PHẦN II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.2. Phương pháp nghiên cứu
II.2.2. Các phương pháp phân tích
Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105oC (AOAC, 1984) [5].
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Phạm Công Thành
Học viên: Đinh Thị Kim Hoa Lớp cao học thực phẩm 2008 - 2010 32 II.2.2.2. Xác định hàm lượng protein
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry [5]
Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein với thuốc thử folin. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang điện của dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa vào đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử này có thể tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Thuốc thử:
- Dung dịch A: gồm Na2CO3 2% pha trong NaOH 0.1%
- Dung dịch B: gồm CuSO4.5H2O 0.5% pha trong Natri Citrate 1%
- Dung dịch C: là hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỷ lệ 50:1 - Thuốc thử folin 0.1N.
Chuẩn bị mẫu: Đồng hóa 3g mẫu đã được nghiền nhỏ với 27 ml dung dịch Sodium doceylsulfate (SDS) nóng 85oC nồng độ 5% ở tốc độ 3 – 4 vòng /phút trong 1 phút. Hỗn hợp sau khi đồng hóa được ủ ở nhiệt độ 90oC trong thời gian 30 phút, sau đó làm nguội và li tâm ở nhiệt độ thường 9000 vòng/phút trong thời gian 15 phút.
Hút 1ml dịch tronng và thêm vào 9ml nước cất lắc đều, sau đó hút ra 25 àl hỗn hợp rồi thờm 75àl nước cất vào ống nghiệm.
Tiến hành: Lấy 100àl hỗn hợp mẫu đó được chuẩn bị ở trờn rồi thờm vào 1ml dung dịch , lắc đều để yên 10 phút ở nhiệt độ thường. Sau đó thêm vào 0.1 ml thuốc thử folin, lắc đều. Qua 30 phút màu vàng cúa hỗn hợp chuyển sang màu xanh thẫm. Đo cường độ màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng λ= 660nm. Hàm lượng protein tính theo đường chuẩn của protein tinh khiết.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Phạm Công Thành
Học viên: Đinh Thị Kim Hoa Lớp cao học thực phẩm 2008 - 2010 33 Xây dựng đường chuẩn của protein tinh khiết: Pha dung dịch Bovine serum albumin (BSA) 1mg/ml với các nồng độ 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.5; 0.7; 1 mg/ml. Lấy chính xác 0.5 ml dung dịch ở mỗi nồng độ vào các ống nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch C, lắc đều để yên 10 phút ở nhiệt độ thường. Sau đó thêm vào 0.25 ml thuốc thử folin lắc đều. Qua 30 phút màu vàng chuyển sang xanh thẫm, đo cường độ màu của hỗn hợp. Dựa vào số liệu đo được và hàm lượng protein mà dựng đồ thị đường chuẩn :Trục tung là mật độ quang điện, trục hoành là hàm lượng protein [5].
II.2.2.3. Xác định hàm lượng oligopeptide
Xác định hàm lượng oligopeptide bằng phương pháp Lowry [5].
Nguyên tắc: Tương tự như II.2.2.2.
Chuẩn bị mẫu: Đồng hóa 3g mẫu với 27 ml Trichloroacetid acid (TCA) lạnh 4oC nồng độ 5% ở tốc độ 3 – 4 vòng/phút trong 1phút, sau đó ủ ở nhiệt độ 4oC trong thời gian 30 phút. Lấy 1ml dịch trong li tâm ở tốc độ 9000 vòng/phút, ở nhiệt độ 4oC trong 15 phút. Các mẫu được giữa trong đá để xác định hàm lượng oligopeptide theo phương pháp Lowry và được biểu thị bằng mM/ml Tyrozine
Thuốc thử: dung dịch A, dung dịch B, dung dịch C, folin 0.1N.
Tiến hành: Lấy 100 àl dung dịch mẫu đó được chuẩn bị ở trờn cho vào ống ngiệm, thêm vào 1ml dung dịch C, lắc đều để yên 10 phút ở nhiệt độ thường, sau đó thêm vòa 0.1 ml thuốc thử folin, lắc đều. Qua 30 phút màu vàng chuyển sang màu xanh thẫm, đo cường độ màu hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng λ= 750nm. Nồng độ oligopeptide tính theo đường chuẩn protein tinh khiết
Xây dựng đường chuẩn Tyrosine: Pha các dung dịch mẫu trong đó có chứa Tyrosine 1mM/ml với các nồng độ 0; 0.01; 0.02; 0.03; 0.05; 0.07; 0.1 mM/ml.
Tiến hành đo như miêu tả trên. Dựa vào số liệu đo và hàm lượng oligopeptide dựng đồ thị đường chuẩn: Trục tung là mật độ quang điện, trục hoành là hàm lượng Tyrozine
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Phạm Công Thành
Học viên: Đinh Thị Kim Hoa Lớp cao học thực phẩm 2008 - 2010 34 II.2.2.4. Xác định hàm lượng lipit
Xác định hàm lượng lipit bằng phương pháp Soxlet (AOAC, 1984) [5].