Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học VNUA Biomix của Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhằm xây dựng mô hình nuôi gà thịt và gà đẻ trên nền đệm lót sinh học Việc áp dụng công nghệ này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả chăn nuôi mà còn đảm bảo môi trường sống cho gia cầm, từ đó góp phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi ở Việt Nam.
- Đánh giá một số chỉ tiêu môi trường tiểu khí hậu chuồng nuôi gà trên nền đệm lót sinh học
Nghiên cứu xác định sự hiện diện của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, vi sinh vật hiếu khí, vi sinh vật có hại và ký sinh trùng trong nền đệm lót sinh học theo thời gian Việc theo dõi sự phát triển của các loại vi sinh vật này là cần thiết để đánh giá chất lượng và hiệu quả của hệ thống đệm lót sinh học.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Xây dựng mô hình ứng dụng chế phẩm sinh học VNUA Biomix làm đệm lót sinh học trong chăn nuôi gà tại tỉnh Hà Nam
- Phân tích, nuôi cấy mẫu vi sinh vật tại Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Xét nghiệm tìm trứng, ấu trùng giun sán, ký sinh trùng tại Bộ môn Ký sinh trùng, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2016 đến tháng 8/2017.
Đối tượng, thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Nền đệm lót sinh học trong chăn nuôi gà sử dụng chế phẩm VNUA Biomix của Học viện Nông nghiệp Việt Nam
3.3.2 Thiết bị và dụng cụ
Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng, tủ lạnh, cân điện tử, lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, máy tính…
Dụng cụ phân tích và xét nghiệm vi sinh vật (VSV) và ký sinh trùng (KST) bao gồm các thiết bị như lamen, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thủy tinh, ống nghiệm, đĩa Petri, micropipette, ống tiêm, giá ống nghiệm, cùng với các dụng cụ thủy tinh và nhiệt kế.
Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng trong phòng thí nghiệm đều phải được rửa sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 120 o C trong 15 phút
Theo dõi nồng độ một số khí trong chuồng nuôi (H2S, NH3, CO2) bằng Kít đo khí thương mại (KITAGAMA - Gas detector tube system - Nhật Bản).
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp lựa chọn và bố trí mô hình
Dựa trên kết quả phân lập và xác định đặc tính sinh học, chúng tôi đã chọn các chủng vi khuẩn Lactic, Bacillus subtilis, vi khuẩn quang hợp (Bacterio chlorofin, Green sunfuabacteria), xạ khuẩn (Actinomyces) và nấm men thuộc chi Saccaromyces để phát triển chế phẩm sinh học VNUA Biomix tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mô hình chăn nuôi gà trên nền đệm lót sinh học đã được triển khai tại tỉnh Hà Nam nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo vệ môi trường.
Bài viết đề cập đến việc xây dựng 3 mô hình nuôi gà thịt và 3 mô hình nuôi gà đẻ trên nền đệm lót sinh học tại 3 hộ chăn nuôi gà ở tỉnh Hà Nam, mỗi hộ áp dụng 1 mô hình nuôi gà thịt và 1 mô hình nuôi gà đẻ với quy mô 1.000 con Các lô thí nghiệm và đối chứng được bố trí ở 2 dãy chuồng khác nhau, với chế độ chăm sóc và nuôi dưỡng giống nhau Điểm khác biệt là lô thí nghiệm được bổ sung chế phẩm sinh học VNUA Biomix vào nền đệm lót, trong khi lô đối chứng không sử dụng chế phẩm vi sinh.
Tỷ lệ sử dụng chế phẩm VNUA Biomix là 1kg cho 20 m² nền chuồng Chế phẩm này cần được trộn đều với bột ngô hoặc cám gạo, sau đó làm ẩm và ủ ấm trong 1-2 ngày Cuối cùng, rắc đều hỗn hợp lên nền chuồng đã được rải lớp mùn cưa hoặc trấu.
Giống gà được nuôi trong mô hình là gà Lương Phượng, với mật độ chuồng nuôi gà thịt là 5-15 con/m² và gà đẻ là 5 con/m² Thời gian theo dõi gà thịt bắt đầu từ tuần tuổi thứ 1 đến tuần thứ 17, sau đó lặp lại theo chu kỳ nuôi, trong khi gà đẻ sẽ được theo dõi từ tuần tuổi thứ 18 trở đi.
3.4.2 Phương pháp xác định sự tồn tại của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
Lấy mẫu từ nền đệm lót: cân 1g mẫu cho vào bình tam giác có chứa 9ml nước muối sinh lí vô trùng lắc đều được nồng độ pha loãng 10 -1
Chuẩn bị hai dãy ống nghiệm, mỗi dãy gồm bốn ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng, được đánh số từ 1 đến 4, để tiến hành pha loãng mẫu theo cơ số.
10 Dùng mycropipet hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất và chế phẩm cần phân lập có nồng độ pha loãng 10 -1 cho vào ống nghiệm và lắc đều bằng máy rotex được nồng độ 10-2 tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng Tiếp theo chọn ống nghiệm có độ pha loãng 10 -3 , 10 -4 , …10 -8 Sau đó, dùng mycropipet hút 0.1ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lập lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA vào tủ ấm 37 o C/ 24h Tiếp theo, quan sát sự hình thành khuẩn lạc trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacills subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên thạch nghiêng
Trên môi trường thạch đĩa TSA, Bacillus subtilis tạo ra khuẩn lạc hình tròn với rìa răng cưa không đều và tâm sẫm màu, có màu vàng xám, đường kính từ 3-5 mm Sau vài ngày, bề mặt khuẩn lạc trở nên nhăn nheo và hơi sẫm màu.
Trên môi trường thạch nghiêng TSA: Dễ mọc, tạo thành màu tro xám, rìa gợn sóng
Trong môi trường canh TSB, quá trình phát triển tạo ra hiện tượng đục môi trường, hình thành màng nhăn trên bề mặt và lắng cặn kết tụ như vẩn mây ở đáy Khi lắc đều, các cặn này khó tan, gây ảnh hưởng đến chất lượng môi trường.
Sơ đồ xác định sự tồn tại của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis như sau:
Hình 3.1 Sơ đồ xác định sự tồn tại của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
Mẫu đệm lót Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu: Cân 1g mẫu + 9 ml dd NaCl 0,9%
Dung dịch pha loãng mẫu 10 -
Lần lượt pha loãng mẫu thành các nồng độ tiếp theo 10 -2 , …
Hút 0,1ml dung dịch pha loãng ở mỗi nồng độ cấy lên thạch đĩa TSA
Chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa Ủ ở 37 o C/ 24h
Giữ giống trên môi trường TSA nghiêng
3.4.3 Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí
Sử dụng phương pháp cấy láng trực tiếp trên thạch PCA, mỗi mẫu cần được nuôi cấy ở ít nhất 3 nồng độ khác nhau trên 2 đĩa petri Đối với từng nồng độ, hút 0,1 ml dung dịch mẫu và cho vào đĩa đã được đổ thạch PCA Sử dụng ống nghiệm thủy tinh nhỏ với đáy phẳng để dàn đều dung dịch mẫu trên bề mặt thạch Sau đó, đặt đĩa trong tủ ấm ở 37°C trong 24 giờ, rồi tiến hành đọc kết quả.
Sau 24 giờ, các đĩa petri được lấy ra để đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả Sự phân bố của các khuẩn lạc trên đĩa thạch phải hợp lý, với độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành các bước nuôi cấy lại Tổng số vi khuẩn hiếu khí được tính theo công thức sau:
Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/g) = ∑C/(n1+0.1n2).d
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa thạch đã chọn n1, n2: số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tục thứ 1 và thứ 2
3.4.4 Phương pháp xác định vi sinh vật chỉ điểm vệ sinh (Coliform), E Coli
Sử dụng phương pháp cấy láng trực tiếp trên thạch MacConkey (Maria F.C., 2009) Đọc kết quả: trên môi trường thạch Mac Conkey sau khi nuôi cấy
Ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ, Coliform tạo thành các khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu đỏ cánh sen, hơi lồi, không nhày và có rìa gọn mà không làm thay đổi màu môi trường Lấy từ 3-5 khuẩn lạc đặc trưng để cấy sang thạch TSI và ủ ở 37°C trong 24 giờ Kết quả cho thấy trên thạch TSI, Coliform làm cho cả mặt nghiêng và mặt đáy của thạch đều chuyển sang màu hồng.
Sử dụng que cấy vô trùng để chạm vào khuẩn lạc từ những ống dương tính, sau đó ria cấy trên thạch EMB Để mẫu ở nhiệt độ 42,5°C trong 24 giờ, rồi tiến hành đọc kết quả Khuẩn lạc E.coli sẽ có màu ánh kim đặc trưng.
Từ những khuẩn lạc điển hình giám định tiếp tính chất sinh hóa phản ứng IMViC Nếu là E.coli:
- Phản ứng Indol: E.coli dương tính làm môi trường có màu đỏ, E.coli không điển hình có phản ứng âm tính màu vàng nhạt
Phản ứng đỏ Methyl là một phương pháp xác định khả năng lên men đường của vi khuẩn Để thực hiện, cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton glucogen và ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong khoảng 24-48 giờ Sau đó, nhỏ 5 giọt thuốc thử methyred vào mẫu Kết quả được đọc như sau: nếu E.coli có phản ứng dương tính, màu sắc sẽ chuyển sang đỏ, trong khi phản ứng âm tính sẽ hiển thị màu vàng.
- Phản ứng Voges-Prokauer: E.coli có phản ứng âm tính: không màu hoặc màu vàng
Trên môi trường thạch Simon-Citrat, việc cấy vi khuẩn E.coli trên bề mặt thạch nghiêng và ủ ở 37 độ C trong thời gian từ 1 đến 3 ngày cho thấy E.coli không sinh trưởng, thể hiện phản ứng âm tính Để xác định sự hiện diện của Salmonella, cần áp dụng các phương pháp chuyên biệt.
Phương pháp xác định Salmonella được tiến hành theo sơ đồ sau:
Hình 3.2 Sơ đồ xác định Salmonella
Môi trường dung dịch đệm Pepton (225ml) Ủ 37 0 C/16-18h
Môi trường Muler Kauffmanm (10ml) Ủ 37 0 C/24-48h
Ria cấy trên thạch Rambach, ủ ở 37 0 C trong 24h, chọn khuẩn lạc rìa gọn, màu đỏ
Ria cấy trên thạch XLT, ủ ở
37 0 C trong 24h, chọn khuẩn lạc đen, bóng, rìa gọn
Chọn khuẩn lạc đặc trưng ria cấy trên thạch Tripple Sugar Iron Agar, ủ ở 37 0 C trong 24h, chọn khuẩn lạc rìa gọn, màu đỏ
Tiến hành các phản ứng sinh hóa:
3.4.6 Phương pháp nghiên cứu sự tồn tại của trứng, ấu trùng ký sinh trùng đường tiêu hóa và ngoại ký sinh trùng
Xác định trứng ký sinh trùng bằng phương pháp Fuleborn và Phương pháp gạn rửa sa lắng
Nguyên lý là: lợi dụng tỷ trọng của một số dung dịch lớn hơn tỷ trọng của trứng giun sán làm cho trứng giun sán nổi lên trên
Để thực hiện quy trình, lấy 5 - 10 gram mẫu phân cho vào một cốc nhỏ, sau đó khuấy đều với 40 - 50 ml nước muối NaCl bão hòa bằng đũa thủy tinh Tiếp theo, lọc dung dịch qua lưới lọc để loại bỏ cặn bã và để yên trong lọ tiêu bản (miệng hẹp, đáy rộng) trong khoảng 15 - 30 phút để trứng nổi lên Sử dụng vòng vớt thép có đường kính 5 mm để vớt lớp váng trên cùng, sau đó đặt lên phiến kính, đậy lam kính và kiểm tra dưới kính hiển vi để tìm trứng giun sán.
