III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
III.2. Kết quả khảo sát in silico
III.2.4. Khảo sát bộ mẫu dò
Đối với chuyên đề nghiên cứu này, mẫu dò là thành phần quan trọng không thể thiếu trong phản ứng Reverse Dot Blot, mẫu dò phải bắt cặp đặc hiệu với đoạn trình
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 48 tự mục tiêu trong vùng khuếch đại của cặp mồi 16S-F, 16S-R và 23S-F, 23S-R đối với từng loài vi khuẩn.
Chúng tôi sử dụng công cụ tin sinh BLAST trên NCBI để so sánh độ tương đồng của trình tự mẫu dò với các trình tự gen vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra vị trí bắt cặp đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn với đoạn trình tự mục tiêu và nằm trong vùng khuếch đại của cặp mồi 16S-F, 16S-R hoặc cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng phần mềm Annhyb 4.946.
Khảo sát mẫu dò SAL:
Công cụ BLAST và phần mềm Annhyb được dùng để kiểm tra độ đặc hiệu, vị trí bắt cặp của mẫu dò SAL. Kết quả cho thấy mẫu dò SAL bắt cặp đặc hiệu với chi Salmonella spp. Kết quả này được thể hiện ở hình III.11, III.12.
Hình III.11. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SAL
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 49 Hình III.12. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAL bằng công cụ
Annhyb
Dựa vào kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAL bằng công cụ Annhyb cho thấy mẫu dò SAL bắt cặp đặc hiệu với trình tự gen của vi khuẩn Salmonella enterica (CP007421.1) tại vị trí 452 – 481, nằm trong vùng khuếch đại của cặp mồi 16S-F, 16S-R.
Khảo sát mẫu dò VPA:
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 50 Hình III.14. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò VPA bằng công cụ
Annhyb
Hình III.13. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò VPA
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 51 Dựa vào kết quả khảo sát mẫu dò VPA bằng công cụ BLAST và Annhyb, chúng tôi ghi nhận mẫu dò VPA có độ tương đồng cao so với trình tự gen của các loài Vibrio parahaemolyticus, mẫu dò bắt cặp đặc hiệu với trình tự gen của loài Vibrio parahaemolyticus (EU60326.1) tại vị trí 63 - 98 và không có khả năng bắt cặp với các chủng vi khuẩn còn lại. Vị trí bắt cặp của mẫu dò VPA với trình tự gen loài Vibrio parahaemolyticus (EU60326.1) nằm trong vùng khuếch đại của mồi 16S-F, 16S-R.
Khảo sát mẫu dò SAU:
Hình III.15. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SAU
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 52 Hình III.16. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAU bằng công cụ
Annhyb
Chúng tôi sử dụng công cụ BLAST và Annhyb để kiểm tra độ đặc hiệu của mẫu dò SAU, kết quả ghi nhận được khả năng bắt cặp đặc hiệu của mẫu dò SAU với trình tự gen của các loài vi khuẩn Staphylococcus aureus, cụ thể là trình tự Staphylococcus aureus (CP007690.1) mẫu dò bắt cặp tại vị trí 450 – 495, không có khả năng bắt cặp với các chủng vi khuẩn khác. Vị trí bắt cặp của mẫu dò nằm trong vùng khuếch đại của mồi 16S-F, 16S-R.
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 53 Khảo sát mẫu dò CPE:
Hình III.17. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò CPE
Hình III.18. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CPE bằng công cụ Annhyb
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 54 Dựa vào kết quả khảo sát mẫu dò CPE bằng công cụ BLAST và Annhyb, chúng tôi ghi nhận mẫu dò CPE có độ tương đồng cao so với trình tự gen của các loài Clostridium perfringens, mẫu dò bắt cặp đặc hiệu với trình tự gen của Clostridium perfringens (CP000246.1) tại vị trí 190 - 237 và không có khả năng bắt cặp với các chủng vi khuẩn khác. Kết quả này ghi nhận tính phù hợp của mẫu dò CPE là mẫu dò
đặc hiệu cho tác nhân vi khuẩn Clostridium perfringens.
Khảo sát mẫu dò CBO:
Hình III.19. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò CBO
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 55 Hình III.20. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CBO bằng công cụ
Annhyb
Kết quả khảo sát mẫu dò CPE bằng công cụ BLAST và Annhyb ở hình III.19 và III.20 cho thấy mẫu dò CBO có độ tương đồng cao so với trình tự gen của các loài Clostridium botulinum, mẫu dò bắt cặp đặc hiệu với trình tự gen của Clostridium botulinum (AM412317.1) tại vị trí 144 - 181 và không có khả năng bắt cặp với các chủng vi khuẩn khác. Sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 423 – 463 bp. Kết quả này ghi nhận tính phù hợp của mẫu dò CBO là mẫu dò đặc hiệu cho chủng Clostridium botulinum.
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 56 Khảo sát mẫu dò SHI:
Hình III.21. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SHI
Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SHI ghi nhận mẫu dò SHI có độ tương đồng cao với trình tự gen của các loài thuộc chi Shigella spp.
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 57 Hình III.22. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SHI bằng công cụ
Annhyb
Dựa vào kết quả hình III.22 chúng tôi ghi nhận đối với trình tự gen của Shigella spp. (GQ403792.1), cặp mồi 16S-F, 16S-R khuếch đại đoạn sản phẩm có kích thước 451 – 490 bp và mẫu dò SHI bắt cặp đặc hiệu tại vị trí 579 – 608, nằm trong đoạn sản phẩm khuếch đại đó. Kết quả trên cho thấy mẫu dò SHI thích hợp được chọn làm mẫu dò đặc hiệu của các loài thuộc chi Shigella spp.