Tổng quan về Enzyme chitinase
Giới thiệu về Enzyme chitinase
Enzyme Chitinase (poly (1,4 acetyl- β- glucosaminide) glucanhydrolase) là một loại enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase, có khả năng thủy phân liên kết (1,4-N-acetyl-β-glucosaminide) của chitin Enzyme này được sản xuất bởi nhiều sinh vật, bao gồm cả những loài có chitin như nấm, côn trùng và giáp xác, cũng như những loài không có chitin như vi khuẩn và thực vật Trong các sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển hình thái và cấu trúc tế bào Các sinh vật khác cũng tổng hợp chitinase với mục đích riêng, ví dụ, vi khuẩn sử dụng enzyme này để phân hủy chitin, tạo ra nguồn carbon Đối với thực vật và động vật, chitinase là một phần của hệ thống phòng vệ chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm, thông qua việc phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm.
Enzyme chitinase có cơ chất chính là chitin và các dẫn xuất của nó Chitin, một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, được hình thành từ các đơn phân N-acetylglucosamine liên kết với nhau qua liên kết β-1,4 Chitin đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc bộ xương ngoài của côn trùng, vỏ giáp xác và thành tế bào nấm.
Chitin là một hợp chất có màu trắng, cứng, chứa nitrogen và có hoạt tính hóa học thấp Nó không tan trong nước và hầu hết các dung môi hữu cơ, nhưng có thể tan trong hexa fluro isopropanol và hexa fluroacetone Hàm lượng nitrogen trong chitin dao động từ 5-8% Khi tiếp xúc với môi trường kiềm, chitin sẽ bị deacetyl hóa và chuyển thành chitosan.
Phân loại chitinase
Các nhà khoa học phân chitinase thành 3 loại: Dựa vào cấu trúc phân tử, dựa vào trình tự amino acid, dựa vào phản ứng cắt
Dựa vào cấu trúc phân tử
Chitinase được xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzym thủ phân đường):
Họ chitinase lớn nhất, với khoảng 180 chi, có cấu trúc bao gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở nhiều sinh vật như vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus Họ này chủ yếu chứa enzyme chitinase, cùng với các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetylglucosaminidase Chitinase từ prokaryote có hai trình tự ngắn được bảo tồn cao, bao gồm một gốc acid glutamic, tương tự với enzyme của eukaryote, mặc dù chỉ có 10% gốc giống nhau Cả hai loại chitinase đều có cùng domain xúc tác barrel (βα)8, với rãnh gắn cơ chất nằm ở đầu C của sợi β trong cấu trúc này Gốc acid glutamic trong cả hai enzyme đảm nhiệm vai trò proton xúc tác, khác biệt so với các glycoside hydrolase khác Chitinase thuộc họ 18 có cơ chế phản ứng đặc biệt, tác động lên nhóm N-acetyl của cơ chất tại nguyên tử C anomer, tạo ra chất trung gian bao gồm vòng pyranose của glucosamine kết hợp với vòng 5 oxazoline.
Hình 1.1 Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18
Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật như cà chua
Solanum tuberosum, cải (Arabidopsis thaliana), và đậu Hà Lan (Pisum sativum) đều chứa lysozyme (EC 3.2.1.17) với cấu trúc hình cầu tương tự như ở động vật và phage Các enzyme này bao gồm một cuộn α + β và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển Ngoài ra, chúng còn được tìm thấy ở xạ khuẩn Streptomyces griceus và vi khuẩn Haemophilus influenzae.
Thực vật và vi sinh vật nhƣ Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong khi côn trùng và hầu hết sinh vật khác chỉ tạo chitinase thuộc họ glycohydrolase 18
Dựa vào trình tự amino acid:
Dựa vào trình tự đầu amin (N), vị trí của enzyme, điểm đẳng điện, peptid nhận biết và vùng cảm ứng, enzyme chitinase được phân loại thành 5 nhóm khác nhau.
Nhóm I là các đồng phân enzyme với vùng đầu N giàu cysteine chứa khoảng 40 acid amin, tương tự như vùng đầu N ở hevein và các enzyme khác có ái lực với chitin hoặc N-acetylglucosamine Vùng giàu cysteine này rất quan trọng cho sự gắn kết enzyme với cơ chất chitin, nhưng không cần thiết cho hoạt động xúc tác Các vùng gắn chitin không chỉ không luôn tăng cường hoạt tính xúc tác mà còn tạo ra các đặc tính sinh học riêng biệt cho chitinase ở nhiều loài khác nhau Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở đầu C giúp định vị chitinase trên thành tế bào, hỗ trợ phân tách tế bào mẹ khỏi tế bào chị em Trong khi đó, ở thuốc lá và nhiều loài thực vật khác, chitinase nằm trong không bào và được kích hoạt bởi sự nhiễm nấm, vi khuẩn hoặc virus Chitinase nhóm I của thuốc lá có vùng đầu C giàu cysteine, đóng vai trò quan trọng trong việc gắn chitin.
Nhóm II là các đồng phân enzyme có tâm xúc tác với trình tự amino acid tương tự như chitinase nhóm I, nhưng thiếu đoạn giàu cysteine ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C Chitinase nhóm II tồn tại ở thực vật, nấm và vi khuẩn, và chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài Trong thực vật, protein nhóm II đóng vai trò là protein kháng bệnh, được tế bào tiết ra trong các điều kiện stress khác nhau.
Group III chitinases exhibit a distinct amino acid sequence compared to Group I and II chitinases, yet they closely resemble the sequence found in lysozyme from Hevea brasiliensis, which grants them lysozyme-like activity In plants, Group III chitinases function as disease-resistant proteins and are secreted extracellularly.
Nhóm IV bao gồm các đồng phân enzyme chủ yếu có mặt ở lá cây hai lá mầm, với 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác tương tự như chitinase nhóm I và có sự tương đồng với chitinase vi khuẩn Phân tử của nhóm này chứa đoạn giàu cysteine nhưng có kích thước nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I Trong khi đó, nhóm V cho thấy qua dữ liệu trình tự, vùng gắn chitin (vùng giàu cysteine) đã giảm đáng kể trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao.
• Dựa vào phản ứng phân cắt:
Enzyme phân giải chitin bao gồm endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase Endochitinase cắt chitin một cách ngẫu nhiên, tạo ra oligosaccharide và đã được nghiên cứu từ dịch chiết nấm Trichoderma harzianum (có 2 loại endochitinase: M16kDa, pI1=5,3±0,2 và M2@kDa, pI2=3,9) và Gliocladium virens (MAkDa, pI=7,8) Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme exochitinase từ đầu không khử, tạo ra chitobiose, được thu từ Trichoderma harzianum (M6kDa, pI=4,4±0,2) N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) cắt chitin từ một đầu, tạo ra monomer N-acetyl-D-glucosamin Chitobiase cũng là một enzyme quan trọng trong quá trình phân giải chitin.
Enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamin Đối với chitosan, dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, chitosanase (EC 3.2.2.132) xúc tác quá trình thủy phân chitosan, tạo ra các oligosaccharide tương ứng.
Nguồn thu nhận Enzyme chitinase
Enzyme chitinase vi khuẩn
Vi khuẩn sản sinh enzyme chitinase để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng, thường tổng hợp nhiều loại chitinase nhằm phân cắt các dạng chitin đa dạng trong tự nhiên Do đó, chitinase vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu trình chitin tự nhiên.
Enz me chitinase đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn: Chromobacterum,kelebsella, pseudomomonas,… và đặc biệt là ở nhóm Streptomycetes.
Chitinase từ nấm
Chitinase được sản xuất bởi các loại nấm sợi với hoạt độ cao hơn so với các nguồn khác Các chủng nấm mốc nổi bật với hàm lượng chitinase cao bao gồm:
Trichoderma, Gliocladium, Calvatia… Đặc biệt là ở các loài nấm lớn nhƣ Lycoperdon,Coprinus…
Chitinase thực vật
Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enz me chitinase nhƣ: cao su (
Hevea brasiliensis, tobacco (Nicotiana), rice, wheat, cabbage, sweet potatoes, peas, soybeans, taro, and particularly certain species of seaweed provide chitinase enzymes.
Chitinase động vật
Enzyme chitinase có thể được chiết xuất từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến trong hệ tiêu hóa của nhiều loại động vật không xương như ruột của giun tròn và thân mềm chân đốt Việc thu nhận enzyme chitinase từ những nguồn này có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng sinh học.
Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến phản ứng enzym, với tốc độ phản ứng không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ Tốc độ phản ứng của enzyme sẽ tăng lên đến một nhiệt độ tối ưu, nhưng khi vượt qua mức này, tốc độ sẽ giảm và có thể dẫn đến triệt tiêu hoạt động enzym Nếu nhiệt độ vượt quá mức tối ưu, hoạt tính của enzym sẽ giảm và có thể không phục hồi được.
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của hầu hết enzyme chitinase ở vi sinh vật là 40°C, trong khi enzyme này sẽ bị vô hoạt ở nhiệt độ từ 55°C đến 65°C Đáng lưu ý, nguồn gốc của enzyme chitinase có thể ảnh hưởng đến nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ của nó.
Theo Takashi và cộng sự 2002 Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ là 37°C.
Ảnh hưởng của pH
pH tối ưu của enzyme chitinase khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc và cơ chất Enzyme chitinase từ thực vật có pH tối ưu khoảng 4-9, trong khi chitinase từ động vật nằm trong khoảng 4,8-7,5 và từ vi sinh vật là 3,5-8 Hầu hết các enzyme chitinase được chiết xuất từ nấm mốc có độ bền tốt nhất ở pH 4,0 đến 6,0 và nhanh chóng mất hoạt tính trong điều kiện trung tính Aespergillus sp sản sinh chitinase với hoạt tính cao nhất ở pH 5-6 (Takashi và cộng sự).
2002) Nguy n Thị Hồng Thương và các đồng tác giả, 2003 nghiên cứu trên
Trichoderma haianum chỉ ra rằng pH thích hợp cho nấm nả sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH= 4-6.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Chitinase là enzyme cảm ứng hoặc cấu trúc, và việc chọn đúng cơ chất cho chủng nấm là yếu tố quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp enzym này.
Chitin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự tổng hợp enzyme chitinase, do đó sự hiện diện của chitin trong môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết.
Nghiên cứu cho thấy rằng các chủng nấm nuôi cấy trên nguồn cacbon như glucose, fructose và saccharose có khả năng tạo ra enzym chitinase cao nhất Ngược lại, môi trường chứa chitosa và cellulose không sản sinh được enzym này Cụ thể, nghiên cứu của Jesus de la Cruz và cộng sự chỉ ra rằng Trichoderma atroviride chỉ sản xuất chitinase khi có nguồn cacbon từ chitin, mà không từ cellulose hay chitosan.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nito đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp enzym chitinase của vi sinh vật, với nguồn nito chủ yếu dưới dạng muối nitrat và amoni, giúp vi sinh vật hoạt động hiệu quả hơn.
Các dạng nitơ hữu cơ (pepton, cao nấm men ) phối hợp với nguồn nito vô cơ có tác dụng tốt đến sự sinh tổng hợp enzyme chitinase
Trong nuôi cấy bán rắn, khi môi trường được bổ sung nitơ từ hai nguồn là muối và cao nấm men, sản lượng chitinase tăng từ 4-10% so với việc sử dụng riêng lẻ từng nguồn.
Theo nghiên cứu của Kapat và cộng sự (1996), Khi loại ure ra khỏi môi trương nuôi câ se làm tăng khả năng tổng hợp chitinase Takashi và cộng sự
(2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm sợi Aspergillus sp Đã chỉ ra rằng hoạt tính chitinase cao khi sử dụng nguồn nito từ (
Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng khoáng
Các nguyên tố khoáng như Mn, Cu, và Fe đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của vi sinh vật, giúp duy trì cân bằng sinh lý tế bào Chúng thường được bổ sung dưới dạng muối vô cơ như H2PO4 và MgSO4 Mỗi nguyên tố khoáng có chức năng riêng, trong đó photpho tham gia vào cấu trúc của axit nucleic, photophoprotein, phospholipid và nhiều coenzym quan trọng như ATP, NADP, và ADP Ngoài ra, các kim loại này cũng cần thiết cho quá trình tổng hợp chitinase ở một số vi sinh vật.
Ảnh hưởng của các yếu tố khác
Nguồn cacbon, Nitơ, các ngu ên tố vô cơ có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzym chitinase bởi vi sinh vật
Các yếu tố như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều ảnh hưởng đến việc sản xuất enzym chitinase.
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym chitinase của nấm mốc, với mỗi loài có nhiệt độ tối ưu khác nhau Tuy nhiên, các vi sinh vật và enzym tổng hợp thường không bền ở nhiệt độ cao, dẫn đến sự kìm hãm nhanh chóng Nhiệt độ tối ưu để nấm tổng hợp enzym chitinase là từ 30°C đến 32°C Về ảnh hưởng của pH môi trường, trong phương pháp nuôi bề mặt, pH ít tác động đến quá trình sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật và thường không thay đổi trong suốt quá trình phát triển Ngược lại, trong phương pháp nuôi cấy chìm, pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp chitinase của vi sinh vật.
Các loại cơ chất của enzyme chitinase
Chitin
Chitin là một polyme sinh học phổ biến thứ hai sau cellulose, đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc của vách tế bào nấm và bộ khung xương của các loài như tôm, cua, và côn trùng Chitin thường liên kết chặt chẽ với protein, lipid, muối vô cơ (như canxi) và các sắc tố, tạo nên những vật liệu có giá trị trong tự nhiên.
Bảng 1.1 Nguồn cơ chất của enzyme chitinase
Tỉ lệ phần hữu cơ trong trọng lƣợng khan Chitin % Protein %
Châu chấu 2 cánh cứng periplameta 23,7 76,3
Boubyx(con tằm ấu trùng )
Chitin, một polysaccharide quan trọng, chủ yếu xuất hiện trong một số loài nấm và tảo, đóng vai trò tương tự như cellulose trong thực vật bậc cao Trong nấm, chitin không chỉ là thành phần cấu trúc mà còn góp phần vào sự phát triển và chức năng của chúng, tương tự như vai trò của cellulose trong các loại cây.
Người ta đưa các giả thiết khác nhau về sự hiện diện của chitin hoặc cellulose không hiện diện đồng thời
Chitin không chỉ có mặt trong lớp vỏ ngoài của nấm mà còn liên kết với các thành phần khác Lượng chitin trong một số loài nấm thông thường dao động từ 3% đến 5%.
Cấu trúc phân tử của chitin
Cấu trúc phân tử của Chitin có dạng
Chitin là một dạng polysaccharide gồm các tiểu phân N- actyl D- Glucosamine kết hợp lại với nhau theo liên kết β (1 4) Liên kết của chitin là
Chitin, với cấu trúc tinh thể, tạo thành một mạng lưới sợi hữu cơ, giúp tăng cường độ bền, độ cứng và điểm tựa cho các sinh vật.
Chitin có cấu trúc lạp thể với ba dạng chính: α, β và γ, khác nhau ở cách sắp xếp các chuỗi Trong α–chitin, các chuỗi được xếp xen kẽ theo chiều xuôi và ngược, với một cặp chuỗi cùng chiều Đối với β–chitin, các chuỗi được sắp xếp theo một chiều nhất định, trong khi γ–chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều, xen kẽ với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc.
Hình 1.2 cấu trúc của chitin
Ứng dụng của enzym chitinase
MỤC TIÊU, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1.Mục tiêu nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzyme chitinase từ chủng Trichoderma atroviride (Tri 3)
Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase
2.3.Đối tƣợng, hóa chất, vật liệu và thiết bị
Trichoderma atroviride (Tri 3) do bộ môn Vi Sinh – Hóa Sinh, Viện Công
Nghệ Sinh Học- Trường Đại Học Lâm Nghiệp Hà Nội cung cấp
2.3.2.Thiết bị và hóa chất
STT Thiết bị Xuất xứ
1 Box cấy vô trùng ( Box laminar PII) Đức
3 Nối hấp khử trùng(Lequenx) Pháp
4 Cân điện tử (AL300) Mỹ
5 Kính hiển vi quang học Đức
6 Bếp điện/ bếp từ Việt Nam
11 Máy ly tâm lạnh Đức
12 Đĩa petri, ống đong, bình thủy tinh, 100ml, Việt nam, trung Quốc
ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Xác định đƣợc các điều kiện nuôi cấy sinh enzyme chitinase từ chủng
Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzyme chitinase từ chủng Trichoderma atroviride (Tri 3)
Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase
2.3.Đối tƣợng, hóa chất, vật liệu và thiết bị
Trichoderma atroviride (Tri 3) do bộ môn Vi Sinh – Hóa Sinh, Viện Công
Nghệ Sinh Học- Trường Đại Học Lâm Nghiệp Hà Nội cung cấp
2.3.2.Thiết bị và hóa chất
STT Thiết bị Xuất xứ
1 Box cấy vô trùng ( Box laminar PII) Đức
3 Nối hấp khử trùng(Lequenx) Pháp
4 Cân điện tử (AL300) Mỹ
5 Kính hiển vi quang học Đức
6 Bếp điện/ bếp từ Việt Nam
11 Máy ly tâm lạnh Đức
12 Đĩa petri, ống đong, bình thủy tinh, 100ml, Việt nam, trung Quốc
250ml, 500ml, 1000ml, ống Falcon, giấy cân, đèn cồn
Trong nghiên cứu, các hóa chất thông dụng được sử dụng bao gồm cao thịt, cao nấm men, agar, pepton, glucose và nhiều hóa chất khác, tất cả đều có sẵn tại Viện Công Nghệ của Trường Đại Học Lâm nghiệp, với nguồn gốc từ Việt Nam và Trung Quốc.
2.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm mốc
FeSO 4 7H 2 O: 0,1 g NaNO 3 : 3,5g Dịch chitin 1%: 30 ml K 2 HPO 4 : 1,5g Nước: 1000 ml MgSO4.7H2O: 0,5g pH = 5,5 Khử trùng 1atm/30phút KCl: 0,5g
MT 2 Môi trường rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp hoạt độ enzyme thủy phân chitinase từ các chủng nấm sợi[2]
MT 3 Phương pháp đo vòng phân giải bằng phương pháp vặn nút chai [2,3,4]
Nước Định mức đến 1000ml
2.4.1.Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy dến hoạt độ chitinase của chủng Trichoderma atroviride
Sử dụng môi trường nuôi cấy MT 1 (Czapek lỏng) và MT 2 (Czapek rắn) để khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ chitinase của chủng Trichoderma atroviride Cấy chủng Trichoderma atroviride vào cả hai loại môi trường và nuôi ở nhiệt độ 30 độ C trong các khoảng thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ Sau thời gian nuôi, thu thập dịch enzyme thô để xác định hoạt độ chitinase.
2.4.2.Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma atroviride
Phương pháp đo hoạt độ bằng máy đo quang phổ OD được sử dụng để xác định hoạt độ của chitinase, từ đó tìm ra nguồn cacbon tối ưu cho chủng Trichoderma atroviride.
Sử dụng 3 nguồn cacbon để tiến hành khảo sát là: saccharose, lactose, glucose,
Tiến hành nghiên cứu theo bước sau:
- Chuẩn bị môi trường 2 với nguồn cacbon khác nhau au đó tiến hành cấy chủng vào môi trường
- Nuôi chủng ở tủ ấm với nhiệt độ là 30
- Sau 72h, dich enzyme tiến hành đo hoạt độ chitinase để xác định ra đâu là nguồn cacbon sinh ra hoạt độ chitinase cao nhất
2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma atroviride[12]
Sử dụng phương pháp đo hoạt độ bằng máy đo quang phổ OD, nghiên cứu nhằm xác định nguồn Nitơ tối ưu nhất cho việc sinh ra hoạt độ cao nhất ở chủng Trichoderma atroviride.
Sử dụng nguồn nito khác nhau là cao nấm men, pepton,
Tiến hành nghiên cứu theo các bước sau:
Chuẩn bị môi trường với các nguồn Nitơ khác nhau, sử dụng nguồn carbon đã được xác định trước đó để tiến hành khảo sát nguồn Nitơ Sau đó, thực hiện cấy chủng vào môi trường đã chuẩn bị.
- Sau 72 giờ dịch enzyme tiến hành đo hoạt độ enz me chitinase để xác định ra đâu là nguồn cacbon sinh ra hoạt độ chitinase cao nhất
2.4.4 hảo sát ảnh hưởng của h m ượng chitin đến hả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma atroviride
Sử dụng phương pháp đo hoạt độ bằng máy đo quang phổ OD, nghiên cứu xác định hàm lượng chitin tối ưu để đạt được hoạt độ chitinase cao nhất ở chủng Trichoderma atroviride.
Sử dụng nguồn hàm lƣợng (chitin) khác nhau là: 5, 10, 15, 20 % Tiến hành nghiên cứu theo các bước sau:
- Chuẩn bị môi trường với hàm lượng chitin khác nhau au đó tiến hành cấy chủng vào môi trường
- Nguồn nito, cacbon đã đƣợc xác định ở trên dùng để tiến hành thu hoạt độ chitinase ở chủng Trichoderma atroviride
- Sau 72 giờ dịch enzyme tiến hành đo hoạt độ enz me chitinase để xác định ra đâu là nguồn cacbon sinh ra hoạt độ chitinase cao nhất
2.4.5.Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp của enzyme chitinase
2.4.5.1.Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma atroviride
Sử dụng MT 2 nuôi cấy trong thời gian 72h , hàm lƣợng chitin, nguồn cacbon,nito thích hợp đã được khảo sát ở trên các nhiệt độ môi trường 20 ,
25 30 , 35 ,40 Sau đó thu dịch enzyme chitinase tiến hành xác định hoạt độ của chitinase
2.4.5.2.Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma atroviride
Sau khi sử dụng MT 2 nuôi cấy trong thời gian 72 giờ, các yếu tố như hàm lượng chitin, nguồn cacbon, nitơ và nhiệt độ thích hợp đã được khảo sát Trên cơ sở đó, độ ẩm ở các mức 50, 55, 60, 65, 70 và 75% đã được xác định để thu dịch enzyme chitinase Cuối cùng, hoạt độ của enzyme chitinase đã được xác định thông qua các thí nghiệm này.
2.4.6 Phương pháp xác định hoạt độ chitinase
2.4.6.1 Phương pháp xác định hoạt độ chitinase bằng đường đường phân giải
Chitinase phân giải chitin thành N-acetyl glucosamine và các cấu trúc mạch ngắn hơn không bắt màu với thuốc thử lugol Khi tương tác với thuốc thử này, kích thước của vòng phân giải trong môi trường sẽ phản ánh hoạt tính của chitinase Đường kính của vòng phân giải được sử dụng để xác định mức độ hoạt động của chitinase.
Cách tiến hành: Dùng khoan nút chai (d= 0,9 cm) vô trùng, khoan các lỗ thạch trờn MT nuụi cấy chủng ở cỏc đĩa peptri Dựng pipet vụ trựng 100àl dịch
Để xác định hoạt tính chitinase, cho 21 enzyme thô vào các lỗ khoan và giữ các hộp petri ở nhiệt độ phòng trong 1 đến 2 ngày Sau đó, sử dụng thuốc thử lugol để đo kích thước vòng phân giải (D-d, cm), trong đó D là đường kính vòng phân giải.
Nếu D – d ≥ 2,5 cm: hoạt tính enzyme mạnh
D – d ≥ 2,0 cm: hoạt tính enzyme khá mạnh
D – d ≥ 1,5 cm: hoạt tính enzyme trung bình
D – d ≤ 1,0 cm: hoạt tính enzyme yếu
2.4.6.2.Xác định hoạt độ enzym chitinase bằng phương pháp DNS
Hoạt tính chitinase được xác định dựa vào lượng đường khử N-acetyl-β-D-Glucosamine sinh ra trong phản ứng thủy phân Khi chitinase tác dụng với cơ chất dung dịch, N-acetyl-β-D-Glucosamine được định lượng qua phản ứng với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalisylic acid), tạo ra sản phẩm 3-amino-5-nitrosalicylic acid hấp thụ ánh sáng khả kiến ở bước sóng 535nm.
Tiến hành chiết tách enzym bằng dung dịch đệm, thu dịch lọc và ly tâm ở 600 vòng/phút trong 15 phút để thu enzym thô Trộn 1ml dịch enzym thô với 1ml dung dịch chitin 1%, ủ ở 50°C trong 60 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng 1ml NaOH 1N và đun cách thủy trong 5 phút Ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch thủy phân enzym và loại bỏ cặn Tiếp theo, thêm 1ml dung dịch DN 1%, lắc đều và đun cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh và thêm 5ml nước cất, lắc đều rồi đo OD ở bước sóng 535 nm Lượng glucosamine sinh ra được xác định theo đường chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine Một đơn vị hoạt tính chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μmol N-acetyl-β-D-Glucosamine (NAG) từ phản ứng thủy phân chitin trong 1 phút ở nhiệt độ 40°.
2.4.7 Xác định đường khử bằng DNS
Xây dựng đường khử bổ sung 2 ml thuốc thử DNS (5,3g DNS + 9,9g
NaOH + 153g K- Na- tartrat + 4,15g Na 2 S 2 O 5 + 708ml H 2 O) vào 0,5ml mẫu đường glucose, đun sôi trong 5 phút, làm lạnh nhanh, đo độ hấp thụ ở bước sóng
535 nm, dựa vào đồ thị đường chuẩn Glucosamine suy ra hoạt độ chitinase trong mẫu
Trong đó: X: hàm lƣợng glucosamine (μg /ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng
V: thể tích dịch enz me ban đầu (ml) v: thể tích enzyme TN (ml) t: thời gian phản ứng (phút)
Hoạt độ riêng ( HTR) = (CT2)
Trong đó: C: Nồng độ dịch enzyme (mg/ml)
Hàm lượng glucosamine ( u/ml) ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE BIỂU DIỄN MỐI TƯƠNG
QUAN GIỮA ΔOD VÀ HÀM LƢỢNG GLUCO AMINE
ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
3.1 Kết quả ảnh hưởng ôi trường và các nguồn Nito Cacbon đến hoạt độ chitinase của chủng Trichoderma atroviride
Các yếu tố như thành phần môi trường, nhiệt độ, pH và độ ẩm đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, tạo bào tử và khả năng sản xuất enzym Vì vậy, việc xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu được chitin là rất cần thiết.
3.1.1 Ảnh hưởng của MT đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase Để chọn môi trường thích hợp cho chủng Trichoderma atroviride sinh tổng hợp chitinase, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ chitinase của chủng
Trichoderma atroviride nghiên cứu trên MT1 và MT 3 trong 120 giờ Sau 24,
48, 72, 96, 120 giờ nuôi cấy tiến hành xác định hoạt độ chitinase Kết quả trình bày trong hình 3.1., bảng 3.1
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của ôi trường và thời gian đến họat độ enzyme chitinase
Hình 3.1 Đồ thị ảnh hưởng của MT rắn và MT lỏng đến hoạt độ chitinase của chủng Trichoderma atroviride theo thời gian
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính chitinase trong môi trường 1 (MT 1) và môi trường 2 (MT 2) thay đổi rõ rệt theo thời gian nuôi cấy Hoạt tính này tăng mạnh chỉ sau 24 giờ và đạt cực đại ở 72 giờ, sau đó giảm dần vào 96 giờ Điều này cho thấy trong giai đoạn đầu, chủng Trichoderma atroviride đã đồng hoá mạnh các nguồn carbon và nitơ để gia tăng sinh khối Sau 48 giờ, lượng sinh khối trong môi trường đã tăng đáng kể, tuy nhiên nguồn dinh dưỡng hấp thụ đã cạn kiệt Do đó, chủng này tiếp tục tổng hợp chitinase để phân giải nguồn chitin có trong môi trường Đến 72 giờ, hoạt độ chitinase đạt mức cao nhất, nhưng khi nguồn chitin đã được phân cắt hết và các sản phẩm cuối như N-acetyl-D-glucosamine gia tăng trong môi trường, chúng đã ức chế ngược lại quá trình sinh tổng hợp chitinase, dẫn đến xu hướng giảm hoạt tính chitinase.
Biểu đồ cho thấy môi trường rắn có hoạt độ cao hơn môi trường lỏng sau 72 giờ Do đó, môi trường rắn được chọn là phương tiện để khảo sát các yếu tố khác.
Theo tác giả Phạm Thị Lịch, Trần Thanh Thủy, Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm enzym chitinase thô từ chủng Trichoderma SP
25 đã nghiên cứu và nhận thấy ở môi trường rắn thì chủng Trichoderm SP có hoạt độ chitinase cao hơn so với môi trường lỏng.[11]
3.1.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon
2 Phản ứng của chitinase với DN
Nguồn cacbon Saccharose Lactose Glucose
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ chitinase cao ở cả ba nguồn cacbon saccharose, lactose và glucose Đặc biệt, hoạt độ enzym chitinase đạt mức cao nhất là 7,913 (U/ml) khi sử dụng saccharose, cho thấy đây là nguồn cacbon tối ưu để nuôi cấy sinh enzym chitinase ở chủng này.
Trichoderma atroviride là từ nguồn saccharose
3.1.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn Nito
Hình 3.3 phản ứng của chitinase v i DNS
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nguồn Nito đến hoạt độ chitinase thu từ chủng
Nguồn nito Cao nấm men Pepton
Sau khi nghiên cứu và tìm ra nguồn cacbon phù hợp với chủng
Trichoderma atroviride là từ nguồn saccharose Tiến hành xác định nguồn nito thích hợp của chủng Trichoderma atroviride kết quả của việc tha đổi nguồn
Nito nhận thấy rằng trong bảng 3.3, ở môi trường (MT) 2, khi thay đổi nguồn Nito từ các nguồn cao nấm men và pepton, kết quả cho thấy MT 2 chứa hàm lượng nấm men cao nhất với 8,290 (U/ml) Ngược lại, MT chứa hàm lượng pepton có hoạt động thấp hơn so với MT chứa nấm men Do đó, có thể kết luận rằng MT chứa hàm lượng nấm men cao là lựa chọn thích hợp để nuôi cấy chủng Trichoderma atroviride, giúp sinh ra hoạt độ chitinase cao nhất.
3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng
Nghiên cứu nuôi cấy Trichoderma atroviride trên môi trường với các tỷ lệ chitin thô khác nhau (5%, 10%, 15%, 20%) đã được thực hiện Sau 3 ngày nuôi cấy, hoạt độ chitinase được xác định và kết quả được trình bày qua bảng và hình ảnh minh họa.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng
Hình 3.4.Ảnh hưởng của chất cảm ứng đến hoạt độ chitinase
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi không có hoặc bổ sung 5% chitin thô vào môi trường, hoạt độ chitinase rất thấp, chứng tỏ rằng hàm lượng cơ chất quá thấp không đủ cho Trichoderma atroviride tổng hợp enzyme Khi nồng độ chitin tăng lên 10%, hoạt độ chitinase đạt 8,5 (U/ml), nhưng ở hàm lượng 20%, hoạt độ này giảm mạnh Điều này cho thấy việc tăng quá cao hàm lượng cơ chất có thể kéo dài pha tăng trưởng của chủng và làm tích tụ sản phẩm cuối và thứ cấp, từ đó ức chế sự tổng hợp chitinase Hàm lượng chitin từ 1% đến 1,5% được xác định là khoảng thích hợp để đạt được hoạt độ enzyme chitinase cao.
Nghiên cứu của tác giả Lê Thị Huệ cho thấy Trichoderma atroviride có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở nồng độ chitin từ 10% đến 15%, với nồng độ tối ưu là 10% Tương tự, tác giả Đinh Minh Hiệp cũng xác nhận rằng nồng độ chitin thô 10% là điều kiện lý tưởng cho sự phát triển và tổng hợp enzym chitinase trong quá trình nuôi cấy Trichoderma atroviride.
Dựa trên các nghiên cứu của tác giả, chúng tôi đã so sánh giá trị hoạt độ chitinase đạt được ở các hàm lượng khác nhau Để tối ưu hóa và tiết kiệm nguyên liệu, chúng tôi quyết định sử dụng hàm lượng chitin 10% cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố đến hoạt độ enzym của chủng Trichoderma atroviride
3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của của nhiệt độ đến hoạt độ chitinase
Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ chitinase
Chủng Trichoderma atroviride có khả năng sinh tổng hợp enzym chitinase với hoạt độ cao ở tất cả các điều kiện nhiệt độ khảo sát Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động này nằm trong khoảng 25-35°C, với mức cao nhất đạt được ở 30°C Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Huệ về nhiệt độ tối ưu cho Trichoderma tổng hợp chitinase.
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase
Bảng 3.5 Hoạt độ enzym chitinase thu từ chủng Trichoderma atroviride Độ ẩm
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của độ ẩ ôi trường đến hoạt độ chitinase
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng độ ẩm môi trường ban đầu tối ưu cho chủng Tri.3 trong việc tổng hợp enzyme chitinase với hoạt độ cao là từ 55 – 65%, đạt mức cao nhất ở 60%.
MT trên 70% thì hoạt độ chitnase giảm mạnh đáng kể Qua kết quả trên chúng tôi chọn độ ẩm MT nuôi cấy ban đầu là 60%
H o ạt độ Ch itinase (U/m l) Độ âm
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết Luận
Sau quá trình làm nghiên cứu chúng tôi rút ra một kết luận sau:
- Đã xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp để cho chủng
Trichoderma atroviride sinh trưởng và tổng hợp chitinase là môi trường rắn
Hàm lượng Nito và cacbon tối ưu cho việc nuôi cấy chủng Trichoderma atroviride đã được xác định, trong đó nguồn cacbon là saccharose và nguồn Nito là cao nấm men Khi sử dụng hàm lượng chitin là 10%, hoạt độ chitinase thu được sẽ đạt mức cao.
- Đã xác định đƣợc các yếu tố nhiệt độ là 30ᵒ C thời gian là 72 giờ, độ ẩm là 60% thích hợp cho hoạt độ chitinase tăng lên của chủng Trichoderma atroviride
-Tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của một số chủng khác nhau
-Tiếp tục nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi enz me nà trong lĩnh vực sản xuất
1 hưu phương Yến Anh (2007 ), nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Luận văn
Thạc sĩ inh Học, Trường Đại Học sư Phạm TP Hồ Chí Minh
2 Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ Luận văn Thạc sĩ
Sinh học, Trường đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ CHí Minh
3 Trần Thanh Thùy (1998), hưỡng dẫn thực hành vi sinh vật học NXB Giáo dục
4 Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase của Trichoderma và vai trò trong kiểm soát sinh học và công nghệ TP HCM, tr 153-160
5 Tô Du hương (2004), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzyme thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng trichoderma phân lập từ các loại đất khác nhâu thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ, Luận văn Thạc sĩ inh
Học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh
6 Nguy n Lân Dũng, Ngu n Đìm Qu ến, Phạm Văn T (1998), Vi sinh vật học NXB Giáo dục
7 Nguy n Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm của vi nấm NXB Khoa học và
8 Các tác giả Lê Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu
Công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichodrema
9 Lê Thị Huệ năm 2010 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichodrema
10 Đinh Minh Hiệp 2012 nghiên cứu chitinase và β-glucanase từ Trichoderma spp
11 Theo tác giả Phạm Thị Lịch, Trần Thanh Thủy, Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm enzym chitinase thô từ chủng Trichoderma SP
12 A.A Shubakov and P S Kucheryavykh (2004), chitinolytic Activity ofnFilamentos Fungi Applied Biochermistry and Microbiology Vol 40 No
