THUỐC THỬ FOLIN-CIOCALTEU
39.1. LÝ THUYẾT
Hợp chất polyphenol trong cây chè thuộc nhóm tannin không thủy phân được hay còn gọi là nhóm tannin ngưng tụ, tanin pyrocatechin. Polyphenol chè tan trong cồn, aceton, etyl acetate, khó tan trong nước, không tan trong dung môi kém phân cực như hexan, ether dầu hỏa, benzen. Tạo phức bền với albumin hay gelatin.
Nguyên tắc:
Polyphenol từ phần mẫu thử của lá chè đã nghiền mịn được chiết bằng metanol 70 % ở 70 °C. Chè hòa tan được hòa trong nước nóng được bổ sung 10 % (thể tích) axetonitril để ổn định dịch chiết. Các polyphenol trong dịch chiết được xác định bằng đo màu, dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu. Thuốc thử này chứa chất oxi hóa là axit phospho-vonframic, trong quá trình khử, các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxi hóa, chất oxi hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm. Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden. Các thuốc thử Folin- Ciocalteu phản ứng với nhiều hợp chất polyphenol và mặc dù có thể có đáp ứng khác nhau với các hợp chất đơn lẻ, thì việc lựa chọn axit gallic làm chất chuẩn hiệu chuẩn cũng giúp ích cho việc thu được dữ liệu polyphenol tổng số.
39.2. HÓA CHẤT
Thuốc thử Folin – ciocalteau Dung dịch Na2CO3 20%
Gallic Nước, Axetonitril.
Metanol.
Hỗn hợp chiết metanol/nước, 70 % metanol v/v
Thuốc thử Folin-Ciocalteu loãng, 10 % v/v
Dung dịch natri cacbonat 7.5 % w/v: Cân (37.50 ± 0.01) g natri cacbonat khan (Na2CO3) cho vào bình định mức 500 ml. Thêm nước ấm đủ đến nửa bình. Lắc để hòa tan natri cacbonat, để nguội đến nhiệt độ phòng, định mức đến vạch.
Dung dịch chuẩn gốc axit gallic 1000 àg/ml: Cõn (0.110 ± 0.001) g axit gallic ngậm một phân tử nước (M = 188.14) cho vào bình định mức 100 ml. Hòa tan trong nước, định mức đến vạch.
Lưu ý: Axit gallic ngậm một phân tử nước tốt hơn ở dạng khan, vì có độ hòa tan cao hơn, đã khử đặc tính hút ẩm và có sẵn loại đã được chứng nhận. Nếu chưa biết độ ẩm thì cần xác định độ ẩm (hao hụt khối lượng ở 103 °C) trên một phần mẫu chuẩn.
Sau đó, có thể tính nồng độ của dung dịch chuẩn gốc theo axit gallic khan.
4.9. Dung dịch chuẩn axit gallic: từ A đến E
Dùng pipet chuyển các thể tích dung dịch chuẩn gốc axit gallic (4.8) trong Bảng 1 vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng đến vạch bằng nước và lắc. Chuẩn bị dung dịch chuẩn pha loãng này trong ngày sử dụng.
39.3. DUNG CỤ, THIẾT BỊ Cân phân tích
Máy ly tâm
Máy đo quang phổ Pipet
Bình định mức một vạch Becher 250mL
Ống đong
Bình định mức 100mL Cối, chày
Máy ly tâm
Máy đo quang, cuvet Tủ sấy
Cân
Mẫu chè hòa tan: Cân (0,500 ± 0,001) g mẫu thử cho vào bình định mức 50 ml.
Thêm khoảng 25 ml nước nóng (nhiệt độ tối đa 60°C) vào bình định mức. Trộn đều để hòa tan mẫu và để nguội đến nhiệt độ phòng.
Thêm 5,0 ml axetonitril. Định mức đến vạch bằng nước cất. Đây là dịch chiết Dùng pipet chuyển 1,0 ml dịch chiết vào bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng nước cất.
STT 0 1 2 3 4 M1 M2 M3
Gallic 100 àg/ml, ml 0 1 2 3 4 0 0 0
Dịch mẫu, ml 0 0 0 0 0 3 3 3
Folin-Ciocalteu 10%, ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Đợi 5 phút
Na2CO3 7.5%, m 2 2 2 2 2 2 2 2
Nước cất 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 2.5 2.5 2.5
Để yên 30 phút Mật độ đo quang A
39.5. TÍNH TOÁN KẾT QUẢ
Hàm lượng polyphenol tổng được tính theo công thức sau:
Polyphenol tổng = , μg/l Trong đó:
Cx: hàm lượng polyphenol tổng trong mẫu đo quang, μg/l Vdm: thể tích định mức, ml
Vm: thể tích dịch mẫu, ml
Vđo: thể tích định mức ống nghiệm m: khối lượng mẫu ban đầu, g
BÀI 40. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PH VI SAI
40.1. LÝ THUYẾT
Giới thiệu chung:
Anthocyanin là những glucozit do gốc đường glucose, glactose... kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin). Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào pH, các chất màu và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH môi trường. Thông thường khi pH < 7 các anthocyanin có màu đỏ, khi pH > 7 thì có màu xanh. Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH = 4 5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu, ở pH = 7 8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh.
Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong vùng khả kiến, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510540nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin:
thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh.
Nguyên tắc
Chất màu anthocyanin thay đổi theo pH. Tại pH = 1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH = 4.5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu.
40.2. HÓA CHẤT HCl đậm đặc Cồn
Nước cất
40.3. DUNG CỤ, THIẾT BỊ Becher 250mL
Ống đong
Bình định mức 100mL Cối, chày
Ống ly tâm
Máy lọc chân không Máy ly tâm
Máy đo quang, cuvet Tủ sấy
Cân 40.4. CÁCH TIẾN HÀNH
Chuẩn bị dịch chiết tách anthocyanin:
Cân 5 – 10 g mẫu với độ chính xác 0.001g. Nghiền nhỏ, ngâm mẫu đã nghiền với khoảng 100 ml dung môi etanol – nước 1:1 có 1% HCl đậm đặc trong 60 phút. Sau đó đem lọc chân không thu phần dịch lọc. Định mức bằng dung môi etanol – nước 1:1 thành 100ml. Tiếp tục ly tâm dịch lọc trong 10 phút, tách lấy dịch trong, đem phân tích hàm lượng anthocyanin.
Tiến hành:
Pha loãng dịch trích ở trên theo độ pha loãng K lần lượt bằng dung dịch đệm pH
= 1 và dung dịch đệm pH = 4.5 thu được dịch trích pha loãng 1 (M1) và dịch trích pha loãng 2 (M2), để ổn định trong 15 phút.
Sử dụng nước cất để chỉnh độ hấp thu của máy quang phổ về 0 tại các bước sóng λmax pH = 1, λmax pH = 4.5 và λ = 700nm.
Đo mật độ quang của dịch trích pha loãng M1, M2 ở pH=1 và pH= 4.5 tại bước sóng hấp thụ cực đại và tại bước sóng 700 nm
40.5. TÍNH TOÁN
Xác định lượng anthocyanin theo công thức l g
V K M
a A ;
. . . .
= (2)
Trong đó: A = (Amax.pH=1 – A700nm.pH=1) - (Amax.pH= 4,5 – A700nm.pH= 4,5)