NỘI DUNG CHUONG 1. TONG QUAN TAI LIEU
2.2. PHUONG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp tách chiết các phân đoạn dich chiét tir loai Morinda umbellata L. Day của loài được thu về ,chặt nhỏ, rửa sạch, phơi khô, sau đó nghiền thành bột. Tiến hành ngâm 2 kg bột thân lá của loài với ethanol 80%.
Quá trình ngâm chiết được tiến hành lặp lại 3 lần. Phần nước lọc được lọc 2 lần qua giấy lọc để loại bỏ cặn thu được dịch chiết. Cô cạn dịch chiết thô bằng máy cô quay chân không thu được cao tổng số. Cao tổng số sau khi hoà tan lại trong nước cất được chiết qua các loại dung môi có độ phân cực tăng dần:
n-hexan; chloroform; ethylaxetat. Cất loại dung môi thu được sau khi chiết thu lấy cao của các phân đoạn.
Phương pháp làm khô mẫu tuyệt đối: Cân chính xác 0,5 g cao mỗi phân đoạn, cho vào từng ống nghiệm riêng biệt đã được cân trọng lượng từ trước.
Sấy mẫu ở 110°C trong 24 giờ rồi đưa ra đóng nắp lại cho vào buồng cân điện
tử trong 10 phút rồi rút nắp ra cân ngay. Quá trình trên được lặp lại 3 lần với
mỗi phân đoạn dịch chiết và tính kết quả trung bình.
Khối lượng các phân đoạn dịch chiết trong các thí nghiệm được tính
gián tiếp từ thành phần % của mẫu khô tuyệt đối.
Dây Mặt quỷ khô
Chiết ethanol 80% 3 lần
— Bổ xung nước, n-hexan (tỉ lệ 1:1)
ô— 30 xung cloroform
Cao phan doan n - hexan
Cao phan doan cloroform
Cao phan doan ethylaxetat
Bổ xung ethylaxetat
Cao phan đoạn nước
Hình 2.1 . Quy trình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ dây
Mặt quỷ
2.2.2. Khảo sát thành phần hóa học các phân đoạn dịch chiết 2.2.2.1. Dinh tinh flavonoid
- Phan ung Shinoda
Pha mẫu thử trong ethanol với lượng thích hợp. Sau đó cho vào vài giọt axit HCI đặc, chia dung dịch nhận được vào 2 ống:
+ Ống 1: Dùng đề làm ống đối chứng
+ Ống 2: Thêm vài mảnh Mg, đun trên nồi cách thuý trong vài phút.
Phán ứng cho kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay đa cam.[33]
- Phản ứng diazo hóa
Dung dịch thử được pha như trên. Chia dung dịch nhận được vào 2 ống:
+ Ống 1: Dùng làm ống đối chứng
+ Ống 2: Nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính.[33]
- Phản ứng với acid sunfuric
Dung dịch thử được pha như trên. Chia dung dịch nhân được vào 2 ống:
+ Ong 1: Dùng làm ống đối chứng.
+ Ống 2: Nhỏ thêm vài giọt dung dịch axit sulfuric
Phán ứng có màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của các flavone và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcone và aurone. [33]
- Phản ứng với dụng dịch kiềm
Dung dịch thử được pha như trên. Chia đung dịch nhân được vào 2 ống:
+ Ống 1: Dùng làm ống đối chứng
+ Ống 2: Nhỏ thêm vài giọt dung dịch NaOH10%.
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam. [33]
2.2.2.2. Dinh tính tannin
Dung dich được pha như trên, cho dung dịch vào 2 ống nghiệm.
- Phản ứng voi vanilin
+ Ống I: Đối chứng.
+ Ống 2: Thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H;SO,.
Phản ứng cho kết quả dương tính khi sản phẩm có màu đỏ đậm.
- Phan ứng với FeCl;
+ Ống I1: Đối chứng.
+ Ống 2: Thêm vải giọt dung dịch FeCl; 1%.
Phản ứng cho kết quả dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu lục, tía, lam, xanh hay đen.
- Phản ứng với genlatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong đung dịch xuất hiện vẫn đục.
- Phản ứng với chi acetate: Cho vai giot dung dich chi acetate 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa.
2.2.2.3. Dinh tính glycosid (Phan wng Keller — Killian)
Dung dich A: 50 ml CH;COOH 10% + 0,5 ml FeCl; 5%.
Dung dịch B: 50 ml H;SO¿ đặc + 0,5 ml FeCl; 5%.
Cho 0,01 g mẫu thử vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch A hòa tan hết mẫu, nghiêng ống nghiệm cho từ từ dung dịch B vào. Phản ứng đương tính là xuất hiện màu nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.2.2.4. Định tính alkaloid
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% để tiến hành các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendorf
Phản ứng của ankaloid cho kết tủa có màu đặc trưng, đó là phản ứng Dragendrorf
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng.
Hoá chất: HCI 1%; CH;COOH đặc; KI
Dung cu: Binh cầu hoặc bình nón dung tích 100ml, nồi cách thuỷ
(100°C)
Chuẩn bị thuốc thử Dragendorf: Pha dung dịch hỗn hợp gốc gồm:
a) dung dịch bismut nitrat trong axit (cân 0,85 g bismuth nitrat hoa tan
trong 40ml nước, thêm 10ml CHạCOOH đặc, lắc đều).
b) dung dịch kali iôđua (cân 20g KT hoà tan trong 50ml nước).
Sau đó trộn lẫn hai dung dịch a và b với nhau ta được dung dịch gốc. Lấy
20ml dung dịch gốc này, thêm 10ml nước và 20ml CH;COOH đặc, lắc đều,
nhận được dung dịch thuốc thử để sử dụng
Cách làm: Chiết ankaloid từ nguyên liệu thực vật. Cân Ig nguyên liệu tươi, cắt nhỏ, cho vào bình cầu hoặc bình nón, thêm vào đó 25ml HCI 1%, đun trên nồi cách thuỷ đang sôi trong 5 phút. Đề nguội, lọc qua giấy lọc, thu
lấy dung dịch để làm phản ứng định tính.
+Phản ng Dragendorƒ': Trong môi trường axit rất nhiều ankaloid cho kết tủa màu đỏ da cam hoặc đỏ gạch với thuốc thử Dragendorf có chứa KI và Bi(NO3);.
Cho vào ống nghiệm Iml dung dich chiết ankaloid, nhỏ từng giọt thuốc thử, quan sát sự tạo kết tủa.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hén hop KI va I, trong dung dich HCl):
phan ting cho két tha mau nau s4m.
- Phản ứng với Vans — Mayer
Thêm vài giọt thuốc thử Vans — Mayer vào dung dịch chữa mẫu thử, phản ứng cho kết quả dương tính khi sán phẩm có kết tủa màu trắng hay vàng nhạt [32].
2.2.3. Sắc ký lớp móng
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mong trang san DC-Aflolien 60 F;ạs; (Merck), RPusgFạ; (Merck) bằng hệ dung môi Toluen:
Ethylaxetat:Aceton:Acid formic(TEAF) 5:3:1:1. Dung chất hiện màu là