Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học VNUA Biomix từ Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhằm xây dựng mô hình nuôi gà thịt và gà đẻ hiệu quả trên nền đệm lót sinh học Việc áp dụng công nghệ sinh học này không chỉ nâng cao năng suất chăn nuôi mà còn bảo vệ môi trường, tạo ra sản phẩm an toàn cho người tiêu dùng.
- Đánh giá một số chỉ tiêu môi trường tiểu khí hậu chuồng nuôi gà trên nền đệm lót sinh học.
Nghiên cứu xác định sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus subtilis, các vi sinh vật hiếu khí, vi sinh vật gây hại và ký sinh trùng trong nền đệm lót sinh học theo thời gian.
- Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học của đàn gà trên nền đệm lót sinh học.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Xây dựng mô hình ứng dụng chế phẩm sinh học VNUA
Biomix làm đệm lót sinh học trong chăn nuôi gà tại tỉnh Hà Nam.
- Phân tích, nuôi cấy mẫu vi sinh vật tại Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Xét nghiệm tìm trứng, ấu trùng giun sán, ký sinh trùng tại Bộ môn Ký sinh trùng, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Đối tượng, thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Nền đệm lót sinh học trong chăn nuôi gà sử dụng chế phẩm VNUA Biomix của Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.3.2 Thiết bị và dụng cụ
Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng, tủ lạnh, cân điện tử, lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, máy tính….
Dụng cụ cần thiết để phân tích và xét nghiệm vi sinh vật (VSV) và ký sinh trùng (KST) bao gồm: lamen, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thủy tinh, ống nghiệm, đĩa Petri, micropipette, ống tiêm, giá ống nghiệm, các dụng cụ thủy tinh và nhiệt kế.
Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng trong phòng thí nghiệm đều phải được rửa sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 120 o C trong 15 phút.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp lựa chọn và bố trí mô hình
Dựa trên kết quả phân lập và xác định đặc tính sinh học, chúng tôi đã chọn các chủng vi khuẩn Lactic, Bacillus subtilis, vi khuẩn quang hợp (Bacterio chlorofin, Green sunfuabacteria), xạ khuẩn (Actinomyces) và nấm men thuộc chi Saccaromyces để phát triển chế phẩm sinh học VNUA Biomix tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mô hình chăn nuôi gà trên nền đệm lót sinh học đã được triển khai tại tỉnh Hà Nam nhằm nâng cao hiệu quả chăn nuôi.
Bài viết mô tả việc xây dựng 3 mô hình nuôi gà thịt và 3 mô hình nuôi gà đẻ trên nền đệm lót sinh học tại 3 hộ chăn nuôi gà ở tỉnh Hà Nam, mỗi hộ thực hiện 1 mô hình nuôi gà thịt và 1 mô hình nuôi gà đẻ với quy mô 1.000 con Các lô thí nghiệm và đối chứng được bố trí ở 2 dãy chuồng khác nhau, với chế độ chăm sóc và nuôi dưỡng giống nhau Sự khác biệt duy nhất là lô thí nghiệm được bổ sung chế phẩm sinh học VNUA Biomix vào nền đệm lót, trong khi lô đối chứng không sử dụng chế phẩm vi sinh.
Tỷ lệ sử dụng chế phẩm VNUA Biomix là 1kg cho 20m² nền chuồng Chế phẩm này cần được trộn đều với bột ngô hoặc cám gạo, sau đó làm ẩm và ủ ấm trong 1-2 ngày Cuối cùng, rắc đều hỗn hợp lên nền chuồng đã được rải lớp mùn cưa hoặc trấu.
Giống gà được nuôi trong mô hình là gà Lương Phượng, với mật độ chuồng nuôi gà thịt từ 5 đến 15 con/m² và gà đẻ là 5 con/m² Thời gian theo dõi gà thịt diễn ra từ tuần tuổi thứ nhất đến tuần thứ 17 và được lặp lại theo chu kỳ nuôi, trong khi gà đẻ sẽ được theo dõi từ tuần tuổi thứ 18 trở đi.
3.4.2 Phương pháp xác định sự tồn tại của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
Lấy mẫu từ nền đệm lót: cân 1g mẫu cho vào bình tam giác có chứa 9ml nước muối sinh lí vô trùng lắc đều được nồng độ pha loãng 10 -1
Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy gồm 4 ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng, được đánh số từ 1 đến 4, để thực hiện pha loãng mẫu theo cơ số.
10 Dùng mycropipet hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất và chế phẩm cần phân lập có nồng độ pha loãng 10 -1 cho vào ống nghiệm và lắc đều bằng máy rotex được nồng độ 10-2 tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng Tiếp theo chọn ống nghiệm có độ pha loãng 10 - 3 , 10 -4 , …10 - 8 Sau đó, dùng mycropipet hút 0.1ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lập lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA vào tủ ấm 37 o C/ 24h Tiếp theo, quan sát sự hình thành khuẩn lạc trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacills subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên thạch nghiêng.
Trên môi trường thạch đĩa TSA, Bacillus subtilis tạo thành các khuẩn lạc tròn với rìa răng cưa không đều và tâm sẫm màu Các khuẩn lạc này phát triển chậm, có màu vàng xám và đường kính từ 3-5 mm Sau vài ngày, bề mặt của khuẩn lạc trở nên nhăn nheo và hơi sẫm màu.
Trên môi trường thạch nghiêng TSA: Dễ mọc, tạo thành màu tro xám, rìa gợn sóng.
Trong môi trường canh TSB, quá trình phát triển tạo ra sự đục môi trường, hình thành màng nhăn trên bề mặt và lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khiến cho khi lắc đều, chúng khó tan.
Sơ đồ xác định sự tồn tại của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis như sau:
Mẫu đệm lót Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu: Cân 1g mẫu + 9 ml dd NaCl 0,9%
Dung dịch pha loãng mẫu 10 -
Lần lượt pha loãng mẫu thành các nồng độ tiếp theo 10 -2 , ….
Hút 0,1ml dung dịch pha loãng ở mỗi nồng độ cấy lên thạch đĩa TSA Ủ ở 37 o C/ 24h
Chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa
Giữ giống trên môi trường TSA nghiêngHình 3.1 Sơ đồ xác định sự tồn tại của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
3.4.3 Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí
Sử dụng phương pháp cấy láng trực tiếp trên thạch PCA, mỗi mẫu cần được nuôi cấy ở ít nhất 3 nồng độ khác nhau trên 2 đĩa petri Tại từng nồng độ, lấy 0,1 ml dung dịch mẫu và cho vào đĩa đã chuẩn bị thạch PCA Sử dụng ống nghiệm thủy tinh có đáy phẳng để dàn đều dung dịch mẫu trên bề mặt thạch Sau đó, đặt đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ và cuối cùng tiến hành đọc kết quả.
Sau 24 giờ, các đĩa petri được lấy ra để đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả Sự phân bố của các khuẩn lạc trên đĩa thạch phải hợp lý, với độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành các bước nuôi cấy lại Tổng số vi khuẩn hiếu khí được tính theo công thức sau:
Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/g) = ∑C/(n1+0.1n2).d
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa thạch đã chọn n1, n2: số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tục thứ 1 và thứ 2 3.4.4 Phương pháp xác định vi sinh vật chỉ điểm vệ sinh (Coliform), E Coli
Sử dụng phương pháp cấy láng trực tiếp trên thạch MacConkey (Maria F.C., 2009) Đọc kết quả: trên môi trường thạch Mac Conkey sau khi nuôi cấy
Ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ, Coliform hình thành các khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu đỏ cánh sen, hơi lồi và không nhày, với rìa gọn không làm chuyển màu môi trường Lấy 3-5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang thạch TSI và ủ ở 37°C trong 24 giờ để đọc kết quả Trên thạch TSI, Coliform tạo màu hồng cho cả mặt nghiêng và mặt đáy của thạch.
Sử dụng que cấy vô trùng, chạm vào khuẩn lạc từ ống dương tính và ria cấy trên thạch EMB Đặt ở nhiệt độ 42,5°C trong 24 giờ, sau đó đọc kết quả Khuẩn lạc E.coli sẽ có màu ánh kim đặc trưng.
Từ những khuẩn lạc điển hình giám định tiếp tính chất sinh hóa phản ứng
- Phản ứng Indol: E.coli dương tính làm môi trường có màu đỏ, E.coli không điển hình có phản ứng âm tính màu vàng nhạt.
Phản ứng đỏ Methyl là một phương pháp xác định khả năng lên men glucose của vi khuẩn Để thực hiện, cần cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton glucogen và ủ ở 37 độ C trong khoảng 24-48 giờ Sau đó, nhỏ 5 giọt thuốc thử methyred vào môi trường và đọc kết quả Nếu E.coli có phản ứng dương tính, môi trường sẽ chuyển sang màu đỏ, trong khi phản ứng âm tính sẽ cho màu vàng.
- Phản ứng Voges-Prokauer: E.coli có phản ứng âm tính: không màu hoặc màu vàng.
- Trên môi trường thạch Simon-Citrat: Ria cấy vi khuẩn trên mặt môi trường thạch nghiêng, ủ 37 0 C từ 1-3 ngày E.coli không sinh trưởng phản ứng âm tính
3.4.5 Phương pháp xác định Salmonella
Phương pháp xác định Salmonella được tiến hành theo sơ đồ sau :
Môi trường dung dịch đệm Pepton (225ml) Ủ 37 0 C/16-18h
Ria cấy trên thạch Rambach, ủ ở 37 0 C trong 24h, chọn khuẩn lạc rìa gọn, màu đỏ
Môi trường Muler Kauffmanm (10ml) Ủ 37 0 C/24-48h
Ria cấy trên thạch XLT, ủ ở
37 0 C trong 24h, chọn khuẩn lạc đen, bóng, rìa gọn.
Chọn khuẩn lạc đặc trưng ria cấy trên thạch Tripple Sugar Iron Agar, ủ ở 37 0 C trong 24h, chọn khuẩn lạc rìa gọn, màu đỏ
Tiến hành các phản ứng sinh hóa:
- Lysine Decarboxylase: +Hình 3.2 Sơ đồ xác định Salmonella
3.4.6 Phương pháp nghiên cứu sự tồn tại của trứng, ấu trùng ký sinh trùng đường tiêu hóa và ngoại ký sinh trùng
Xác định trứng ký sinh trùng bằng phương pháp Fuleborn và Phương pháp gạn rửa sa lắng.
Nguyên lý là: lợi dụng tỷ trọng của một số dung dịch lớn hơn tỷ trọng của trứng giun sán làm cho trứng giun sán nổi lên trên.
Để thực hiện quy trình, lấy từ 5 đến 10 gram mẫu phân cho vào một cốc nhỏ, sau đó dùng đũa thủy tinh khuấy đều trong 40 - 50 ml nước muối NaCl bão hòa Tiến hành lọc qua lưới lọc để loại bỏ cặn bã, sau đó để dung dịch lọc yên trong lọ tiêu bản có miệng hẹp và đáy rộng Sau khoảng 15 - 30 phút, trứng sẽ nổi lên Sử dụng vòng vớt thép có đường kính 5 mm để lấy lớp váng ở phía trên, đặt lên phiến kính và đậy lam kính, sau đó kiểm tra dưới kính hiển vi để tìm trứng giun sán.