NỘI DUNG CHUONG 1. TONG QUAN TAI LIEU
CHUONG 3. CHUONG 3. KET QUA NGHIEN CUU VA THAO LUAN
3.1. TACH CHIET, DINH TINH, DINH LUQNG CAC HOP CHAT TU’ NHIEN TU DAY MAT QUY (MORINDA UMBELLATA L.)
3.1.1. Kết quả tách chiết các phân đoạn
2000g Dây Mặt quỷ khô
+ ethanol (80%)3 lần
736g Cao ethanol ¡ — Bổ xung nước, n-hexan 1
ô— Bổ xung cloroform
Bổ xung ethylaxefat
102g Cao PD <—
cloroform
46g Cao PD 158 g Cao PD
ethylaxetat nước
Hình 3.1. Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ dây Mặt quỷ (Morinda umbellata L.)
Với phương pháp tách chiết nêu trên, sau khi cất loại dung môi, chúng tôi đã thu được cao các phân đoạn với độ phân cực khác nhau. Cao phân đoạn n-hexan có độ phân cực nhỏ nhất, tiếp đến là phân đoạn chloroform, ethylaxetat và cuối cùng là phân đoạn nước có độ phân cực lớn nhất. Sau khi
trích lại 48,9%(360g)cao tông số để làm các thí nghiệm chúng tôi tiến hành
tách chiết và thu được các cao phân đoạn dịch chiết với hàm lượng nước trong
còn lại từ 80 đến 85%.
Từ tý lệ hợp chất khô tuyệt đối có trong các phân đoạn dịch chiết,
chúng tôi tính toán được khối lượng cao khô thuộc mỗi phân đoạn. Kết quả được trình bày trong bang 3.1.
Bảng 3.1.Khối lượng khô của các phân đoạn dịch chiết (g)
Mẫu L$ Nguyên liê Cao Cao Cao Cao Cao
“No *“ ) EtOH | PD PD PD PD
Loài tông sô | n-hex Chl EtOAc | H,O
Mat quy 2000 736 70 102 46 158
Bảng 3.2. Hiệu suất tách các phân đoạn tính theo phan trăm nguyên liệu
khô dây Mặt quỷ
Phõn đoạn Khối lượng(ứ) Hiệu suất chiết rỳt (% nguyên liệu khô)
Cao ethanol 736 18,8
Cao n — hexan 70 3,5
Cao cloroform 102 5,1
Cao ethylaxetat 46 23
Cao pđ nước 158 7,9
Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy hàm lượng cao
tong số có trong mẫu khô của loài Mặt quỷ là 18,8% . Bên cạnh đó, trong thành phần của dịch chiết cao cồn tổng số, thành phần các chất có độ phân cực khác nhau. Hàm lượng các chất tan trong trong nước chiếm tỷ lệ lớn
nhất, chiếm 7,9% cao tổng số. Trong khi các chat it phân cực tan trong n- hexan và chloroform chiếm tỷ lệ khá thấp chiếm tỉ lên lần lượt là 3,5%, 5,1%
và cao phân đoạn EtOAc chiếm tỉ lệ thấp nhất 2,3%. Khối lượng cao các phân đoạn nêu trên đủ đề chúng tôi thực hiện các phản ứng định tính, định lượng và thí nghiệm trên mô hình chuột bị bệnh.
3.1.2. Định tính các hợp chất tự nhiên từ các phân đoạn dịch chiết
Chúng tôi tiến hành thử định tính các hợp chất bằng phản ứng thử đặc trưng như đã trình bày chỉ tiết ở phần phương pháp nghiên cứu, kết quả định tính được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả thứ định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân doan dich chiét day Morinda umbellata L.
Nhom _, xa
chất Phản ứng nhận biết |E(OH | n-hex | Chỉ EtOAc
- Shinoda ++ +++ ++ ++
- Diazo hoa + +++ + ++
Flovonoid
- Dd NaOH10% ++ +++ ++ ++
- Dd axit sulfuric +4+ +++ + +++
Dd FeCl; 5% ++ ++ ++ ++
Tannin Dd gelatin/NaCl +++ +++ - _
Dd chì acetate +++ +++ +++ -
Catechin | -Dd vanillin trong HCI - - - -
Glycosid | -Keller — Kilian + ++ + +
Alkaloid |- TTVans - Mayer - ++ - -
- TT Dragendorf - - - -
- TT Bouchardat - - - -
(+) : mức phản ứng dương tính; ( - ) : phan ting am tinh
Kết quả trình bày ở bảng 3.3 còn cho thấy một số phân đoạn dịch chiết
từ đây mặt quỷ cho kết quả đương tính với các thuốc thử trên. Đáng chú ý là
phán ứng định tính tannin, Flovonoid của các phân đoạn cho kết quả khá rõ, song phan ứng định tính tanin ở phân đoạn EtOAc lại chậm hơn so với các
phân đoạn khác. Qua đó cũng có thể sơ bộ nhận xét trong dịch chiết dây Mặt
quý có chứa chủ yếu các hợp chất thuộc lớp chất flovonoid và tannin và glycosid. Trong các phân đoạn dịch chiết thì phân đoạn n — hexan cho phản ứng dương tính với polyphenol mạnh nhất. Điều này hoàn toàn phù hợp với sắc ký đồ dưới đây. Phân ứng định tính Alkaloid chủ yếu cho kết quả âm tính,chỉ duy nhất phân đoạn n — hexan là cho kết quả dương tính khá rõ.
3.1.3. Phân tích các thành phần hợp chất tự nhiên từ dây Mặt quỷ bằng sắc kí lớp mỏng
Để tìm hiểu chắc chắn hơn về thành phần định tính của các phân đoạn dịch chiết của loài Mặt quỷ, chúng tôi tiến hành chạy sắc ký các phân
đoạn dịch chiết...
Chúng tôi tiến hành chạy sắc kí bản mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, nhưng hệ dung môi cơ bản TEAE : 5: 3: 1: 1 cho kết quả rõ nhất. Sắc kí đồ của các phân đoạn dịch chiết dây Mặt quỷ cho nhiều màu khác nhau khi nhuộm bằng dung dịch H;SO, 10% (hình 3.2), và màu sắc của các băng cũng có độ đậm nhạt khác nhau. Điều này chứng tỏ hàm lượng của các hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn là khác nhau. Kết quá thê hiện trên ảnh sắc ký đồ hình 3.2.[7]
Ghi chi:
0 - Chất chuẩn Quecetin 1 — Cao cồn tổng số
2 — Cao phân đoạn n — hexan 3 — Cao phân đoạn cloroform 4— Cao phân đoạn ethylaxetat 5 - Cao phân đoạn nước
Hình 3.2. Anh chạy sắc ký đồ dịch chiết dây Mặt quỷ
Hình ảnh sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy có xuất hiện rất nhiều các băng
vạch có màu sắc và Rf khác nhau. Trên sắc ký đồ xuất hiện khá nhiều vạch
màu vàng (các hợp chất thuộc nhóm flavonoid) và màu tím (tecpen). Về mặt lý thuyết, mỗi băng vạch tương ứng với một chất nhất định song trên thực tế có nhiều băng vạch gối lên nhau. Trên sắc ký đồ chúng tôi nhận thấy phân đoạn cao n — hexan xuất hiện nhiều băng vạch nhất, tiếp đến là phân đoạn chloroform. Số vạch ở hai phân đoạn này dao động từ 12 đến 15 trong đó có nhiều vạch trùng nhau hoặc gối lên nhau. Phân đoạn EtOAc có khá ít vạch, số lượng băng vạch là 7. Như vậy ở loài thực vật nghiên cứu, phân đoạn cao tổng số và phân đoạn n - hexan có chứa nhiều nhóm hợp chất flavonoid và tannin nhất. Kết quả này cũng phù hợp với mức độ của các phản ứng định tính trình bày trên bảng 3.3.
Bảng 3.4. Đặc điểm các băng vạch của các phân đoạn dịch chiết từ dây
Mặt quỷ
Cao EtOH Cao n - hex Cao Chl Cao EtOAc
str R; Mau R; Mau R; Mau R; Mau
1 0,45 Tim 0,44 Tim 0,45 Tim | 0,67 | Nau
2 0,63 Tím 0,50 | Nâu 0,50 Nau | 0,71 Nâu
3 0,67 | Xanh 0,54 | Nâu 0,54 Nâu | 0,75 | Xanh 4 0,69 | Hông | 0,58 Nau 0,58 Nau | 0,77 | Xanh
5 0,71 Xanh | 0,63 Tím 0,63 Lục 0,83 Do
6 0,69 | Xanh | 0,66 | Vang 0,67 Vang | 0,85 | Xanh
7 0,83 Do 0,67 Tim 0,69 Tim | 0,89 | Vang
8 0,87 | Xanh | 0,69 | Xanh | 0,72 | Vang
9 0,89 | Vang | 0,71 Vang 0,74 Xanh
10 0,75 Nau 0,78 | Xanh
11 0,77 | Xanh | 0,83 Do
12 0,79 | Vang 0,86 xanh
13 0,83 Nau
14 0,87 | Vang
15 0,89 Nau
3.1.4. Dinh long polyphenol téng s6 cdc phan doan dich chiét[69]
Chúng tôi tiến hanh xac dinh ham hrong polyphenol téng sé trong cac
phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin - Ciocalteau. Kết quả định lượng được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Định lượng polyphenol tông số các phân đoạn dịch chiết dây
Mặt quỷ
- Khôi lượng Hàm lượng Thành
Phân đoạn cao(mg) OD 765 am Polyphenol han (%)
(mgt) | Punt”
EtOH 10 0,129 116,2 11,62
n-hex 10 0,057 44,2 4,42
Chl 10 0,097 84,2 8,42
EtOAc 10 0,155 142,2 14,22
Kết quả phân tích định lượng polyphenol tổng số cho thấy thành phần phần trăm polyphenol trong các phân đoạn dịch chiết là khác nhau. Trong cao phân đoạn EtOAc, thành phần polyphenol là cao nhất bằng 14,22%, thấp nhất là phân đoạn n — hexan chiếm 4,42%... Điều này phù hợp với tính chat vat lý
và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi phân cực và ít tan trong dung môi không phân cực. Chính vì polyphenol là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao nên chúng tôi quyết định chọn phân đoạn cao cồn tổng số và cao phân đoạn ethylaxetate và n — hexan của loài Mặt quý để tiến hành thực nghiệm trên mô hình chuột gây BP và ĐTĐ.
3.1.5. Thứ độc tính cấp, xác định LDạ của cao phân đoạn EtOH từ dây Mặt quỷ
Xác định LDao của dịch chiết EtOH dây Mặt quỷ trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke[58]. Chuột được nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần từ 4 - > 20 g mẫu/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết
trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết. Sau 7 ngày theo dõi không
thấy có con nào có biểu hiện yếu hay chết. Vì vậy chưa tính được LDso theo
đường uống. Điều đó chứng tỏ dịch chiết từ dây Mặt quỷ dudi dang cao dugc sử dụng bằng đường uống không gây độc cho chuột. Kết quả thể hiện ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Kết quả thử độc tính cấp theo đường uống cao phân đoạn
EtOH
Liều uống (mg/kg) Tổng số chuột Số chuột chết | % chuột chết
4000 10 0 0
8000 10 0 0
10000 10 0 0
12000 10 0 0
16000 10 0 0
20000 10 0 0