Phương pháp sinh học phân tử hiện đại

I.3. Các phương pháp phát hiện tác nhân vi khuẩn

I.3.2. Phương pháp sinh học phân tử hiện đại

I.3.2.1.1 Định nghĩa:

Polymerase Chain Reaction (PCR) là quá trình khuếch đại đoạn trình tự DNA mục tiêu trong điều kiện in vitro theo chu kỳ nhiệt, với sự tham gia của cặp mồi và sự xúc tác của enzyme DNA polymerase [1,3].

I.3.2.1.2 Nguyên tắc:

Phản ứng PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau (khoảng 30 – 40 chu kỳ), mỗi chu kì gồm 3 bước cơ bản:

(1) DNA khuôn mẫu bị biến tính thành mạch đơn ở nhiệt độ cao.

(2) Mồi xuôi và mồi ngược với bản chất là oligonucleotide mạch đơn sẽ bắt cặp bổ sung với trình tự mục tiêu ở nhiệt độ lai thích hợp. Mồi được bắt cặp với mạch khuôn đã biến tính để tạo một vị trí khởi đầu cho quá trình tổng hợp một phân tử DNA mới, mồi có thể đặc hiệu với một trình tự nucleotide riêng biệt hoặc chúng có thể là mồi phổ quát (universal), cặp mồi phổ quát bắt cặp bổ sung với trình tự

nucleotide chung trong một tập hợp nhiều phân tử DNA đặc biệt [36].

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 14 (3) Kéo dài mạch DNA, sự khuếch đại trình tự mục tiêu được thực hiện có sự

tham gia của enzyme polymerase, các đoạn mồi và mạch khuôn DNA. Một chu kì được lặp lại nhiều lần với các DNA mới được tổng hợp được xem là mạch khuôn, cộng thêm vào lượng DNA mục tiêu ban đầu, sự khuếch đại theo lũy thừa của các trình tự DNA với 2 mồi oligonucletide làm cho số lượng bản sao tăng lên hàng triệu lần [25,42].

Giai đoạn (1) là giai đoạn biến tính (denaturation): tách phân tử DNA mạch kép thành mạch đơn ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường 94oC – 95oC trong vòng 30 giây – 1 phút, các enzyme lúc này chưa hoạt động [36]

Giai đoạn (2) là giai đoạn bắt cặp của mồi lên mạch khuôn (annealing): Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn DNA thường là 50oC – 65oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Liên kết được hình thành giữa mồi và gen mục tiêu là liên kết hydrogen, trong giai đoạn này polymerase có thể đính kèm và chuẩn bị sao chép các mẫu.

Giai đoạn (3) là giai đoạn kéo dài (elongation): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC là nhiệt độ lý tưởng cho enzyme DNA polymerase (là enzyme chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp, kéo dài mạch tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Các thành phần cần thiết trong phản ứng PCR [2,3]:

− DNA mạch khuôn (đoạn DNA cần khuếch đại).

− Cặp mồi đặc hiệu, bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn, có bản chất là đoạn oligonucleotide khoảng 15 – 30 nucleotide, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

− Dung dịch đệm (buffer) thích hợp cho phản ứng PCR gồm các thành phần KCl, Tris - HCl pH 8,3.

− Cofactor Mg2+ dưới dạng MgCl2.

− Hỗn hợp các cơ chất ở dạng dNTP (deoxynucleoside triphosphate) gồm 4 loại:

dGTP, dATP, dTTP, dCTP.

− Enzyme Taq DNA Polymerase (enzyme chịu nhiệt).

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 15 Hình I.1. Nguyên tắc phương pháp PCR

Ưu điểm của phương pháp PCR là thời gian thực hiện nhanh, đơn giản và ít tốn kém, độ tinh sạch của mẫu DNA không cần cao, cho phép thực hiện với nguồn mẫu ở dạng bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc [2,4].

Multiplex PCR:

I.3.2.2.1 Định nghĩa:

Multiplex PCR (phản ứng PCR đa cặp mồi) là phương pháp PCR cải tiến, có hai hoặc nhiều trình tự DNA mục tiêu được khuếch đại đồng thời trong cùng một phản ứng PCR với sự tham gia của nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau [28,42].

I.3.2.2.2 Nguyên tắc:

Đối với phản ứng multiplex PCR, mỗi cặp mồi được thiết kế để khuếch đại một trình tự gen mục tiêu với kích thước sản phẩm khác nhau, các cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR cần có nhiệt độ bắt cặp tối ưu và xấp xỉ nhau, không có sự bắt cặp giữa các mồi, nồng độ mồi, Mg2+, các dNTPs tự do và enzyme polymerase được điều chỉnh phù hợp cho việc tổng hợp các gen được quan tâm [14,42].

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 16 Phương pháp multiplex PCR có ưu điểm là cho kết quả nhanh chóng, có độ nhạy và độ đặc hiệu, giảm chi phí thực hiện, khắc phục được nhược điểm của phương pháp PCR thông thường [14,41]. Tuy nhiên, kỹ thuật này có thể tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu.

Molecular Hybridization (lai phân tử) I.3.2.3.1 Định nghĩa:

Lai phân tử (molecular hybridization) diễn ra khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên đến nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) thì các liên kết hydro nối liền hai mạch sẽ bị phá vỡ, hai mạch sẽ tách rời nhau. Sau đó, nhiệt độ được làm giảm từ từ trong điều kiện thí nghiệm thích hợp, các liên kết hydro giữa hai mạch sẽ được hình thành, theo nguyên tắc bổ sung hình thành phân tử mạch đôi (DNA mục tiêu – mẫu dò) [1].

I.3.2.3.2 Nguyên tắc:

Phương pháp lai phân tử bao gồm các giai đoạn: tổng hợp mẫu dò, đánh dấu mẫu dò, biến tính DNA mục tiêu, chuyển DNA lên màng lai, tiến hành lai, đọc kết quả [9].

Trong phản ứng lai phân tử, sử dụng các mẫu dò bản chất là đoạn oligonucleotide được đánh dấu, có đặc điểm đặc trưng phù hợp với điều kiện lý hóa trong quá trình lai, sử dụng để phát hiện sự hiện diện các trình tự nucleic acid đặc hiệu trong hỗn hợp nhiều trình tự nucleic acid. Kỹ thuật lai được sử dụng nhiều nhất là kỹ thuật lai trên màng lai (membrane hybridization). DNA hoặc RNA mục tiêu bị biến tính và gắn cố định vào một màng lai, giữ ở trạng thái trơ để chúng không tự tái bắt cặp trở lại. Sau đó, phản ứng lai xảy ra giữa phân tử acid nucleic mục tiêu với các phân tử mẫu dò được đánh dấu. Bước rửa màng lai cho phép rửa trôi các phân tử mẫu dò không gắn được với DNA mục tiêu (mẫu dò tự do) [25,33].

Đặc điểm của quá trình lai phân tử [1]:

− Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung dẫu chúng chỉ có hai bản sao nằm lẫn giữa hàng triệu trình tự khác.

− Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA - DNA, RNA - RNA hay DNA - RNA.

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 17

− Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai, lực ion của môi trường.

Phương pháp Microarray:

I.3.2.4.1 Định nghĩa:

Phương pháp DNA Microarray có nguyên lý hoạt động dựa trên kỹ thuật lai phân tử, được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu cấp độ phân tử, phát hiện hàng trăm/hàng nghìn các gen khác nhau trong cùng một phản ứng [28].

I.3.2.4.2 Nguyên tắc:

Kỹ thuật này sử dụng hệ nhiều mẫu dò khác nhau đặc hiệu với một hay nhiều gen nhất định được đánh dấu huỳnh quang, các mẫu dò thường là các đoạn oligonucleotide được cố định trên giá thể lai. Trình tự gen mục tiêu lai với mẫu dò

theo nguyên tắc lai phân tử trên pha rắn. Có hệ thống thiết bị tự động đặt mẫu và đọc tín hiệu huỳnh quang (hoạt động theo nguyên tắc “dò tìm” – scanning - tín hiệu huỳnh quang tại từng điểm hay từng khu vực của array, sau đó được chuyển thành tín hiệu số và xử lý bằng các phần mềm vi tính chuyên dụng) [1,28].

Ưu điểm của phương pháp Microarray là có thể phát hiện đặc hiệu nhiều trình tự gen cùng một lúc, được đánh giá là một công nghệ đáng tin cậy, có tiềm năng được ứng dụng để phát hiện nhanh và chính xác nhiều loài vi sinh vật (vi khuẩn).

Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi chi phí cao cho việc đầu tư thiết bị [28].

Phương pháp Reverse Dot Blot (RDB) [48]

I.3.2.5.1 Định nghĩa:

Reverse Dot Blot (RDB) là một phương pháp lai phân tử cải tiến, phương pháp sử dụng mẫu dò oligonucleotide đặc hiệu cho trình tự mục tiêu gắn cố định trên màng lai (màng Nitrocellulose). Bổ sung các sản phẩm PCR đánh dấu biotin đã biến tính – được khuếch đại từ DNA mục tiêu tách chiết từ các mẫu thực nghiệm (mẫu thực phẩm, mẫu bệnh phẩm), cặp mồi gắn biotin. Từ đó kết quả lai được phát hiện dựa vào sự phát màu giữa enzyme AP (alkaline phosphatase) và streptavidine với cơ chất NBT/BCIP (Nitrobluetetrazdium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) [48].

I.3.2.5.2 Nguyên tắc:

Phản ứng RDB gồm các phản ứng chính:

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 18

− Biến tính sản phẩm PCR được đánh dấu biotin.

− Trong quá trình mẫu dò (đoạn oligonucleotide) được tổng hợp, đầu 5’ của mẫu dò được gắn thêm nhóm amin NH2.

− Xử lý màng, màng lai được hoạt hóa bởi EDC (1-ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl]) và gắn mẫu dò vào màng lai.

− Lai sản phẩm PCR đã biến tính với các mẫu dò đặc hiệu với nhiệt độ thích hợp.

− Phát hiện tín hiệu lai dựa vào hoạt động của streptavidine – AP (alkaline phosphatase) và cơ chất NBT/BCIP (Nitrobluetetrazdium/5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate).

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 19 Chú thích: (1): Biến tính sản phẩm PCR được đánh dấu biotin

(2): Xử lý màng và gắn mẫu dò vào màng lai.

(3): Lai sản phẩm PCR đã biến tính với các mẫu dò đặc hiệu với nhiệt độ thích hợp.

(4): Phát hiện tín hiệu lai.

Hình I.2. Nguyên tắc phản ứng lai RDB

Ưu điểm của phương pháp RDB là không sử dụng các chất phóng xạ, tiện lợi, thiết thực, không đòi hỏi kỹ thuật cao, phù hợp để phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh [40]. Trong nghiên cứu của Fiss và cs (1992) ghi nhận được phương pháp RDB cho kết quả nhanh, rút thời gian chỉ còn 1 – 2 ngày (thay vì 2 – 8 tuần ở các phương pháp nuôi cấy sử dụng chất phóng xạ), đồng thời quy trình sử dụng mẫu dò đặc hiệu, cho phép phát hiện và xác định được các chủng vi khuẩn Mycobacteria đến mức loài, với độ nhạy phát hiện được vi sinh vật ở nồng độ 102 CFU/ml [15].

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 20 I.4. Các công trình nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sinh học