CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm [6]
Nguyên tắc: Sấy mẫu trong thời gian dài để tách lượng nước tự do và nước liên kết bên trong sản phẩm. Trong quá trình sấy cần theo dõi và cân khối lượng mẫu đến khi khối lượng lần trước và lần sau nó không thay đổi thì dừng sấy. Lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết được tính gián tiếp qua phần chất khô trước và sau sấy.
Công thức tính: Độ ẩm (W%) đƣợc tính theo công thức sau:
Trong đó:
G1: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g);
G2: Khối lƣợng mẫu sau khi sấy (g);
2.2.2. Phương pháp xác định phần trăm chất khô hòa tan
Xác định phần trăm chất khô hòa tan trong mẫu dùng phương pháp sấy đến khối lƣợng không đổi theo TCVN 5860 – 1994 [8].
Nguyên tắc: Sấy mẫu trong thời gian dài để tách hết lượng nước tự do và nước liên kết bên trong sản phẩm. Lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết, phần còn lại là chất khô.
Tiến hành: Giảm thể tích phần dịch chiết xuất bằng cô chân không tại 60ºC/- 0,8 atm trong 3 giờ, sau đó tiếp tục sấy khô chân không tại 60ºC/-0,8 atm tới khối lƣợng không đổi, lấy mẫu ra làm nguội cân xác định hàm lƣợng chất khô hòa tan.
Tiến hành ba mẫu song song, lấy kết quả trung bình của các mẫu.
Phần trăm chất khô hòa tan (C %) so với 100g nguyên liệu đƣợc xác định theo công thức sau:
HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 32 C % =
G1
x100 30xG
Trong đó:
G: khối lƣợng nguyên liệu ban đầu (100g)
30: hệ số chuyển đổi từ 3 kg nguyên liệu ban đầu
G1: Khối lƣợng chất khô hòa tan sau khi sấy từ 3 kg nguyên liệu ban đầu (g).
2.2.3. Định lượng β-glucan bằng phương pháp phenol-sulfuric [16]
Nguyên tắc: Phương pháp xác định hàm lượng β-glucan được tiến hành dựa trên phương pháp phenol-sulfuric của Michel. Dubois và cộng sự (1956), sử dụng D-glucose làm chất chuẩn, phenol sẽ kết hợp với cacbohydrate tạo phức. Phức chất này sẽ được hấp thụ tại bước sóng 490 nm.
Khi phức chất tạo ra càng nhiều, giá trị hấp thụ màu của phương pháp phenol-sulfuric ở bước sóng 490nm càng lớn. Hàm lượng β-glucan được xác định dựa trên độ tăng khả năng hấp thụ màu của hỗn hợp. Tùy từng điều kiện phương pháp phenol-sulfuric có độ chính xác đến ± 2%.
Tiến hành:
- Tủa β-glucan tổng: Giảm thể tích phần dịch chiết xuất bằng cô chân không tại 60ºC/-0,8 atm trong 3 giờ. Sau đó tủa dịch chiết bằng EtOH 96% tỷ lệ dịch chiết/ethanol 96% là 1/5 ở 10ºC trong 12 giờ, lọc và rửa tủa bằng EtOH 96% thu Tủa β-glucan tổng. Sấy khô chân không tủa tại 60ºC/-0,8 atm đến trọng lƣợng không đổi thu β-glucan tổng.
- Cân 1g β-glucan tổng, hòa tan trong 10ml nước cất được dung dịch đầu có nồng độ 0,1 g/ml. Pha loãng dung dịch đầu theo tỉ lệ xác định.
- Lấy 0,5ml dịch mẫu pha loãng lắc đều với 0,5ml dung dịch phenol 5%, bổ sung 2,5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng để hiện màu trong 30 phút.
- Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 490nm.
- Mẫu đối chứng dùng 0,5ml nước cất thay mẫu
HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 33 - Tất cả các thí nghiệm đƣợc lặp 3 lần rồi chọn giá trị trung bình.
- Từ hiệu số giá trị OD giữa dịch mẫu và mẫu đối chứng sẽ tính đƣợc hàm lƣợng β-glucan có trong mẫu bằng cách so sánh với giá trị OD của D-glucose chất chuẩn.
Xây dựng đường chuẩn:
- Pha phenol 5%: Cân 5g phenol, hòa tan trong bình định mức 100 ml bằng nước cất, sau khi phenol tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức.
- Cân 1g D-glucose tinh khiết (chất chuẩn), hòa tan trong bình định mức 1lít bằng nước cất, sau khi glucose tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức. Ta có dung dịch chuẩn với nồng độ 1mg/ml.
- Từ dung dịch chuẩn ta pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0, 25, 50, 75, 100, 125, 150 (àg/ml).
- Lấy 0,5 ml mỗi nồng độ chất chuẩn đƣa vào các ống nghiệm 5ml.
- Thêm lần lƣợt vào tất cả các ống nghiệm chuẩn 0,5 ml dung dịch phenol 5%, bổ sung 2,5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng để hiện màu trong 30 phút.
- Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 490nm . Kết quả xây dựng đường chuẩn:
Đường chuẩn β-glucan được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel đƣợc thể hiện ở phụ lục 1. Với trục tung là mật độ quang và trục hoành là nồng độ chất chuẩn. Phương trình thể hiện mối tương quan giữa D-glucose và OD 490nm là:
y = 0,006x + 0,0369 Trong đó, y: Giá trị mật độ quang ở 490nm (OD) x: Hàm lƣợng β-glucan sau pha loóng (àg/ml)
a,b: Trị số của phương trình đường chuẩn R2 = 0,9954 : hệ số tương quan.
Dựa vào đường chuẩn ta xác định được hàm lượng β-glucan có trong mẫu thí nghiệm theo công thức:
HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 34 X = x.n.m
C Trong đú, : X: Hàm lƣợng β-glucan (àg/g)
x.n: Hàm lƣợng β-glucan trong mẫu thớ nghiệm (àg/ml) x: Hàm lượng β-glucan xỏc định từ đường chuẩn (àg/ml) n: là hệ số pha loãng (lần)
m: Hàm lƣợng tủa β-glucan ban đầu (1 g) C: Nồng độ dung dịch mẫu ban đầu (0,1 g/ml)
2.2.4. Định lượng Diterpenoid bằng phương pháp chiết phân đoạn [24]
Mục đích: Đối với một vài nhóm chất, người ta có thể tách riêng từng phân đoạn khỏi hỗn hợp dựa vào lý hóa tính khác nhau của các chất thành phần nhƣ độ hòa tan trong các dung môi, tính acid hay base và độ mạnh của tính acid hay base.
Nguyên tắc: Để chiết các chất phân cực (các glucoside, các muối của alkaloid, các hợp chất polyphenol …) thì phải sử dụng các dung môi phân cực.
Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, diterpenoid, streroid tự do …) thì phải sử dụng dung môi kém phân cực. Người ta có thể dùng các dung môi có độ phân cực tăng dần để để chiết phân đoạn nhƣ: n – hexan D = 0, diclorometan D = 1,04 hoặc clorofrom, ethyl acetate D = 1,78, n – butanol D = 1,63 … (D là momen phân cực).
Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu tách chiết Erinacine Diterpenoid từ nấm Đầu khỉ bằng phương pháp chiết phân đoạn với ethyl acetate và nước [19][24][26][28][46].
Tiến hành:
- Cao Diterpenoid tổng: Giảm thể tích phần dịch chiết xuất sau khi lọc bằng cô chân không tại 60ºC/-0,8 atm trong 3 giờ thu Cao Diterpenoid tổng.
HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 35 - Sấy khô chân không cao chiết tại 60ºC/-0,8 atm đến trọng lƣợng không đổi.
- Sau đó pha với nước cất tỷ lệ 1:1 thu được dung dịch chiết.
- Chiết phân đoạn với dung môi ethyl acetate với tỷ lệ dung dịch chiết và dung môi 1:1 (Chiết làm 3 lần để hòa tan hết các chất).
- Gộp các phân đoạn chiết ethyl acetate sau đó đem cô chân không ở nhiệt độ 60ºC/-0,8 atm thời gian 2 giờ thu hồi dung môi thu cao chiết.
- Sấy khô chân không cao chiết thu đƣợc ở nhiệt độ 60ºC/-0,8 atm đến trọng lƣợng không đổi thu Diterpenoid thô, cân xác định hàm lƣợng.
2.2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Các thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên, lập lại ít nhất 3 lần. Số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm thống kê và thống kê toán học.
2.2.6. Lựa chọn nguyên liệu và điều kiện xử lý nguyên liệu để chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ
2.2.6.1. Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ.
Tiến hành: Mỗi mẫu 3 kg nấm Đầu khỉ, đƣợc khảo sát xác định nguồn nguyên liệu nấm Đầu khỉ đến khả năng thu nhận β-glucan và Diterpenoid, gồm:
Nấm Hưng Yên - Hà Nội, Vĩnh Yên – Vĩnh Phúc, Đơn Dương - Lâm Đồng, Đà Lạt – Lâm Đồng. Chiết xuất cùng điều kiện: Dung môi EtOH 50%/bột nấm là 5/1 (l/kg), kích thước nguyên liệu là 0,8 < d ≤ 2 mm, chiết xuất ở 60ºC trong 5 phút.
Chiết trên hệ thống chiết xuất sóng siêu âm: cường độ siêu âm 8 W/cm2, công suất 3 KW,tần số siêu âm 20 kHz, bể siêu âm dung tích 20 lít. Bã chiết xuất đƣợc rửa bằng dung môi chiết/nguyên liệu tỷ lệ là 1/1 (v/v). Dịch chiết và dịch rửa đƣợc gom lại đem lọc qua vải lọc một lần sau đó lọc 2 lần qua màng lọc kích thước 0,1àm. Dịch chiết được cụ chõn khụng ở nhiệt độ 60ºC/- 0,8 atm trong 3 giờ, sau đó tiến hành xác định phần trăm chất khô hòa tan nhƣ đã nêu mục 2.2.2 và định lượng β-glucan, Diterpenoid theo phương pháp đã nêu mục 2.2.3 và 2.2.4. Kết quả đƣợc làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 36 2.2.6.2. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ.
Tiến hành như mục 2.2.6.1. Khảo sát với các kích thước nguyên liệu (d) là:
5 < d; 2 < d ≤ 5; 0,8 < d ≤ 2 và d ≤ 0,8 (mm). Mẫu nấm đƣợc nghiền mịn thành các loại kích thước khác nhau bằng thiết bị nghiền. Kết quả được làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ.
2.2.7.1. Ảnh hưởng của dung môi tới khả năng chiết xuất Diterpenoid và β- glucan từ nấm Đầu khỉ.
Tiến hành nhƣ mục 2.2.6.1. Khảo sát với các loại dung môi sau: EtOH 0%
(nước cất), EtOH 20%, EtOH 40%, EtOH 60%, EtOH 80%, EtOH 90%, EtOH 96%. Kết quả đƣợc làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (DM/NL) tới khả chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ.
Mục đích: Nếu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thấp thì quá trình chiết là không triệt để. Nếu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi cao thì sẽ tốn kém dung môi và tốn năng lƣợng. Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp nhất tại đó hàm lƣợng β- glucan và diterpenoid thu đƣợc cao, nâng cao hiệu quả kinh tế.
Tiến hành: Tiến hành nhƣ mục 2.2.6.1. Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tại các tỷ lệ sau: 2/1; 3/1; 4/1; 5/1; 6/1; 7/1 (l/kg). Kết quả đƣợc làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7.3. Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm tới khả chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ.
Tiến hành: Tiến hành như mục 2.2.6.1. Khảo sát tại các điều kiện cường độ siêu âm nhƣ sau: 2 w/cm²; 4 w/cm²; 6 w/cm²; 8 w/cm². Kết quả đƣợc làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm tới khả chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ.
HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 37 Tiến hành: Tiến hành nhƣ mục 2.2.6.1. Khảo sát tại các điều kiện thời gian xử lý sóng siêu âm nhƣ sau: 0,5 phút; 1 phút; 1,5 phút; 2 phút; 3 phút; 4 phút; 5 phút; 6 phút. Kết quả đƣợc làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả chiết xuất Diterpenoid và β-glucan từ nấm Đầu khỉ.
Tiến hành: Tiến hành nhƣ mục 2.2.6.1. Khảo sát tại các điều kiện nhiệt độ nhƣ sau: 40ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC, 65ºC. Kết quả đƣợc làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.8. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng chế phẩm Heri-Ultra T.
2.2.8.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc chân không tới khả năng thu Cao Diterpenoid tổng và Tủa β-glucan tổng từ nấm Đầu khỉ.
Tiến hành nhƣ mục 2.2.6.1. Khảo sát các điều kiện nhiệt độ cô đặc nhƣ sau: 40ºC, 50ºC, 60ºC, 70ºC, 80ºC. Kết quả đƣợc làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.8.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy chân không tới chất lượng chế phẩm Heri-Ultra T.
Tiến hành nhƣ mục 2.2.6.1. Cao Diterpenoid tổng và Tủa β-glucan tổng thu đƣợc sẽ đƣợc trộn bằng máy trộn và tạo hạt, thời gian trộn khoảng 10 phút, đƣợc hỗn hợp Cao Diterpenoid tổng và Tủa β-glucan tổng. Tiến hành sấy chân không áp suất -0,8 atm, trong thời gian 60 phút tạo đƣợc chế phẩm Heri-Ultra T.
Tiến hành khảo sát các điều kiện nhiệt độ sấy chân không nhƣ sau: 40ºC, 50ºC, 60ºC, 70ºC, 80ºC. Kết quả đƣợc làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
HV: Nguyễn Thị Lan Anh_CB130691 38 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN