn : đầu tiên IL-10 heterodimer liên kết chuỗi IL-10R1 với ái lực lớn, sau đó gắn IL-10R2 với ái lực thấp hơn để tạo thành phức hợp IL-10/ EL-10R1/ IL-10R2 có hoạt tính sinh học. Được sản xuất từ tế bào Th2, IL-10 ức chế sự phát triển và biệt hóa của dòng tế bào Thl, ức chế sự tổng hợp và chế tiết của IL2 và EFNy, ức chế biểu hiện của phức hợp hòa họp tổ chức lóp n (MHC n), các phân tử đồng kích thích trên ĐTB và các tế bào trình diện kháng nguyên. Ngược lại, IL-10 kích thích sự phát triển và họat hóa chức năng của tế bào lympho B. Do có khả năng ức chế tế bào lympho Thl và các bạch cầu đơn nhân khác, IL-10 có thể được dùng như một chất đàn áp miễn dịch tế bào, áp dụng trong điều trị các trường hợp thải ghép cơ quan, cảm ứng sự dung nạp miễn dịch. 1.3. Miễn dịch trong ung thư Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào, khi bị kích thích bởi các tác nhân gây ung thư, tế bào tăng sinh vô hạn độ, vô tổ chức vượt ra khỏi các cơ chế kiểm soát sự phát triển của cơ thể. Khác với các khối u lành tính thường chỉ phát triển rất chậm tại chỗ, các khối u ác tính phát triển, xâm lấn vào các tổ chức bình thường của cơ thể. Các tế bào u ác tính có khả năng di căn tới các tạng ở xa để hình thành khối u mới, cuối cùng dẫn đến tử vong. Quan điểm tồn tại một đáp ứng miễn dịch chống lại khối u đã được đề cập tới từ cách đây gần 100 năm. Vào đầu thế kỷ XX, Ehrlich (1912) và Bashforsd (1913) là những người đầu tiên cho rằng khối u là những thành phần lạ đối với cơ thể, giống như trường hợp ghép cơ quan, bị phát hiện và đào thải bởi hệ miễn dịch. Từ đó người ta đã tìm cách kích thích các đáp ứng miễn dịch để chống lại khôi u. Ý tưởng của Ehrlich sau đó được tiếp tục phát triển bởi Bumet (1957) với thuyết “cảnh giác miễn dịch” (Immune Surveillance). Thuyết này cho rằng hệ miễn dịch của cơ thể có chức năng phát hiện và tiêu diệt những tế bào bất thường không cho chúng tạo thành khối u và triệt tiêu những khối u đã được hình thành. 1.3.1. Kháng nguyên ung thư Quá trình hình thành ung thư có các đột biến gen, từ đó tạo ra các protein lạ với cơ thể, một số protein này được biểu hiện trên bề mặt tế bào thành các kháng nguyên ung thư. Kháng nguyên ung thư có thể chia thành hai nhóm là kháng nguyên đặc hiệu khối u (TSA) và kháng nguyên liên kết với khối u (TAA). • Kháng nguyên đặc hiệu khối u (TSA - Tumor Specific Antigen) : là kháng nguyên duy nhất chỉ có ở tế bào ung thư, không có ở tế bào bình thường. - 18 - • Kháng nguyên liên kết với khối u (TAA - Tumor Associated Antigen) : là kháng nguyên có ở tế bào ung thư và một số tế bào thường. 1.3.2.Đáp ứng miễn dịch chống lại khối u Các kháng nguyên TSA, TAA có thể bong ra khỏi màng tế bào ung thư, đổ vào tuần hoàn, gây ra đáp ứng miễn dịch chống lại khối u. Cơ thể đáp ứng với kháng nguyên ung thư thông qua cơ chế đặc hiệu và không đặc hiệu, cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào, trong đó miễn dịch qua trung gian tế bào đóng vai trò quan trọng nhất. Các tế bào chính tham gia vào miễn dịch chống lại khối u bao gồm : Tc, NK và ĐTB. a. Tế bào T gây độc (Tc : Cytotoxic T Lymphocyte): Là những tế bào lympho T có khả năng nhận dạng và ly giải các tế bào biểu hiện kháng nguyên lạ. Đa số các tế bào Tc là T CD8+, tế bào T CD4+ chiếm khoảng 10%. Tế bào T CD8+nhận diện kháng nguyên trình diện bởi MHCI. b. Tê bào NK (Natural Killer Cells) và tế bào K (Killer Cells) Các tế bào NK là những lymphocyte có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư mà không cần phải mẫn cảm trước. Sau khi được hoạt hóa bởi IL2 và IFNy, tế bào NK có'thể ly giải được nhiều loại tế bào ung thư, kể cả những tế bào được coi là có tính kháng nguyên thấp đối vói tế bào T. Tế bào NK tác dụng tốt trên những khối u không biểu hiện MHC lớp I. Ngược lại, các phân tử MHC lớp I ức chế độc tính với tế bào ung thư của các tế bào NK do gắn với các Receptor ức chế gây độc (KIR : Killer Inhibitory Receptor) trên màng tế bào NK. - 19 - IFN-V Macrophage Hình 1.4. Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch chống lại khối u (Theo Neville Woolf. Pathology: Basic and systemic (1998) [39]) Tế bào NK nhận dạng tế bào đích thông qua các receptor trên bề mặt tế bào như CD2, CD 16, CD 69. Phân tử CD 16, còn gọi là Fc Recetor (FcyRin), gắn vào kháng thể trên tế bào đích, là bước trung gian trong phản ứng gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC: Antibody-Dependent Cellmediated Cytotoxicity). - 20 - • Cơ chế gây độc tê bào của tê bào Tc và NK: Tc và NK có thể tiêu diệt tế bào đích bằng cách truyền tin trực tiếp khi tiếp xúc giữa tế bào - tế bào thông qua các phân tử trên bề mặt tế bào, hoặc truyền tin gián tiếp thông qua các cytokin. Ngoài ra, tế bào CD8+ và NK còn mang các hạt chứa protein, protein này có thể tiêu diệt tế bào đích khi được giải phóng trực tiếp vào màng tế bào đích. Quá trình gây độc là sự phối hợp của ba cơ chế, trên mỗi loại tế bào có sự phối hợp riêng. - Tiêu diẽt tế bào đích bằng các hat mang perforin và granzvme Tế bào Tc và NK mang các hạt chứa perforin và granzyme (các enzyme gắn với h ạ t: granule-associated enzymes). Khi tiếp xúc với tế bào đích, các thành phần chứa trong hạt được giải phóng vào khe tiếp xúc giữa hai tế bào. Perforin là một protein có khả năng tạo thành các lỗ trên màng tế bào, có cấu trúc và chức năng giống với bổ thể C9. Sau khi được giải phóng, với sự có mặt của ion Ca++, các monomer được polymer hóa tạo thành các kênh protein xuyên màng (Transmembrane channel). Các lỗ này làm thay đổi áp lực thẩm thấu nội bào, nước và các ion tràn vào tế bào làm tế bào trương phồng và vỡ. Đồng thời, các enzyme được giải phóng từ tế bào gây độc vào tế bào đích, phá hủy tế bào đích. Tuy tiếp xúc với perforin nhưng các tế bào Tc và NK không bị tiêu diệt là nhờ có phân tử proteoglycan chứa trong các hạt, gắn và bất hoạt perforin. Granzyme là tổ hợp các enzyme serine protease, trong đó granzyme B là enzyme quan trọng nhất, phân hủy các cơ chất protein ở đầu tận acid aspartic. Granzyme xâm nhập vào tế bào đích thông qua các lỗ trên màng tế bào được tạo bởi perforin. Trong bào tương của tế bào đích, granzyme B thủy phân, hoạt hóa các enzyme caspase. Sau đó enzyme caspase thủy phân hàng loạt cơ chất khác, đưa tế bào chết theo chương trình (apoptosis). Ngoài ra, các enzyme caspase còn -21 - phân hủy các nucleoprotein, hoạt hóa các enzyme khác phân hủy ADN của tế bào đích. - Tiêu diêt tế bào đích thông qua quá trình truyền tin tế bào Khi hoạt hóa, các tế bào Tc biểu hiện các phân tử protein trên bề mặt gọi là Fas ligand (FasL). Các phân tử này gắn lên Fas protein trên màng tế bào đích (protein Fas có ở nhiều loại tế bào). Việc gắn Fas ligand lên Fas protein có tác dụng khởi động quá trình truyền tin vào nội bào, hoạt hóa các enzyme caspase làm phân hủy ADN và dẫn đến apoptosis. Tế bào T CD8+ tiêu diệt tế bào đích bằng cách giải phóng các hạt chứa perforin , Granzyme và thông qua Fas ligand. Tế bào T CD4+ không có cấu tạo hạt, tiêu diệt tế bào đích thông qua Fas ligand. Tế bào NK tiêu diệt tế bào đích thông qua giải phóng hạt chứa Perforin và Granzyme. c. Đại thực bào (Macrophage) Các đại thực bào có tính độc khá đặc hiệu với tế bào ung thư. Tế bào lympho T và NK cùng tham gia với đại thực bào chống lại khối u thông qua việc chế tiết IFNỵ, một cytokin có tác dụng kích thích sự phát triển hoạt tính của đại thực bào. Đại thực bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu có vai trò bảo vệ cơ thể ngay từ lúc xuất hiện những kháng nguyên lạ đầu tiên. Sau đó, chúng có vai trò giống như tế bào APC : sử lý kháng nguyên và trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho T. Cuối cùng, đại thực bào đóng vai trò như một tế bào hiệu ứng (effector cell), tiêu diệt tế bào ung thư qua nhiều cơ chế khác nhau: các phân tử trung gian có tính oxy hóa (ROI-Reactive Oxygen Intermediates ) như H20 2, OBr, NO,..; các enzyme (protease, arginase,..)- - 22 - 1.3.3. Suy giảm miễn dịch trong ung thư Hệ miễn dịch có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại ung thư. Tuy nhiên, thực tế là các khối u vẫn phát triển, xâm lấn và di căn. Như vậy, đáp ứng miễn dịch của cơ thể là không đủ hoặc khối u đã lẩn tránh và thậm chí đàn áp đáp ứng miễn dịch [20],[43]. Khối u lẩn tránh đáp ứng miễn dịch bằng cách làm giảm biểu hiện kháng nguyên: hoặc biểu hiện các kháng nguyên có tính sinh miễn dịch kém, hoặc phát triển các phân tử che dấu kháng nguyên (như sialomucin). Các tế bào ung thư lẩn tránh hệ miễn dịch ngay từ giai đoạn phát triển tại chỗ (insitu stage). Còn khi đã hình thành u thì khối u lớn sẽ phát triển các cơ chế ức chế hệ miễn dịch. Tình trạng suy giảm miễn dịch trong ung thư (trên thực nghiệm cũng như ở người) đã được nhiều tác giả nghiên cứu và thường là suy giảm miễn dịch tế bào. Sự suy giảm này được thể hiện dưới nhiều hình thức: giảm số lượng các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, giảm đáp ứng tăng sinh và chuyển dạng lympho bào, giảm khả năng gây độc tế bào, giảm sản xuất cytokin,...Sự suy giảm này được quan sát thấy cả ở các tế bào máu ngoại vi cũng như ở các tế bào miễn dịch thâm nhiễm vào khôi u. Trên lâm sàng, tình trạng suy giảm này thường đi kèm với tiến triển cua bệnh, tái phát hoặc di căn . Bảng 1.3 tóm tắt các thông số đánh giá chức năng miễn dịch qua trung gian tế bào. Khối u khi đã đạt đến kích thước nhất định, không còn khả năng che dấu kháng nguyên thì lại phát triển nhiều cơ chế đàn áp hệ miễn dịch. Khối u chế tiết prostaglandin, nitric oxid có tác dụng ức chế miễn dịch. Một số khối u chế tiết các cytokin tác dụng kiểu autocrine kích thích tế bào ung thư phát triển như yếu tố kích thích chuyển dạng beta (TGF p - Tranforming Growth Factor Beta). - 23 - Bảng 1.3. Các thông số đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào trong ung thư (Theo Harvey W.Baker-1986) [32]. In vivo Test quá mẫn muộn với Tuberculin kháng nguyên (test da) Candida Dinitrochlorobenzen (DNCB) Kháng nguyên ung thư In vitro Số lượng tế bào máu ngoại vi Tổng số tế bào lympho Các dưới nhóm lympho, các tế bào đơn nhân Test thử nghiệm chức năng Đáp ứng chuyển dạng với PHA, EL2. của tế bào Lympho Test gây độc vói tế bào ung thư Thử nghiệm ức chế di chuyển bạch cầu Thử nghiệm ức chế khả năng kết dính của bạch cầu Khả năng sản xuất cytokin Khả năng sản xuất kháng thể Một số khối u có khả năng chế tiết các cytokin type n như DL-10, làm thay đổi cân bằng giữa cytokin type I và type n, ức chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào- đáp ứng miễn dịch quan trọng chống lại khối u, dẫn đến đáp ứng miễn dịch thể dịch là chủ yếu. Đôi khi các kháng thể lưu hành trong máu lại là yếu tố - 24 - tạo thuận cho khối u phát triển. Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có nhũng kháng thể gắn với kháng nguyên ung thư nhưng không liên kết với bổ thể để ly giải tế bào u, không gắn với các thụ thể của Fc để tiêu diệt tế bào u thông qua phản ứng độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), che dấu sự nhận diện kháng nguyên bởi các tế bào Tc. 1.4. Miễn dịch trị liệu trong ung thư (Immunotherapy) 1.4.1.Mục đích của miễn dịch trị liệu Dựa trên lý thuyết về cảnh giác miễn dịch, miễn dịch tri liệu trong ung thư được Bumet khởi xướng từ năm 1957 nhằm mục đích : • ức chế trực tiếp sự phát triển của tế bào u và các vi di căn. • Ngăn ngừa, làm giảm suy tủy hoặc phục hồi lại hoạt động của tủy xương sau hóa trị liệu hoặc xạ trị. • Tăng cường đáp ứng miễn dịch chống lại các nhiễm trùng cơ hội. Cho đến nay, nhiều liệu pháp miễn dịch đã và đang được nghiên cứu áp dụng vào điều tri ung thư bên cạnh các phương pháp khác như phẫu thuật, hóa chất, tia xạ. Nhiều chất kích thích miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu ra đời, đồng thòi mô hình kết hợp phẫu thuật, hóa chất, miễn dịch (Immunochemosurgery) được áp dụng rộng rãi đã cải thiện đáng kể hiệu quả điều trị ung thư. Các liệu pháp miễn dịch điều tri ung thư được tóm tắt trong bảng 1.4 - 25 - Bảng 1.4. Tóm tắt các liệu pháp miễn dịch điều tri ung thư (Theo Ivan Roitt-1998 [43]) Chủ động Không đặc hiệu BCG, Levamisole, Aslem (Active) Đặc hiệu Vaccin chống ung thư Không đặc hiệu Tế bào LAK trị liệu, cytokin trị liệu Bị động Đặc hiệu Phức hợp thuốc gắn kháng thể đặc hiệu (Passive) Hỗn hợp Tế bào LAK gắn kháng thể 1.4.2.Cơ chế chung của các thuốc kích thích miễn dịch Có nhiều biện pháp điều trị miễn dịch trong ung thư đã được ứng dụng trên lâm sàng, trong đó việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu được coi là có tác dụng hỗ trợ cho các phương pháp điều trị chính thống. Các chất kích thích miễn dịch là những chất làm tăng về số lượng hay chất lượng hoặc cả hai của các thành phần trong hệ thống miễn dịch. Mỗi chất kích thích miễn dịch có cơ chế tác động riêng, nhưng nhìn chung cơ chế tác động của chúng là có tác dụng: • Thúc đẩy quá trình phát triển và biệt hóa của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch. • Hoạt hóa chức năng của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch. • Điều chỉnh lại mối quan hệ điều hòa giữa các tế bào miễn dịch theo chiều hướng có lợi cho cơ thể. - 26 - 1.4.3. Aslem Tại Việt nam, Aslem (Glycyl Funtumin Hydroclorid) là một aminoacyl steroid được tổng hợp toàn phần tại Bộ môn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà nội và đã được sử dụng như một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu. Tên khoa học: N-(aminoetanoyl)-3a-pregnan-20-on hydroclorid Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Aslem Năm 1958, Khương Hữu Quý và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được một steroid có tên là Funtumin từ lá cây Funtumia latifolia Stapf.(Apocynaceae) có nguồn gốc ở châu Phi [58]. Sau đó, Nguyễn Đăng Tâm (1967) đã bán tổng hợp Glycyl Funtumin HBr từ Funtumin tại Viện Nghiên cứu hóa học các hợp chất tự nhiên ở Gif-Sur-Yvette (Cộng hòa Pháp) và đặt tên là LH1 [59]. Năm 1977 Đặng Hanh Phức và cs cũng đã bán tổng hợp được Glycyl Funtumin H ơ tại Việt nam và đặt tên là Aslem. Năm 1982, nhờ tổng hợp thành công Funtumin tại khoa Hóa trường Đại học Tổng hợp Leiden (Hà Lan), Glycyl Funtumin HC1 đã được tổng hợp toàn phần tại Labo tổng hợp thuốc của trường Đại học Dược Hà nội do tổ chức NUFFIC tài trợ. Hiện nay, các nghiên cứu sản xuất Aslem đã được hoàn -27- thiện, chế phẩm đã được Cục quản lý Dược cấp số đăng ký lưu hành trên thị trường Việt nam [5]. Tác dụng kích thích miễn dịch của Glycyl Funtumin đã được chứng minh qua một số thử nghiệm sinh học tiến hành ở trong và ngoài nước [6],[7],[14],[16], [26],[29],[40],[57]. Aslem đã được nghiên cứu về tác dụng kích thích miễn dịch trên thử nghiệm Jeme Cunningham [6],[17],[57], đánh giá khả năng kích thích miễn dịch tế bào trên test phục hồi tạo Rosette E bị ức chế bởi Theophylline [6],[14], tác dụng hoạt hóa đại thực bào và ảnh hưởng lên chức năng thực bào của đại thực bào [9],[16], tác dụng lên sự chuyển dạng bạch cầu lympho [7], tác dụng lên màng hồng cầu và lyzosome [1], tác dụng tăng sức đề kháng chống nhiễm khuẩn invitro và tác dụng đối với mẫu viêm phúc mạc thực nghiệm do trực khuẩn mủ xanh kháng kháng sinh [2],[17]. Kết quả thử độc tính cấp, bán cấp, bán trường diễn của Aslem cũng đã được công bố [10],[11]. Trên lâm sàng ung thư, Aslem đã được sử dụng từ hơn 20 năm nay và cho những kết quả rất đáng khích lệ. Tôn Thất Tùng và cs (1973) đã sử dụng LH1 điều trị bổ trợ ung thư gan nguyên phát sau phẫu thuật cắt gan hoặc thắt động mạch gan, kết quả cho thấy điều trị bổ trợ LH1 đã tăng rõ rệt thời gian sống thêm sau mổ của các bệnh nhân giai đoạn Duke m [52],[62]. Hoàng Đình Cầu, Nguyễn Đình Kim, Nguyên Việt Cồ và cs nghiên cứu sử dụng phác đồ điều trị miễn dịch LH1 phối hợp với vitamin c liều cao và tam thất sau mổ ung thư phế quản nguyên phát thấy rằng tỷ lệ sống thêm sau mổ 6 tháng, 1 năm, 2 năm ở 31 bệnh nhân được điều trị miễn dịch cao hơn rõ ràng so với nhóm 47 bệnh nhân không được điều trị miễn dịch, chỉ cắt khối u. Trong số 10 bệnh nhân được điều trị miễn dịch và 20 bệnh nhân không được điều tri miễn dịch được theo dõi lâu dài thì tỷ lệ sống thêm sau 3 năm ở nhóm được điều trị là 7/10 (70%) trong khi đó tỷ lệ này là 6/20 (33%) ở nhóm không được điều tri, p = 0,056. Sau 4 năm, tỷ - 28 - lệ sống là 6/10 (60%) ở nhóm được điều tậ so với 4/20 (20%) ở nhóm không được điều trị, p = 0,045 [4],[12]. Cho đến nay, Aslem tiếp tục được sử dụng rộng rãi trên các ung thư đường tiêu hóa ở bệnh viện Việt Đức và Khoa Ngoại bệnh viện Saint-Paul, ung thư vú ở bệnh viện K, ung thư phế quản phổi ở viện Lao và bệnh phổi Trung ương. Tôn Đức Lang (1979) sử dụng LH1 và Aslem với tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu trong điều tri và ngăn ngừa nhiễm trùng ngoại khoa, làm tăng sức đề kháng với vi khuẩn, kết hợp với kháng sinh và các phương pháp ngoại khoa cho kết quả điều trị tốt [13]. Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu trên in vitro cũng như trên lâm sàng, cơ chế tác dụng của thuốc vẫn cần được tìm hiểu sâu hơn ở mức độ tế bào và phân tử. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này vói mong muốn làm sáng tỏ thêm phần nào cơ chế tác dụng của Aslem lên các tế bào miễn dịch. - 29 - PHẦN 2. 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Đối tượng nghiên cứu : Nghiên cứu được thực hiện trên hai nhóm : bệnh nhân ung thư đại trực tràng và người cho máu. A. Nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng Các bệnh nhân ung thư đại trực tràng được chẩn đoán và điều tri tại khoa Phẫu thuật Tiêu hóa Bệnh viện Việt Đức trong thời gian từ tháng 6 năm 2002 đến tháng 4 năm 2003. • Tiêu chuẩn lựa chọn - Tuổi dưới 80 - Không phân biệt về giới, nghề nghiệp và địa dư cư trú. - Được phẫu thuật cắt bỏ khối u. - Tổn thương ung thư được chẩn đoán xác định dựa vào kết quả giải phẫu bệnh • Tiêu chuẩn loại trừ - Trên 80 tuổi. - Đã điều trị hóa chất hoặc tia xạ trước phẫu thuật. - Không được phẫu thuật cắt bỏ khối u. - Được truyền máu trong quá trình điều tri. - Mắc các bệnh suy giảm miễn dịch khác như lao, AIDS... - 30 - B. Nhóm chứng Những người hiến máu tại khoa Huyết học và Truyền máu Bệnh viện Việt Đức. • Tiêu chuẩn lựa chọn - Tuổi và giới tương đương với nhóm bệnh nhân. - Không phân biệt nhóm máu, nghề nghiệp và địa dư cư trú. - Không mắc các bệnh cấp tính hoặc mãn tính tại thời điểm lấy máu (lao, AIDS, viêm gan B,..). 2.2. Phương pháp nghiên cứu Là nghiên cứu tiến cứu. Tác dụng kích thích miễn dịch của Aslem được nghiên cứu in vitro dựa trên khả năng chuyển dạng và chế tiết cytokin của tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC-Peripheral Blood Mononuclear Cell) ở hai nhóm : bệnh nhân ung thư đại trực tràng và nhóm chứng là những người cho máu có cùng phân bố tuổi và giới. Thử nghiệm được chia thành 2 lô: • Lô chứng : môi trường có PHA (3|ig/ml) • Lồ thử: môi trường có PHA (3|^g/ml) và Aslem nồng độ (0,15 ịig/ml) Cụ thể các bước tiến hành như sau: 2.2.1. Ghi nhận thông tin và lấy mẫu A. Nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng - Bệnh nhân nhập viện được ghi nhận thông tin tuổi, giói, khám lâm sàng, các xét nghiệm huyết học, sinh hóa, chẩn đoán hình ảnh . - Ghi nhận mô tả tổn thương, cách thức phẫu thuật của phẫu thuật viên cũng như xét nghiệm đại thể và vi thể của khối u, hạch phẫu tích. -31 - - Phân loại giai đoạn bệnh theo hệ thống phân loại Duke [8] • Dukes A : ung thư ở lớp niêm mạc, dưới niêm hoặc ăn xuống lớp cơ của đại trực tràng. • Dukes B: ung thư đã ăn xuống tới thanh mạc hoặc qua thanh mạc nhưng chưa di căn. • Dukes C: đã có di căn (hạch vùng hoặc di căn xa). - Lấy 6 ml máu tĩnh mạch cánh tay sau phẫu thuật vào tube chống đông bằng Heparin. PBMC được tách và nuôi cấy trong vòng 3 giờ kể từ khi lấy máu. B. Nhóm chứng - Ghi nhận các thông tin về tuổi, giới, xét nghiệm huyết học. - Lấy 6 ml máu tĩnh mạch cánh tay vào tube chống đông bằng Heparin. PBMC được tách và nuôi cấy trong vòng 3 giờ kể từ khi lấy mẫu. 2.2.2. Tách và nuôi cấy PBMC PBMC được tách khỏi máu chống đông Heparin, nuôi cấy trong môi trường RPMI .1640 có 20% FCS trong 48 giờ ở điều kiện 37°c và 5% C02. Cụ thể tiến hành như sau: • Tách PBMC bằng phương pháp ly tâm chênh lệch tỷ trọng (Density gradient centrifugation) [45] - Pha loãng máu chống đông với dung dịch RPM I1640 (Gibco) tỷ lệ 1:1. - Hút 3 ml máu đã pha loãng cho chảy nhẹ nhàng theo thành ống nghiêm vào ống nghiệm 5ml (Grenier Bio-one) đã chứa sẵn 1 ml dung dịch Ficoll Hypacque (tỷ trọng 1,077; PTL 400 000; Lymphoprep™), tạo thành 2 lớp rõ rệt. - 32 - - Ly tâm 2500 vòng/phút trong 20 phút ở 4°c (máy Beckman Avanti 30 - EuropContinent, Rotor S0410), sẽ xuất hiện 4 lớp rõ rệt : dưới cùng là hồng cầu và bạch cầu đa nhân, rồi đến khối Ficoll, trên bề mặt Ficoll là một lớp màng tế bào màu trắng (còn gọi là đám mây tế bào) và trên cùng là huyết tương (hình 6) w (Chất béo) - Hút nhẹ nhàng lớp tế bào trắng sang ống nghiệm SERUM/media (Huyết thanh.) khác, rửa 2 lần bằng dung dịch RPMI (mỗi lần rửa PBMC - Đếm số lượng tế bào trên buồng đếm bạch cầu. ly tâm 1800 vòng/phút 4°c trong 10 phút). RC0LL-HỈPầOU£ RfM AT jN W HF EIN CG EU3 m&mjLS Hình 2.1. Sự tách lớp tế bào bằng phương pháp ly tâm chênh lệch tỷ trọng Hổag cầu và bạcbL cẩu đa ataâa • Nuôi cấy tế bào PBMC theo tài liệu của Shigenori Goto 1999 [31] Mỗi mẫu được cấy thành 2 lô: lô có Aslem 0,15|ig/ml và lô chứng không có Aslem. Mỗi lô cấy 3 giếng (sử dụng plate 12 giếng nuôi cấy của Nunc). Thành phần có trong mỗi giếng được mô tả trong bảng 2.1. -33- Bảng 2.1. Thành phần của một giếng nuôi cấy Lô 1 Lô 2 PHA 3p.g/ml PHA 3pg/ml + Aslem 0,15p,g/ml - lml RPMI20% FCS - lml RPMI20% FCS - 1 X 106tế bào PBMC 1 X 106tế bào PBMC - - 3|il dung dịch PHA lmg/ml - 3|il dung dịch PHA lmg/ml - 0.5 |Lil dung dịch Aslem 0,3mg/ml Tế bào được nuôi cấy 48 giờ trong điều kiện 37°c 5% C02 luôn được làm ẩm sử dụng tủ cấy C02 Incubator (Sanyo). 2.2.3. Thu hoạch môi trường và tế bào sau 48 giờ nuôi cấy - Gộp dung dịch nước nổi nuôi cấy tại 3 giếng của mỗi lô và bảo quản trong các ống Eppendoff ở -70°c đến khi sử dụng. - Gộp tế bào tại 3 giếng nuôi cấy lên lam kính, để khô tự nhiên sau đó nhuộm Giemsa xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng. 2.2.4. Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng. - Cố định tế bào trên các lam bằng cồn tuyệt đối, để khô tự nhiên. - Nhỏ thuốc nhuộm Giemsa lên mặt lam kính, để 15 phút, rửa, để khô tự nhiên. - Xác định tỷ lệ tế bào chuyển dạng trên kính hiển vi với độ phóng đại 10x100. - Tỷ lệ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trên 100 tế bào được đếm. - 34 - 2.2.5. Định lượng cytokỉn trong môi trường nuôi cấy - Các mẫu nước nổi nuôi cấy tế bào bảo quản ở -70°c được để tan tự nhiên ở nhiệt độ thường trước khi định lượng. - Cytokin trong môi trường nuôi cấy được định lượng bằng kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzyme, ELISA (Enzym linked immunosorbant assay). - Các bước định lượng được tiến hành theo quy trình định lượng của hãng. Nguyên tác kỹ thuât ELISA đinh lương cvtokin Phản ứng ELISA định lượng cytokin được tiến hành theo kỹ thuật Sandwich ứng dụng để định lượng cytokin trong huyết thanh, dịch nuôi cấy tế bào và các dịch sinh học khác. Kháng thể đơn dòng kháng cytokin được gắn trên pha rắn (thành giếng định lượng). Kháng nguyên cytokin trong môi trường nuôi cấy gắn đặc hiệu với kháng thể trên pha rắn, sau khi rửa, cho thêm kháng thể thứ 2 gắn Biotin tạo thành phức hợp KT-KN-KT-Biotin. Enzym oxy hóa được gắn lên phức hợp thông qua liên kết Biotin-Streptavidin tạo phức hợp KT-KN-KT-BiotinStreptavidin-HRP (Horse Radish Peroxydase) gắn trên thành ống nghiệm. Phức hợp được phát hiện nhờ phản ứng giữa cơ chất và TMB (TetraMethylBenzidine) tạo sản. phẩm màu xanh, chuyển thành màu vàng ở môi trường acid. Đo quang ở bước sóng 450nm, cường độ màu tỷ lệ với lượng cytokin cần xác định trong dịch nuôi cấy tế bào. Kit được sử dụng để định lượng IL-4, IL-10, IFNy là các kit có độ nhạy cao (high sensitivity), sử dụng chất mang là Amdex, một chất được cấu tạo bởi một chuỗi Dextran mạch thẳng có gắn hàng trăm phân tử HRP và khoảng 10 phân tử Streptavidine. Amdex cho phép phát hiện các cytokin ở nồng độ rất thấp nhờ khả năng khuyếch đại tín hiệu. - 35 - Hình 2.2. Nguyên tắc kỹ thuật ELISA 1: pha rắn ị thành giếng định lượng) 2: kháng thể thứ nhất gắn lên pha rắn 3: kháng nguyên (cytokin) 4: kháng thể thứ hai gắn biotin 5: biotin 6: streptavidin 7: men oxy hóa 8: đo quang Định lượng IL-4, IL-10, IFNy được tiến hành theo kỹ thuật Sandwich 2 giai đoạn với các kit có độ nhạy cao của hãng Amersham Biosciens. IL-2 được định lượng bằng kỹ thuật Sandwich 1 giai đoạn của cùng hãng Amersham Biosciens . - 36 - 2.2.6. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê y học vói sự trợ giúp của phần mềm SPSS 10.0 - Thống kê mô tả được biểu diễn dưới dạng trung bình ±độ lệch chuẩn đối với các biến số phân bố chuẩn, trung vị (median) đối với các biến số không tuân theo phân bố chuẩn, giá trị lớn nhất, giá trị nhỏ nhất, tỷ lệ phần trăm. - So sánh giá tri trung bình của các mẫu sử dụng test T Student đối với các biến phân bố chuẩn, sử dụng test u Mann-Whitney với số liệu không tuân theo phân bố chuẩn.So sánh các tỷ lệ sử dụng test %2. - Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05 PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Từ tháng 6 năm 2002 đến tháng 4 năm 2003 có 21 bệnh nhân và 12 người bình thường khoẻ mạnh tham gia vào nghiên cứu, trong đó có 4 bệnh nhân bị loại khỏi nhóm nghiên cứu do phải truyền máu trong quá trình phẫu thuật. 3.1. Đặc điểm của nhóm bệnh và nhóm chứng Hai nhóm nghiên cứu đã được khảo sát về đặc điểm dịch tễ học (bảng 3.1) và các thông số miễn dịch trong máu ngoại vi (bảng 3.2). Bảng 3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân và nhóm chứng Bệnh nhân Nhóm chứng (n=17) (n=12) 50,7+2,4.(24-5-70) 48,4+3,7 (41 - 57) 0,765* Nam 12 (70,6 %) 8 (66,7 %) 0,822** Nữ 5 (29,4 %) 4(33,3 %) Đại tràng 7 (41,2%) Trực tràng 10 (58,8%) Giai đoạn Duke A-B 7 (41,2%) Tuổi p Giới Vị trí u bệnh Duke c 10 (58,8%) * So sánh sử dụng test T Student. ** So sánh sử dụng test khi bình phương Nhân x ét: - Sự phân bố theo tuổi và giói giữa nhóm bệnh và nhóm chứng là tương đối đồng đều và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). - Trong số 17 bệnh nhân nghiên cứu có 10 bệnh nhân ung thư trực tràng (58,8%) và 7 bộnh nhân ung thư đại tràng (41,2%) bao gồm 1 ung thư đại tràng trái, 2 ung thư đại tràng phải và 4 ung thư đại tràng sigma. - Có 1 bệnh nhân ở giai đoạn Duke A; 6 bệnh nhân ở giai đoạn Duke B và 10 ở giai đoạn Duke c. Bảng 3.2. Các thông số miễn dịch trong máu ngoại vi Bạch cầu (106tb/cm3) Bệnh nhân Nhóm chứng (n=17) (n=12) 8,5 ±3,8 (4,6 4-16,7) 7,2 ±2,1 (4,4+ 9,8) p 0,304* Tỷ lệ lymphocyte (%) 23,9 ± 9,8 (11 -ỉ- 50,3) 29,8 ±8,3 (17,3-46,7) 0,109* Số lượng lymphocyte (106tb/cm3) CEA (ng/ml) 2,1 ±0,7 (1,3-3,9) 4(1-177)** 2,2 ±1,1 (1,1 - 4,4) 0,618* - * So sánh sử dụng test T Student ** Nồng độ CEA trong máu không tuân theo phân bố chuẩn nên được biểu diễn theo trùng vị của mẫu. Tri số trong ngoặc là giá tri lớn nhất và nhỏ nhất của mẫu. Nhân x ét: Các kết quả ở bảng 3.2 cho thấy - Số lượng bạch cầu ở nhóm bệnh nhân hơi cao hơn nhóm chứng (8,5 so với 7,2) tuy nhiên tỷ lệ lymphocyte lại thấp hơn so với nhóm chứng (23,9% với 29,8%). Số lượng lymphocyte ờ hai nhóm tương đương nhau và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). - Nồng độ CEA trong máu bệnh nhân phân bố tương đối rộng (1 H-177), 11 bệnh nhân (64,7%) có nồng độ CEA < 10ng/ml, 6 bệnh nhân (35,3%) có nồng độ CEA tăng cao >10 ng/ml. 3.2. Tỷ lệ chuyển dạng tế bào lympho sau 48 giờ nuôi cấy Sau 48 giờ nuôi cấy, tế bào PBMC trong 3 giếng của mỗi lô được gộp chung lại, nhỏ trên lam kính, để khô rồi nhuộm Giemsa. Tế bào chuyển dạng được quan sát và xác định trên kính hiển vi với độ phóng đại 100x10 (hình 3.1), đó là các tế bào lớn hơn tế bào bình thường, có thể quan sát thấy nhiều hạt trong bào tương. Tỷ lộ tế bào chuyển dạng là số tế bào chuyển dạng trong số 100 tế bào được đếm. Bảng 3.3. Tỷ lệ chuyển dạng tế bào của PBMC sau 48h nuôi cấy (%) Bệnh nhân (n=17) Nhóm chứng (n=12) Lô 1 Lô 2 PHA 3|ig/ffil PHA 3|Ẳg/ml+Aslem 0,15|j.g/ml (1) 21,6±7,8 (11 -ỉ- 38) (3) 33,6± 8,2 (21 - 56) (2) 26,7±5,9 (18-Ỉ-40) (4) 36,3±7,5 (26-54) p 1_2= 0,05 p J.3 < 0,001 ỹ 3A = 0,367 p 2.4 = 0,002 * Kết quả trong bảng là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (nhỏ nhất -ỉ- lớn nhất), so sánh 2 giá trị trung bình theo test T Student. Nhân xét: - Đáp ứng chuyển dạng ở nhóm bệnh có xu hướng thấp hơn so vói nhóm chứng khi không có Aslem trong môi trường nuôi cấy (Pj.2 = 0,05). - Đáp ứng chuyển dạng ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng khi có Aslem cao hơn có ý nghĩa so với không có Aslem (p !_3< 0,001 ở nhóm bệnh, p 2-4 = 0,002 ở nhóm - 40 - chứng). - Đáp ứng chuyển dạng ở nhóm bệnh thấp hon không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng trong môi trường có Aslem (p 3.4= 0,367). 3.3. Nồng độ cytokin trong nước nổi nuôi cấy Các cytokin được lựa chọn trong nghiên cứu này là IL-2, IFNy, IL-4, IL-10, được định lượng theo kỹ thuật Sandwich một và hai giai đoạn, sử dụng kit của Amersham Biosciens. Nồng độ các cytokin trong môi trường nuôi cấy phân bố khá rộng, không tuân theo phân bố chuẩn. Vì vậy, chúng tôi sử dụng giá trị trung vị để đại diện cho mẫu. Các phép so sánh sử dụng test u MannWhitney. Nồng độ cytokin type I trong các môi trường nuôi cấy được thể hiện qua bảng 3.4 và 3.5. Bảng 3.4. Nồng độ EL-2 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào Bệnh nhân (n=17) Nhóm chứng (n=12) Lô 1 Lô 2 PHA 3ịj.g/ml PHA 3|ig/ml +Aslem 0,15|ig/ml (1) 98,4 (51,1-5-132) (3) 105,6 (52,0 H-129,3) (2) 104,3 (80,2-5-125,6) (4) 114,3 (56,6-ỉ-123,8) p !_2= 0,18 p 1-3 = 0,563 p 3-4= 0,74 p 2.4 = 0,298 Nhân x ét: - Nồng độ IL-2 khi không có Aslem ở nhóm bệnh nhân có xu hướng giảm so -41 - I vói nhóm chứng (98,4 so với 104,3), p !_2 = 0,18. - Sự khác biệt về nồng độ IL-2 khi có Aslem và không có Aslem ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng đều không có ý nghĩa thống kê (p J.3 = 0,563 vói nhóm bệnh, p 2_4= 0,298 với nhóm chứng). Bảng 3.5. Nồng độ IFNy (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào Bệnh nhân (n=17) Nhóm chứng (n=12) Lô 1 Lô 2 PHA 3ịig/ml PHA 3ịj.g/ml +Aslem 0,15ịu.g/ml (1) 68,2 (43,3 - 1983,1) (3) (2) 70,8 (48,1-292,0) (4) 57,7 (52,5 4-132,8) p 1-2= 0,948 p 1-3 = 0,683 p 3.4 = 0,347 p 2-4 = 0,887 64,3 (45,5-2126,2) Nhân x ét: - Khi không có Aslem, chúng tổi không thấy có sự khác biệt về nồng độ IFNy giữa nhóm bệnh và nhóm chứng, p ^2= 0,948. - Sự khác biệt về nồng độ IFNy khi có và không có Aslem ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng đều không có ý nghĩa thống kê p2-4= 0,887 với nhóm chứng). - 42 - (Pj.3 = 0,683 với nhóm bệnh, # 0 % A % ® 0 0 • • Hình 3.1. Hình ảnh chuyển dạng tế bào lympho. Cấc tế bào đánh số 1 được đọc là chuyển dạng. Cắc tế bào đánh số 0 được đọc là chưa chuyển dạng. - 43 - Phân bố nồng độ IL-2 và IFNy được mô tả trong hình 3.2. Gạch ngang thể hiện giá trị trung vị của mẫu. IL-2 (ịỊgảul) IL-2 (pg.mi) 140°"1 NUóm clxứu.2 « 50.D- 0 Jữ ' Aslem(-) IFN gamma (pg/uxi) IFN gaaiuia (p$/ml) 2mô-r ÀsleiìiB*) Bệtili alỉáa Niióm cliứua; ÍS0.0' 2000.01500.0' 0JI V" Asleiii(-) Asleiu.(+) AsleuU -) AslemH) Hình 3.2. Nồng độ IL-2 và IFNy trong nước nổi nuôi cấy PBMC - 44 - Xu hướng tác dụng của Aslem lên sự chế tiết cytokin được đánh giá thông qua sự tăng giảm nồng độ cytokin trong môi trường nuôi cấy có Aslem so với không có Aslem. Bảng 3.6 thể hiện xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type I dưới tác dụng của Aslem theo số lượng và tỷ lệ (%) cắc mẫu biến đổi. Bảng 3.6. Xu hướng biến đổi nồng độ cytokin type I dưói tác dụng của Aslem Xu hướng Bệnh nhân n=17 Nhóm chứng n=12 IL-2 IFNy biến đổi n % n % Tăng 7 41,2 6 35,3 Không thay đổi 5 24,9 9 52,9 Giảm 5 24,9 2 11,8 Tăng 7 58,3 4 33,3 Không thay đổi 2 16,7 2 16,7 Giảm 3 25 6 50 Theo quv ước chung trong miễn dịch học, nồng độ cytokin biến đổi > 10% được coi là có ý nghĩa, chênh lệch nồng độ nhỏ hơn 10% được coi là không thay đổi. Nhân x ét: - Trong số 17 mẫu nuôi cấy PBMC của bệnh nhân ung thư ĐTT, Aslem làm tăng chế tiết JL-2 ở 7 mẫu (41,2%) và tăng IFNy ở 6 mẫu (35,3%). - Trong số 12 mẫu nuôi cấy PBMC của người khỏe mạnh, Aslem làm tăng chế tiết IL-2 ở 7 mẫu (58,3%) và tăng IFNy ở 4 mẫu (33,3%)- - Có một số mẫu không đáp ứng vói Aslem và một số mẫu giảm chế tiết IL-2, IFNy khi có thêm Aslem trong môi trường nuôi cấy. Nồng độ cytokin type n trong các môi trường nuôi cấy được thể hiện qua bảng 3.7 và 3.8 . Bảng 3.7. Nồng độ IL-4 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào Bệnh nhân (n=17) Nhóm chứng (n=12) Lô 1 Lô 2 PHA 3ịj.g/ml PHA 3ịig/ml +Aslem 0,15p,g/ml (1) 40,2 (32,7-5-47,2) (3) 37,4 (28,1 - 215,7) (2) 36 (4) 36,5 (26,7 (27,1-48,1) Pl.2= 0,069 p 1.3 = 0,150 p 3_4= 0,556 p 2-4= 0,799 225,5) Nhân x ét: - Khi không có Aslem, nồng độ IL-4 có xu hướng tăng cao ở nhóm bệnh nhân so với nhóm chứng (p J.2= 0,069). - Khi có Aslem, nồng độ IL-4 không khác biệt giữa nhóm bệnh và nhóm chứng (p3_4= 0,556). - Nồng độ IL-4 khi có và không có Aslem ở nhóm bệnh và nhóm chứng khác biệt không có ý nghĩa thống kê = 0,15 vói nhóm bệnh, p2_4 = 0,799 vói (P j.3 nhóm chứng). - 46 - Bảng 3.8. Nồng độ EL-10 (pg/ml) trong môi trường nuôi cấy tế bào Bệnh nhân (n=17) Nhóm chứng (n=12) Lô 1 Lô 2 PHA3ịig/ml PHA 3[j.g/ml +Aslem 0,15ịj,g/ml (1) 148,1 (45,9 - 530,2) (3) 145,9 (35,8 - 508,4) (2) 47,4 (30,5-5-197,2) (4) 55,6 (28,1 - 242,1) p J_2 = 0,003 p 1.3 = 0,643 p 3-4= 0,043 p 2.4 = 0,755 Nhân xét: - Khi không có Aslem, nồng độ IL-10 ở nhóm bệnh tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (pt_2= 0,003). - Khi có Aslem, nồng độ IL-10 ở nhóm bệnh cao hơn nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p3_4= 0,003). - Sự khác biệt về nồng độ IL-10 khi có và không có Aslem không có ý nghĩa thống "kê ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng (Pi.3 = 0,643 vói nhóm bộnh, P2-4= 0,755 với nhóm chứng). Phân bố nồng độ IL-4 và EL-10 được mô tả trong hình 3.3. Gạch ngang thể hiện giá trị trung vị của mẫu. IL-4 {pgầiii) IL-4 (pg/mi) Nlióiii clúnia: 200 .0 ' 150 1D0D' 50.0 ‘ _ ^r I* 0.D< Asleiu[...]... nguyên ung thư In vitro Số lượng tế bào máu ngoại vi Tổng số tế bào lympho Các dưới nhóm lympho, các tế bào đơn nhân Test thử nghiệm chức năng Đáp ứng chuyển dạng với PHA, EL2 của tế bào Lympho Test gây độc vói tế bào ung thư Thử nghiệm ức chế di chuyển bạch cầu Thử nghiệm ức chế khả năng kết dính của bạch cầu Khả năng sản xuất cytokin Khả năng sản xuất kháng thể Một số khối u có khả năng chế tiết các cytokin. .. gen và tổng hợp protein; các yếu tố hoại tử khối u (TNF: Tumor Necrosis Factor) gây chết tế bào mà không làm thay đổi biểu hiện gen • Vé pham vi tác dung: Các cytokin thể hiện tác dụng lên những tế bào lân cận (tác dụng kiểu paracrine), tác dụng lên chính tế bào tiết ra cytokin đó (tác dụng kiểu autocrine), ít khi gây tác dụng toàn thân (systemic) nghĩa là tác dụng lên những tế bào của các cơ quan ở. .. ức chế sự phát triển và biệt hóa của dòng tế bào Thl, ức chế sự tổng hợp và chế tiết của IL2 và EFNy, ức chế biểu hiện của phức hợp hòa họp tổ chức lóp n (MHC n), các phân tử đồng kích thích trên ĐTB và các tế bào trình diện kháng nguyên Ngược lại, IL-10 kích thích sự phát triển và họat hóa chức năng của tế bào lympho B Do có khả năng ức chế tế bào lympho Thl và các bạch cầu đơn nhân khác, IL-10 có... tế bào Tc là T CD8+, tế bào T CD4+ chiếm khoảng 10% Tế bào T CD8+nhận diện kháng nguyên trình diện bởi MHCI b Tê bào NK (Natural Killer Cells) và tế bào K (Killer Cells) Các tế bào NK là những lymphocyte có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư mà không cần phải mẫn cảm trước Sau khi được hoạt hóa bởi IL2 và IFNy, tế bào NK có'thể ly giải được nhiều loại tế bào ung thư, kể cả những tế bào được coi là có... lympho B, đại thực bào, tế bào Mast; kích thích TCD4+ biệt hóa thành Th2 đồng thời kìm hãm sự phát triển của tế bào Thl, kích thích tế bào lympho B phát triển, biệt hoá và chế tiết Ig, chủ yếu là IgE ; ức chế độc tính của đại thực bào, ức chế sự hoạt hóa đại thực bào của IFNy IL-4 đối kháng tác dụng của phần lớn các cytokin type I - 16 - 1.2.7 Interleukin-10 (EL-10) IL-10 lần đầu tiên được, mô tả vào... cơ chế đặc hiệu và không đặc hiệu, cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào, trong đó miễn dịch qua trung gian tế bào đóng vai trò quan trọng nhất Các tế bào chính tham gia vào miễn dịch chống lại khối u bao gồm : Tc, NK và ĐTB a Tế bào T gây độc (Tc : Cytotoxic T Lymphocyte): Là những tế bào lympho T có khả năng nhận dạng và ly giải các tế bào biểu hiện kháng nguyên lạ Đa số các tế bào. .. ADN và dẫn đến apoptosis Tế bào T CD8+ tiêu diệt tế bào đích bằng cách giải phóng các hạt chứa perforin , Granzyme và thông qua Fas ligand Tế bào T CD4+ không có cấu tạo hạt, tiêu diệt tế bào đích thông qua Fas ligand Tế bào NK tiêu diệt tế bào đích thông qua giải phóng hạt chứa Perforin và Granzyme c Đại thực bào (Macrophage) Các đại thực bào có tính độc khá đặc hiệu với tế bào ung thư Tế bào lympho. .. mới có khả năng truyền túi hiệu vào nội bào, trong đó chuỗi y có tác dụng truyền tin Trong đáp ứng miễn dịch, IL-2 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình phát triển và biệt hóa các dòng tế bào lympho T đặc hiệu vói kháng nguyên Ngoài tác dụng autocrine lên chính tế bào tiết ra nó, DL-2 còn có tác dụng lên các tế bào lân cận (paracrine), kích thích gây độc tế bào (cytotoxicity) của các tế bào T... diệt kháng nguyên 1.1.3 Tế bào lympho B Tế bào lympho B đóng vai trò trung tâm trong đáp ứng miễn dịch thể dịch Tế bào lympho B lưu hành trong máu chưa có khả năng sinh kháng thể, chỉ khi có đáp ứng với sự kích thích của kháng nguyên thì mới phát triển và biệt hóa thành các tương bào (plasma cell) có khả năng tổng hợp và tiết kháng thể đặc hiệu Màng tế bào lympho B có thụ thể của lympho B (BCR: B Cell... chỉ có ở tế bào ung thư, không có ở tế bào bình thư ng - 18 - • Kháng nguyên liên kết với khối u (TAA - Tumor Associated Antigen) : là kháng nguyên có ở tế bào ung thư và một số tế bào thư ng 1.3.2.Đáp ứng miễn dịch chống lại khối u Các kháng nguyên TSA, TAA có thể bong ra khỏi màng tế bào ung thư, đổ vào tuần hoàn, gây ra đáp ứng miễn dịch chống lại khối u Cơ thể đáp ứng với kháng nguyên ung thư thông ... TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Đối tượng nghiên cứu : Nghiên cứu thực hai nhóm : bệnh nhân ung thư đại trực tràng người cho máu A Nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng Các bệnh nhân ung thư đại. .. bệnh nhân ung thư đại trực tràng vời hai mục tiêu cụ thể sau: Nghiên cứu tình trạng suy giảm miễn dịch bệnh nhân ung thư đại trực tràng thông qua khả chuyển dạng chế tiết cytokin tế bào lympho máu. .. muốn nghiên cứu sâu thêm dược lý miễn dịch lâm sàng Aslem ung thư đại trực tràng, tiến hành đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng Aslem lên khả chuyển dạng chê tiết cytokine tế bào lympho máu ngoại vi bệnh