ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------- Nguyễn Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN MMP-9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------- Nguyễn Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN MMP-9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Trịnh Hồng Thái TS. Đỗ Minh Hà Hà Nội – Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trịnh Hồng Thái, người thầy quan tâm, tận tình bảo, hướng dẫn suốt trình học tập thực luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc giúp đỡ nhiệt tình, ý kiến đóng góp quý báu dẫn tận tình TS. Đỗ Minh Hà suốt trình thực hoàn thành luận văn. Trong trình học tập, làm việc thực luận văn, nhận giúp đỡ ThS. Phạm Thị Bích, ThS. Nguyễn Thị Tú Linh, ThS. Lê Lan Phương bạn sinh viên làm việc Phòng Proteomics Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Trong trình thực luận văn, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ cán nhân viên thuộc khoa Tế bào Giải phẫu bệnh, bệnh viện K, Hà Nội; khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà Nội; khoa sàng lọc máu Viện Huyết học truyền máu Trung ương. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình làm luận văn này. Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên bên suốt thời gian qua. Hà Nội, tháng năm 2015 Học Viên Nguyễn Thị Như Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát ung thư đại trực tràng 1.1.1. Ung thư đại trực tràng .3 1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng 1.1.3. Chẩn đoán điều trị bệnh 1.1.4. Các giai đoạn UTĐTT .7 1.2. Matrix Metalloproteases (MMP) 10 1.2.1. Khái quát chung họ Matrix Metalloprotease (MMPs) . 10 1.2.2. Vai trò họ Matrix Metalloproteinase . 12 1.2.3. Một số nghiên cứu họ MMP ung thư đại trực tràng 16 1.2.4. Một số nghiên cứu đa hình đơn nucleotide gen MMP 17 1.2.5. Một số nghiên cứu đa hình vùng promoter gen MMP-9 19 CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 21 2.1 Nguyên liệu . 21 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2. Hóa chất 21 2.1.3. Thiết bị 22 2.2. Phương pháp tiến hành nghiên cứu . 22 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô 23 2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu . 24 2.2.3. Khuếch đại đoạn gen vùng promoter gen MMP-9 phương pháp PCR . 24 2.2.4. Phương pháp RFLP . 26 2.2.5. Điện di 26 2.2.6. Tinh sản phẩm PCR . 27 2.2.7. Giải trình tự trực tiếp . 28 2.2.8. Nhân dòng phân tử 28 2.2.9. Xử lý số liệu tính toán thống kê 32 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 33 3.1. Kết phân tích biến đổi gen MMP-9 từ mẫu mô bệnh nhân UTĐTT 33 3.1.1. Kết phân tích biến đổi gen MMP-9 kỹ thuật PCR-RFLP . 33 3.1.2. Kết giải trình tự trực tiếp nhân dòng . 35 3.2. Kết phân tích biến đổi ADN gen MMP-9 từ mẫu máu . 42 3.2.1. Kết khuếch đại đoạn gen có chứa vị trí biến đổi promoter gen MMP-9 . 42 3.2.2. Kết phân tích RFLP đoạn gen chứa biến đổi vùng promoter gen MMP-9 . 43 3.3. Phân tích mối liên hệ biến đổi C-1562T với số đặc điểm bệnh học bệnh nhân UTĐTT 44 3.4. Phân tích biến đổi C-1562T bệnh nhân UTĐTT người bình thường . 50 KẾT LUẬN . 53 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 54 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình ảnh đại trực tràng .3 Hình 2: Các giai đoạn bệnh UTĐTT Hình 3: Cấu trúc vùng MMP . 12 Hình 4: Chu trình nhiệt thực phản ứng PCR . 25 Hình 5: Vector plasmid pJET1.2 30 Hình 6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR promoter gen MMP-9 từ ADN tổng số tách từ mô . 33 Hình 7: Hình ảnh điện di kết cắt enzyme sản phẩm PCR từ ADN tổng số mô 34 Hình 8: Hình ảnh kết giải trình tự trực tiếp 36 Hình 9: Hình ảnh khuẩn lạc sau plasmid biến nạp vào E. Coli DH5α . 37 Hình 10: Hình ảnh điện di ADN plasmid tách từ E.Coli DH5α . 38 Hình 11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ plasmid sản phẩm cắt enzyme giới hạn 39 Hình 12: Kết phân tích trình tự plasmid 40 Hình 13: Kết so sánh trình tự mẫu không mang biến đổi với trình tự tham khảo sử dụng chương trình BLAST 41 Hình 14: Kết so sánh trình tự mẫu mang biến đổi với trình tự tham khảo sử dụng chương trình BLAST . 41 Hình 15: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ mẫu máu thường bệnh . 42 Hình 16: Hình ảnh cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR từ mẫu máu người bình thường cho máu mẫu máu bệnh nhân UTĐTT 43 Hình 17: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RE mẫu mô u-mô lân cận u mẫu máu bệnh nhân 44 Hình 18: Biểu đồ phân bố biển đổi C-1562T theo vị trí mô . 46 Hình 19: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo vị trí ung thư . 46 Hình 20:Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo độ tuổi . 47 Hình 21: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo giai đoạn TNM . 48 Hình 22: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T bệnh nhân UTĐTT người bình thường 50 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các giai đoạn bệnh TNM tỉ lệ sống sót giai đoạn bệnh khác Bảng 2: Bảng phân loại nhóm họ MMP (ở người) 11 Bảng 3: Hoạt động ảnh hưởng họ MMP tiến triển giai đoạn ung thư . 14 Bảng : Các hóa chất sử dụng nghiên cứu . 21 Bảng 5: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 6: Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR 25 Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR . 25 Bảng 8: Thành phẩn phản ứng cắt sử dụng enzyme giới hạn SphI . 26 Bảng 9: Thành phần phản ứng tạo đầu 29 Bảng 10: Thành phần phản ứng chèn sản phẩm PCR vào vector 29 Bảng 11: Thành phần phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi MP9 . 31 Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pJet1.2 31 Bảng 13: Phân bố biến đổi C-1562T promoter gen MMP-9 bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo số đặc điểm bệnh học bệnh 455 Bảng 14: Tần suất xuất alen C T đoạn ADN có chứa biến đổi promoter gen MMP-9 bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo số đặc điểm bệnh học bệnh 49 Bảng 15: Tần suất xuất alen C T đoạn ADN promoter gen MMP-9 mẫu mô bệnh nhân UTĐTT mẫu máu người bình thường . 50 Bảng 16: Tần suất xuất alen C T đoạn ADN promoter gen MMP-9 mẫu máu bệnh nhân UTĐTT mẫu máu người bình thường . 51 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic AFAP Actin Filament Associated Protein AJCC Ủy ban ung thư Mỹ - American Joint Committee on Cancer COPD Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính - Chronic Obstructive Pulmonary Disease cs Cộng ECM Chất ngoại bào - Extralcellular Matrix EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide FAP Đa polyp tuyến gia đình - Familial adenomatous polyposis FOBT Kiểm tra máu ẩn phân - Fecal occult blood test FISH Lai huỳnh quang chỗ - Fluorescence in situ hybridization HNPCC Ung thư đại trực tràng di truyền không đa polyp - Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer MMP Matrix Metalloproteinase NK Giết tự nhiên – Nature killer PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp - Polymerase Chain Reaction RFLP Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn - Restriction Fragment Length Polymorphism SDS Sodium dodecyl sulfate TBE Tris-Borate-EDTA TGF Yếu tố sinh trưởng kích thích chuyển dạng – Transforming growth factor TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinase UTĐTT Ung thư đại trực tràng VEGF Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu – Vascular Endothelial Growth Factor MỞ ĐẦU Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) loại ung thư phổ biến đứng đầu loại ung thư đường tiêu hóa nước giới. Tại Việt Nam nước châu Á, UTĐTT xếp thứ tư nam giới (sau ung thư gan, phổi dày) thứ ba nữ giới (sau ung thư cổ tử cung ung thư vú). Từ năm 2007 đến 2011, Việt Nam, tính riêng thành phố Hồ Chí Minh, ghi nhận 3557 ca mắc bệnh UTĐTT (chiếm 10,74% tổng số ca mắc bệnh ung thư) [52]. UTĐTT loại ung thư có độ ác tính cao đồng nghĩa với tỷ lệ tử vong cao. Tại Mỹ, năm 2013 ghi nhận tới 142820 ca UTĐTT chẩn đoán, có 50830 ca có khả dẫn đến tử vong sớm (chiếm 35,59% trường hợp mắc UTĐTT), năm 2014 thống kê có 136830 người mắc UTĐTT 50310 trường hợp tử vong (chiếm 36,77% trường hợp mắc UTĐTT) [53]. UTĐTT kết nhiều trình với giai đoạn phức tạp biến đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư liên quan tới gen gây ung thư, gen ức chế khối u vi môi trường khối u. Tương tác mô đệm biểu mô đóng vai trò quan trọng sinh bệnh học ung thư. Liên kết tế bào ung thư ác tính với mô đệm xung quanh (nguyên bào sợi, tế bào nội mô tế bào viêm) tảng cho phát triển di ung thư. Ngoài tế bào mô đệm bên khối u, ECM (extracellular matrix – chất ngoại bào) có tác động quan trọng tiến triển ung thư. ECM cấu tạo chủ yếu sợi protein liên kết cacbohydrat kết hợp với số chất vô hữu khác nhau. ECM thực loạt chức việc giúp tế bào liên kết với tạo nên mô định thu nhận thông tin. Tế bào ung thư tác động vào ECM làm thay đổi cấu trúc ECM, từ tế bào ung thư dễ dàng di chuyển từ u nguyên phát sang vị trí khác. Các protein ECM đóng vai trò quan trọng tăng sinh di tế bào ung thư, protease khác điều khiển tu sửa phân giải ECM. Một nhóm cụ thể protease matrix metalloproteinase (MMP) – enzyme phân giải protein có chứa kim loại ngày nghiên cứu rộng rãi giới Việt Nam [18]. KẾT LUẬN Từ kết thu được, rút số kết luận sau: 1. Đã tách chiết ADN tổng số khuếch đại thành công đoạn ADN promoter gen MMP-9 từ 99 cặp mẫu mô, 14 mẫu máu bệnh nhân ung thư đại trực tràng 30 mẫu máu người bình thường. 2. Sử dụng phương pháp PCR-RFLP giải trình tự ADN, xác định biến đổi C-1562T vùng promoter gen MMP-9 với tỷ lệ 19,39% bệnh nhân UTĐTT 30% người bình thường. Biến đổi thuộc loại biến đổi soma. 3. Biến đổi C-1562T không liên quan rõ rệt đến bệnh UTĐTT không phụ thuộc vào số đặc điểm bệnh học bệnh như: độ tuổi, giới tính, vị trí mô, kích thước khối u, giai đoạn bệnh, vị trí ung thư bệnh nhân (p>0,05). KIẾN NGHỊ Trong nghiên cứu biến đổi gen, số lượng mẫu lớn kết xác. Vì vậy, muốn tiếp tục phân tích đột biến, đa hình gen MMP-9 đối tượng bệnh nhân ung thư đại trực tràng với số lượng mẫu lớn để thu kết đánh giá xác tần suất mối liên hệ biến đổi gen MMP-9 với bệnh ung thư đại trực tràng Việt Nam. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Thị Ngọc Hà (2010), “Vai trò Matrix Metalloproteinae -2 yếu tố ức chế mô (Tissue inhibitor of Metalloproteinase-2) lâm sàng bệnh ung thư vòm mũi họng”, Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí Minh,14(4), tr. 115-122. 2. Lê Thị Huyền Trang (2012), “Đột biến gen Matrix Metalloproteinase bệnh nhân bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 16(1), tr. 54-57. Tài liệu Tiếng Anh 3. Anon (2010), “Colorectal Cancer Facts & Figures 2008-2010.” 4. Bendardaf R., Buhmeida A., Ristamaki R., Syrjanen K., Pyrhonen S. (2007), “MMP-1 (collagenase-1) Expression in Primary Colorectal Cancer and Its Metastases.” Scandinavian Journal Of Gastroenterology, 42(12), pp. 1473–78. 5. Bode W., Maskos K. (2001), “Structural Studies on MMPs and TIMPs”, Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.), 15, pp.145–77. 6. Brabletz T., Jung A., Dag S., Hlubek F., Kirchner T. (1999), “ΒCatenin Regulates the Expression of the Matrix Metalloproteinase-7 in Human Colorectal Cancer”, The American Journal of Pathology, 155(4), pp.1033–38. 7. Brown L. M., Fox H. L., Hazen S. A., Rannels S. R. (1997), “Role of the matrixin MMP-2 in muticellualar organization of adipocytes cultered in basement membrane components”, Am. J. Physiol., 272, pp.937–947. 8. Checa M., Pardo A. (2008), “MMP-1 Polymorphisms and the Risk of Idiopathic Pulmonary Fibrosis”, Human Genetics, 124(5), pp. 465–72. 9. Clapper M. L., Hensley H. H., Cooper H. S. (2011), “Detection of Colorectal Adenomas Using a Bioactivatable Probe Specific for Matrix Metalloproteinase Activity 1”, Neoplasia, 13(8), pp. 685–91. 10. Dragutinovic V., Radojic N., Petronijevic N. (2011), “Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and -9 (MMP-9) in Preoperative Serum as Independent Prognostic Markers in Patients with Colorectal Cancer”, Molecular And Cellular Biochemistry, 355(1-2), pp. 173–78. 55 11. Ekbom A., Helmick C., Zack M., Adami H. O. (1990), “Increased Risk of Large-Bowel Cancer in Crohn’s Disease with Colonic Involvement”, Lancet, 336(8711), pp. 357–59. 12. Elander N., Söderkvist P., Fransén K. (2006), “Promoter Polymorphisms in Colorectal Cancer”, Anticancer Research, 26, pp. 791-796. 13. Fisher C., Power. E. A., Petzold G., Poorman R. (1994), “Interstitial collage-nase is required for angiogenesis in vivo”, Developmental Biology, 162, pp. 499-510. 14. Fukuda Y., Masuda Y., Kishi J., Hashimoto Y., Hayakawa T., Nogawa H., (1998), “The role of interstitial collagens in cleft formation of mouse embryonic subman-dibular gland during initial branching”, Development, 103, pp. 259–267. 15. Giacosa A., Franceschi S., Vecchia C. L. (1999), “Energy Intake, Overweight, Physical Exercise and Colorectal Cancer Risk”, European Journal Of Cancer Prevention, 8(1), pp. 53–60. 16. Gialeli C., Achilleas D. T., Nikos K. K. (2011), “Roles of Matrix Metalloproteinases in Cancer Progression and Their Pharmacological Targeting”, The Federation of European Biochemical Societies Journal, 278(1), pp. 16–27. 17. Hiraoka N., Allen E., Apel I. J., Gyetko M. R., Weiss S. J. (1998), “Matrix metalloproteinase regulate neovasculariza-tion by acting as pericellular fibrinolysins”, Cell, 95, pp. 365–377. 18. Hua H., Minjing L., Ting L., Yancun Y., Yangfu J. (2011), “Matrix Metalloproteinases in Tumorigenesis: An Evolving Paradigm”, Cellular And Molecular Life Sciences, 68(23), pp. 3853–68. 19. Ikeda K., Ihara K., Yamaguchi K. (2008), “Genetic analysis of MMP gene polymorphisms in patients with Kawasaki disease”, Pediatric Research, 63, pp. 182–185. 20. Jafari M., Pirouzi A., Mohsenzadeh M., Kusari A. A., Hajihosseini S. (2014), “Association of MMP-9 -1562 C/T Single Nucleotide Polymorphism with the Susceptibility to Lung Cancer Disease in South Iranian Population”, British Journal Of Medicine & Medical Research, 4(13), pp. 2294-2302 56 21. Joos L., He J., Shepherdson M. (2002), “The Role of Matrix Metalloproteinase Polymorphisms in the Rate of Decline in Lung Function”, Human Molecular Genetics, 11(5), pp. 569–76. 22. Kohno S., Sekine I., “Expression of Matrix Metalloproteinase-1 in Human Colorectal Carcinoma”, Modern Pathology, 11, pp. 1925–33. 23. Langenskiold M., Holmdahl L., Falk P. (2005), “Increased Plasma MMP-2 Protein Expression in Lymph Node-Positive Patients with Colorectal Cancer”, International Journal Of Colorectal Disease, 20(3), pp. 245–52. 24. Leeman M. F., Mckay J. A., Murray G. I. (2002), “Matrix Metalloproteinase 13 Activity Is Associated with Poor Prognosis in Colorectal Cancer”, Journal of Clinical Pathology, 55, pp. 758–762. 25. Maurel J., Nadal C., Gallego R. (2007), “Serum Matrix Metalloproteinase Levels Identifies Poor Prognosis Advanced Colorectal Cancer Patients”, International Journal Of Cancer: Journal International Du Cancer, 121(5), pp. 1066–71. 26. Meyerhardt J., Holmes M.D. (2006), “Physical Activity and Survival after Colorectal Cancer Diagnosis”, Journal Of Clinical Oncology: Official Journal Of The American Society Of Clinical Oncology, 24(22), pp. 3527–34. 27. Ming-yii H., Hui-jen C., Fu-yen C. , Ming-je Y. (2010), “MMP13 is a Potential Prognostic Marker for Colorectal Cancer”, Oncology Report, 24, pp. 1241–47. 28. Minematsu N., Nakamura H., Tateno H. (2001), “Genetic polymorphism in matrix metalloproteinase-9 and pulmonary emphysema”, Biochemial And Biophysical Research Communications, 289(1), pp. 116-9. 29. Moskal A., Norat T., Ferrari P., Riboli E. (2007), “Alcohol Intake and Colorectal Cancer Risk: A Dose-Response Meta-Analysis of Published Cohort Studies”, International Journal Of Cancer: Journal International Du Cancer, 120(3), pp. 664–71. 30. Pannu H., Kim D., Guo D. (2006), “The Role of MMP-2 and MMP-9 Polymorphisms in Sporadic Intracranial Aneurysms”, Journal Of Neurosurgery, 105(3), pp. 418–23. 57 31. Peng B., Cao L., Wang D. (2010), “Meta-Analysis of Association between Matrix Metalloproteinases 2, and Promoter Polymorphisms and Cancer Risk”, Mutagenesis, 25(4), pp. 371–79. 32. Potter J. (1996), “Nutrition and Colorectal Cancer”, Cancer Causes & Control, 7(1), pp. 127–46. 33. Raimondi S., Page P. (2008), “Smoking and Colorectal Cancer”, Journal of the American Medical Asociation, 300(23), pp. 2765–78. 34. Reis S. D., Pontes J., Villanova F. (2009), “Genetic polymorphisms of matrix metalloproteinase: Susceptibility and prognostic implication for prostate cancer’, The Journal Of Urology, 181, pp. 2320-25. 35. Sadeghi M., Motovali-bashi M., Hojati Z. (2009), “MMP-9 Promoter Polymorphism Associated with Tumor Progression of Breast Cancer in Iranian Population”, International Journal Of Integrative Biology, 6(1), pp. 33–37. 36. Samad A. K. A., Taylor R. S., Marshall T., Chapman M. S. (2005), “A Meta-Analysis of the Association of Physical Activity with Reduced Risk of Colorectal Cancer.” Colorectal Disease,7(3), pp. 204–13. 37. Sato T., Foged N. T., Delaisse J. M. (1998), “The migration of prurified osteoclasts through collagen is inhibited by matrix metalloproteinase inhibitors”, Journal Bone Mineral Research, 13, pp. 59–66. 38. Shi H., Xu J. M. (2006), “Transfection of Mouse Macrophage Metalloelastase Gene into Murine CT-26 Colon Cancer Cells Suppresses Orthotopic Tumor Growth, Angiogenesis and Vascular Endothelial Growth Factor Expression”, Cancer Letters, 233(1), pp. 139–50. 39. Singh R., Srivastava P., Srivastava A., Mittal R. D. (2010), “Matrix Metalloproteinase (MMP-9 and MMP-2) Gene Polymorphisms Influence Allograft Survival in Renal Transplant Recipients”, Nephrology, Dialysis, Transplantation, 25(10), pp. 3393–3401. 40. Snoek-van Beurden P. A. M., Von den Hoff J. W. (2005), “Zymographic Techniques for the Analysis of Matrix Metalloproteinases and Their Inhibitors”, BioTechniques, 38(1), pp. 73–83. 58 41. Sunami E., Tsuno N., Osaka T., Saito S., Kityama J., Tomozawa S., Tsuruo T., Shibata Y., Muto T., Nagawa H. (2000), “MMP-1 Is a Prognostic Marker for Hematogenous Metastasis of Colorectal Cancer”, The Oncologist, 5, pp. 108–14. 42. Uzui H., Lee J., Shimizu H., Tsutani H., Ueda T. (2000), “The role of protein-tyrosine phosphorylation and gelatinase production in the migration and proliferation of smooth muscle cells”, Atherosclerosis, 149, pp. 51–59. 43. Toshimichi A., Mitsuhiro T., Shaoqiang C., Norihiro T., Taro K., Motoki A., Osamu T., Masaki M., Jun-Ichi H., Tetsuya M., Satoshi K. (2008), “Prognostic Values of Matrix Metalloproteinase Family Expression in Human Colorectal Carcinoma”, The Journal Of Surgical Research, 146(1), pp. 32–42. 44. Visse R., Nagase H. (2003), “Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases: Structure, Function, and Biochemistry”, Circulation Research, 92(8), pp. 827–39. 45. Vu T. H., Werb Z. (2000), “Matrix Metalloproteinases: Effectors of Development and Normal Physiology”, Gene & Development, 14, pp. 2123–33. 46. Walker J. M. (2001), “Matrix Metalloproteinase Protocols”. 47. Xing L. L. (2007), “Matrix Metalloproteinase-9 -1562C > T Polymorphism May Increase the Risk of Lymphatic Metastasis of Colorectal Cancer”, World Journal Of Gastroenterology, 13(34), pp. 4626–29. 48. Xu Z., Shi H., Li Q. (2008), “Mouse Macrophage Metalloelastase Generates Angiostatin from Plasminogen and Suppresses Tumor Angiogenesis in Murine Colon Cancer”, Oncology Reports, 20(1), pp. 81–88. 49. Yang W., Arii S., Rivas M. G. (2001), “Human Macrophage Metalloelastase Gene Expression in Colorectal Carcinoma and Its Clinicopathologic Significance”, Cancer, 91(7), pp. 1277–83. 50. Yang Y., Hennessy S., Lewis J. (2004), “Insulin Therapy and Colorectal Cancer Risk among Type Diabetes Mellitus Patients”, Gastroenterology, 127(4), pp. 1044–50. 51. Zhou M., Huang S., Wan H. (2004), “Genetic Polymorphism in Matrix Metalloproteinase-9 and the Susceptibility to Chronic Obstructive 59 Pulmonary Disease in Han Population of South China”, Chinese Medical Journal, 117(10), pp. 1481–84. Website: 52. http://www.benhvienk.com 53. http://www.cancer.gov 54. http://www.cancer.org 55. http://www.parkwaycancercentre.com 56. http://www.ungbuouvietnam.com 57. http://www.thermoscientificbio.com 60 Phụ lục 1: Danh sách bệnh nhân UTĐTT kết phân tích biến đổi C-1562T thuộc vùng promoter gen MMP-9 STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Mã số 8424 8529 8614 8622 8722 8783 8798 10200 9934 9938 10211 10491 9794 -10227 8619 10600 10611 11781 11822 10282 8276 2903 3035 3089 Họ tên Nguyễn Trọng S. Bùi Văn P. Lê Thị Y. Vũ Xuân C. Lê Bật X. Nguyễn Văn Th. Phạm Trọng Th. Dương Thị H. Nguyễn Thế Th. Nguyễn Văn Ph. Nguyễn Thị H. Đặng Văn H. Nguyễn Thị H. Nguyễn Sỹ V. Trần Văn S. Nguyễn Tiến Ư. Nguyễn Thị Th. Bùi Công H. Dương Văn T. Cao Xuân V. Nghiêm Thị M. Vũ Quang Nh. Nguyễn Văn S. Nguyễn Thị M. Lê Thị M. Tuổi 64 69 55 66 60 61 57 58 54 68 45 85 40 73 71 60 48 71 57 49 74 63 71 61 80 Giới tính Vị trí khối u Phân loại TNM Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nữ TT TT ĐT ĐT ĐT TT ĐT TT ĐT TT TT ĐT TT TT TT ĐT TT ĐT TT TT ĐT ĐT ĐT TT TT T3N0M0 T2N0M0 T2N0M0 T3N1M0 T2N1M0 T2N0M0 T2N0M0 T2N0M0 T2N0M0 T2N1M0 T2N0M0 T1N0M0 T2N1M0 T3N1M0 T2N0M0 T3N1M0 T2N0M0 T2N1M0 T2N0M0 T2N0M0 T2N0M0 T2N1M0 T3N0M0 T3N1 T3N0 I MLCU -CC CC CC CC CC CC CT CC CC CC CC CC CC CC -CC CC CC CC CC CT -CT CC Kiểu gen MU CC CC CC CC CC CC CC CT CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC -CT CC CC CC Máu 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 3372 3558 3753 X7488 3822 3825 3905 4120 4297 4463 4475 4603 4620 4779 4833 4841 4951 16678 16756 16689 16714 18776 18765 7426 17401 17180 17176 19563 19574 19601 Nguyễn Khắc Q. Nguyễn Hữu Đ. Hoàng Thị Th. Nguyễn Thị M. Đỗ Thị H. Đinh Văn G. Nguyễn Thị Th. Đỗ Thị V. Phạm Văn T. Nguyễn Văn M. Nguyễn Thị G. Trần Văn V. Ngô Thị H. Nguyễn Văn Nh. Nguyễn Thị Ph. Cà Thị V. Nguyễn Thị T. Phạm Vĩnh B. Nguyễn Văn T. Trần Văn T. Trần Thị T. Nguyễn Duy C. Nguyễn Công H. Trịnh Đức Q. Nguyễn Duy V. Nguyễn Xuân H. Nguyễn Huy D. Nguyễn Văn C. Nguyễn Đại B. Lê Văn C. 63 42 54 59 26 53 80 51 43 53 76 46 35 51 59 68 68 75 55 61 48 43 74 72 54 40 73 59 56 48 Nam Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam nam Nam ĐT TT ĐT ĐT ĐT TT TT TT ĐT ĐT TT TT ĐT ĐT ĐT TT ĐT TT ĐTT TT TT ĐT TT TT ĐT TT TT ĐT TT ĐT II T3N0 T4N0M0 T2N0 T1N1M1 T4N2M0 T3N0 T3N0 T3N0 T3N0 T4N1M0 T4N1M0 T3N0 T4N0 T3 T3N0M0 T3N0 T2N0 T1N2M0 T2N1M0 T1N1M0 T2N0M0 T1N0M0 T2N0M0 T2N0M1 T2N1M0 T1N1M0 T1N1M0 T2N0M0 T1N0M0 T2N1M0 CC CC CC CC CC CC CC CC CC CT CC CC CT CC CC CT CT CC CC CT CC CT CC CC CC -CC CT -CT CC CC CC CC CC CC CC CC CC CT CC CC CT CC CC CT CT CT CC CT CC CT CC CC CC CC CC CT CT CT CC CT CC CC CC CC 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 19617 3553 10370 3891 19561 3797 36473 36474 36720 36924 36983 37047 37158 37261 37262 37456 38432 38784 38785 39002 39400 39661 39799 39931 39932 40102 40103 40577 40683 40863 Ân Thị Kim C. Hà Thị M. Lê Hương Th. Trương Văn Th. Bùi Thị H. Nguyễn Duy L. Hoàng Thị M. Nguyễn Thị H. Hoàng Thị B. Nguyễn Văn D. Trần Thị Ch. Đặng Thúy Th. Chứ Thị Tuyết N. Nguyễn Văn H. Phạm Thị Xuân T. Trần Văn Tr. Hà Thị Th. Nguyễn Thị Ch. Đỗ Năng Th. Lê Thị Y. Lê Bình M. Trần Tuấn Đ. Lê Thị V. Nguyễn Xuân S. Đặng Thị Th. Mai Trọng H. Lại Thị Ng. Nguyễn Thị T. Đỗ Văn Phụng Đinh Văn Tr. 70 53 73 57 61 46 42 60 63 53 57 65 39 75 -39 71 43 72 56 36 55 39 53 60 60 -63 73 67 Nữ Nữ Nữ nam Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nữ nam Nữ Nam Nam Nữ nam Nữ nam Nữ Nữ Nam Nam ĐTT ĐTT ĐTT ĐTT ĐTT ĐTT TT TT ĐT ĐT ĐT TT TT ĐT TT ĐT ĐT ĐT TT ĐT ĐT TT ĐT TT ĐT TT ĐT TT TT TT III T2N1M0 T2N1M0 T2N0M0 T2N0M0 T2N1M0 T2N0M0 T3N1M0 T3N1M0 T3N0M0 T2N0M0 T3N0M0 T2N0M0 T3N1M0 T3N0M0 T3N1M0 T3N1M0 T3N0M0 T3N0M0 T2N0M0 T3N0M0 T3N1M0 T3N1M0 T3N0M0 T3N2M0 T2N0M0 T3N1M0 T3N0M0 T3N0M0 T3N0M0 T2N1M0 CC CC CC -CC CC CC CT CC CC CC CC CT CC CC CC CC TT CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC -CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CT CC CC CC CC CC TT CC CC CC -CC CC CC CC CC CC CC CC 86 40872 Triệu Thị H. 56 Nữ TT T3N0M0 CT 87 41116 Nguyễn Thị H. 32 Nữ TT T2N1M0 CC 88 41182 Hồ thị T. 52 Nữ ĐT T3N2M0 CC 89 41369 Nguyễn Thị D. 52 Nữ ĐT T2N0M0 CC 90 41517 Bùi Thị T. 38 Nữ ĐT T3N1M0 CC 91 41767 Nguyễn Thị Th. 40 Nữ TT T3N0M0 CC 92 41966 Chúc Thị Gi. 50 Nữ TT T2N0M0 CC 93 41967 Đặng thị H. 66 Nữ TT T2N0M0 CC 94 42009 Đỗ Thị Th. 48 Nữ TT T3N1M0 CC 95 42162 Đinh Thị C. 48 Nữ TT T2N0M0 CC 96 42308 Đỗ Xuân B. 61 Nam TT T3N0M0 CC 97 42440 Lê Nhật Th. 68 Nam TT T3N1M0 CC 98 42527 Đặng Thị M. 62 Nữ ĐT T2N0M0 CC 99 41768 Nguyễn Thị S. 52 Nữ ĐT T3N0M0 CC 100 10626 Nguyễn Duy A. 54 Nam ĐT T3N1M0 101 9807 Nguyễn Thị V. 87 Nữ ĐT T4N1M1 102 16675 Đào Tiến L. 51 Nam ĐTT T1N0M0 103 Trần Văn B. 60 Nam ĐT T2N0M0 104 10608 Ninh Thị C. 46 Nữ TT T2N0M0 105 17216 Nguyễn Thị Ng. 53 Nữ TT T2N1M0 106 10597 Hoàng Thị Q. 51 Nữ ĐT T3N1M0 107 9938 Nguyễn Văn Ph. 68 Nam TT T2N1M0 Ghi chú: --: không xác định MLCU: mô lân cận u MU: mô u ĐT: đại tràng TT: trực tràng IV -CC CC CC CC CT CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CT ĐTT: đại trực tràng Phụ lục 2: Danh sách mẫu người bình thường cho máu kết phân tích biến đổi C-1562T thuộc vùng promoter gen MMP-9 STT 10 11 12 13 14 15 Mã số người cho máu 28955 29085 29103 29093 29079 29108 29231 29265 29234 29105 29264 29102 28990 28988 29249 Kiểu gen vị trí -1562 CC CT CC CT CC CC CC CT CT CC CC CC CC CC CT STT 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 V Mã số người cho máu 29245 29263 29107 29235 28943 28445 28972 28944 28942 29212 28975 28955 29221 29220 29219 Kiểu gen vị trí -1562 CT CT CC CC CC CC CC CC CC CT CC CC CC CC CT Phụ lục 3: Kết giải trình tự trực tiếp mẫu mang biến đổi C-1562T thuộc vùng promoter gen MMP-9 , trường hợp dị hợp tử (mã 4463B) Ghi chú:Vị trí trình tự tương ứng với vị trí -1562 thuộc vùng promoter gen MMP-9 khoanh tròn VI Phụ lục 4: Kết giải trình tự trực tiếp mẫu mang biến đổi C-1562T thuộc vùng promoter gen MMP-9, trường hợp đồng hợp tử (mã 38784B) Ghi chú:Vị trí trình tự tương ứng với vị trí -1562 thuộc vùng promoter gen MMP-9 khoanh tròn VII Phụ lục 5: Kết giải trình tự plasmid mang đoạn ADN không chứa biến đổi C-1562T thuộc vùng promoter gen MMP-9(mã 4620B) Ghi chú:Vị trí trình tự tương ứng với vị trí -1562 thuộc vùng promoter gen MMP-9 khoanh tròn VIII Phụ lục 6: Kết giải trình tự plasmid mang đoạn ADN chứa biến đổi C-1562T thuộc vùng promoter gen MMP-9(mã 4620B) Ghi chú:Vị trí trình tự tương ứng với vị trí -1562 thuộc vùng promoter gen MMP-9 khoanh tròn IX [...]... ung thư Tuy nhiên ở Việt Nam đến nay chưa có nghiên cứu nào về biến đổi vùng promoter gen MMP9 ở bệnh nhân UTĐTT Chính vì những lý do như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter thuộc gen MMP- 9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Với mục đích: - Xác định được biến đổi ADN trong vùng promoter thuộc gen MMP- 9 ở một nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam... đột biến gen MMP- 9 ở bệnh nhân COPD ở Việt Nam và tỉ lệ cũng tương tự như các nghiên cứu của Nhật và Trung Quốc [2] Có thể nói, ở Việt Nam, những nghiên cứu về đa hình nói riêng hay những biến đổi vùng promoter gen MMP- 9 còn rất sơ khai, trên đối tượng là bệnh nhân ung thư đại trực tràng thì chưa có nghiên cứu nào Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành tập trung nghiên cứu về biến đổi ADN thuộc. .. MMP- 9 có đóng góp nhất định vào sự phát triển cũng như tiến triển của ung thư đại trực tràng Những biến đổi vùng promoter gen MMP- 9 mã hóa cho protein MMP- 9 có thể làm thay đổi cấu trúc và chức năng protein, do đó có thể tác động tới sự phát triển và di căn của tế bào ung thư [18] Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về những biến đổi vùng promoter gen MMP- 9 ở nhiều bệnh khác nhau trong đó có ung thư. .. định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau vì thế thư ng được gọi chung là ung thư đại trực tràng [53] Hình 1: Hình ảnh đại trực tràng [56] 3 1.1.2 Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến UTĐTT liên quan đến sự biến đổi bệnh học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thư ng Thống kê các tài liệu tổng quan cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh. .. triển ung thư ở bệnh nhân ung thư vú Iran [35] Ở Việt Nam Năm 2012, Lê Thị Huyền Trang và cs đã tiến hành nghiên cứu đa hình trên gen MMP- 9 ở bệnh COPD Nhóm tác giả đã xác định được đa hình C-1562T trên gen MMP- 9 của 100 bệnh nhân COPD theo phương pháp giải trình tự gen Bệnh nhân được lấy máu và phân tích giải trình tự gen tại phòng thí nghiệm của Đại học Shiga Nhật Bản Kết quả thu được: Tỉ lệ bệnh nhân. .. những biến đổi ADN vùng promoter gen MMP- 9 với một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về ung thư đại trực tràng Ung thư là một loại bệnh. .. già) hoặc trực tràng (vài inch cuối cùng của ruột già trước hậu môn) Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao gồm đại tràng lên (ascending colon), đại tràng ngang (transverse colon) và đại tràng xuống (descending colon) Trực tràng (rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối giữa đại tràng và hậu môn (Hình 1) Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng, thư ng hai loại ung thư này... rằng gen MMP- 13 ít nhất có một phần đóng góp vào sự phát triển các tổn thư ng động mạch vành ở bệnh Kawasaki [ 19] Khi nghiên cứu về đa hình promoter gen MMP- 1 ở các bệnh nhân bị xơ hóa phổi tự phát, Checa và Pardo đã chỉ ra mối liên quan giữa đa hình promoter gen MMP- 1 (yếu tố gen) với việc hút thuốc lá (yếu tố môi trường) [8] Năm 20 09, Reis và cs đã nghiên cứu mối tương quan giữa đa hình gen MMP- 1, MMP- 2,... thũng Nghiên cứu này của nhóm tác giả đã chứng minh được rằng: Đa hình của MMP- 9 có thể là một trong những nguyên nhân gây chứng bệnh khí phế thũng ở những người hút thuốc lâu năm [28] Năm 20 09, Sadeghi và cs đã tiến hành nghiên cứu đa hình vùng promoter gen MMP- 9 ở 180 bệnh nhân ung thư vú và 100 người khỏe mạnh ở Iran bằng phương pháp PCR-RFLP Nhóm tác giả đã phát hiện ra đa hình C-1562T ở vùng promoter. .. vùng promoter gen MMP- 9 trên đối tượng bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam Nghiên cứu thực hiện với mục đích tìm được biến đổi trên vùng promoter gen MMP- 9 và mối liên quan giữa biến đổi với một số đặc điểm bệnh học của bệnh UTĐTT, từ đó hỗ trợ cho việc chẩn đoán sớm, điều trị và tiên lượng của bệnh nhân UTĐTT hiệu quả hơn 20 CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu . Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter thuộc gen MMP- 9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng . Với mục đích: - Xác định được biến đổi ADN trong vùng promoter thuộc gen MMP- 9 ở một nhóm bệnh nhân. 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN MMP- 9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG . Một số nghiên cứu về họ MMP ở ung thư đại trực tràng 16 1.2.4. Một số nghiên cứu về đa hình đơn nucleotide trên các gen MMP 17 1.2.5. Một số nghiên cứu về đa hình vùng promoter gen MMP- 9 19 CHƯƠNG