III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
III.3. Kết quả thực nghiệm
III.3.3. Kết quả lai RDB
Ứng dụng quy trình RDB (bộ Kit RDB – VA.A92 – 0036A của công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á) trên sản phẩm PCR khuếch đại vùng trình tự gen 16S rRNA, chúng tôi xác định tính chất nhiễm các tác nhân vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên một số mẫu thịt heo tươi. Quy trình lai được thực hiện theo quy trình đã được trình bày trong phần II.2.3.6.
Kết quả phân tích ở mẫu M1 (mẫu thịt heo số 1), chúng tôi xác định có tín hiệu lai tại vị trí mẫu dò của Clostridium perfringens (Hình III.26 a). Từ đó, chúng tôi ghi nhận mẫu M1 nhiễm Clostridium perfringens.
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 61 Chú thích: (a): Màng lai RDB cho kết quả dương tính tại vị trí mẫu dò Clostridium perfringens; (b): Sơ đồ vị trí mẫu dò trên màng lai
Hình III.26 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M1
Nhằm khẳng định tính chính xác của kết quả lai RDB đối với mẫu thịt heo số 1 (mẫu M1), chúng tôi tiến hành giải trình tự gen mẫu M1 (kết quả gtt_M1F), được thể hiện ở phụ lục 4. Chúng tôi sử dụng công cụ BLAST để xác định độ tương đồng của trình tự gtt_M1F với trình tự gen 16S rRNA của các loài vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu NCBI, ghi nhận được kết quả giải trình tự gen gtt_MF1 có độ tương đồng cao với trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn Clostridium perfringens (Hình III.27), độ bao phủ (Query cover) trong khoảng 66% – 75%, giá trị % tương đồng (Ident) khoảng 88% . Kết quả khảo sát này phù hợp với kết quả lai RDB.
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 62 Hình III.27. Kết quả BLAST trình tự gtt_M1F
Tiếp theo, mẫu M2 (mẫu thịt heo số 2) cho tín hiệu lai tại vị trí mẫu dò
Clostridium perfringens, Shigella trên màng lai (Hình III.28 a). Kết quả khẳng định tính chất nhiễm đồng thời Clostridium perfringens, Shigella spp. trên mẫu thịt heo số 2.
Chú thích: (a): Màng lai RDB cho kết quả dương tính tại vị trí mẫu dò Clostridium perfringens và Shigella; (b): Sơ đồ vị trí mẫu dò trên màng lai
Hình III.28 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M2
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 63 Phân tích kết quả lai ở mẫu M3 (mẫu thịt heo số 3), chúng tôi ghi nhận có tín hiệu lai tại vị trí mẫu dò của vi khuẩn Salmonella spp., Clostridium botulinum, Bacillus cereus và Clostridium perfringens (Hình III.29 a). Từ đó, chúng tôi xác định mẫu M3 nhiễm đồng thời 4 chủng vi khuẩn Clostridium botulinum, Bacillus cereus và Clostridium perfringens, Salmonella spp.
Chú thích: (a): Màng lai RDB cho kết quả dương tính tại vị trí mẫu dò Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Salmonella, Bacillus cereus; (b): Sơ đồ vị trí mẫu dò trên màng lai
Hình III.29 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M3
Sau đó, chúng tôi ghi nhận mẫu M4 và M5 (mẫu thịt heo số 4 và số 5) cho kết quả dương tính trong phản ứng lai RDB, cả hai mẫu đều cho tín hiệu lai tại vị trí của mẫu dò Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Salmonella, Shigella. Kết quả khẳng định tính chất nhiễm đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Salmonella spp., Shigella spp. trên mẫu thịt heo số 4 và số 5 (Hình III.30 a và Hình III.31 a).
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 64 Chú thích: (a): Màng lai RDB cho kết quả dương tính tại vị trí mẫu dò Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Salmonella, Shigella; (b): Sơ đồ vị trí mẫu dò trên màng lai
Hình III.30 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M4
Chú thích: (a): Màng lai RDB cho kết quả dương tính tại vị trí mẫu dò Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Salmonella, Shigella; (b): Sơ đồ vị trí mẫu dò trên màng lai
Hình III.31 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M5
Riêng đối với mẫu M6 (mẫu thịt heo số 6), chúng tôi ghi nhận không có tín hiệu lai. Mẫu M6 có kết quả dương trong kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình III.25), cho vạch sản phẩm có kích thước 500 bp nhưng lại cho kết quả âm tính với phản ứng lai RDB.
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 65 Chú thích: (a): Màng lai RDB cho kết quả âm tính; (b): Sơ đồ vị trí mẫu dò trên màng lai
Hình III.32 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M6 Nguyên nhân dẫn đến kết quả RDB âm tính
Có thể do mẫu thịt heo M6 không có sự hiện diện hoặc có với mật độ rất ít các tác nhân vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Hơn nữa, kết quả PCR cho kết quả dương tính, điều này có ý nghĩa là phản ứng PCR khuếch đại thành công vùng trình tự gen 16S rRNA của các loài vi khuẩn với bộ mồi phổ quát. Tuy nhiên, có thể các loài vi khuẩn nhiễm vào mẫu M6 không thuộc danh mục 12 loài vi khuẩn được bố trí mẫu dò trên màng lai. Kết quả phân tích đối với mẫu M6 cần được kiểm chứng bằng kỹ thuật phân tích vi sinh truyền thống, nhằm khẳng định sự hiện diện của các tác nhân vi khuẩn, cụ thể là 6 tác nhân trong mục tiêu nghiên cứu (Salmonella spp., Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Shigella spp., Vibrio parahaemolitycus, Staphylococcus aureus).
Bảng III.10. Mức độ nhiễm đồng thời các vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên mẫu thịt heo tươi
Mẫu
12 mẫu dò của vi khuẩn đường ruột trên màng lai Mức độ nhiễm đồng thời P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12
M1 N N N N N P N N N N N N 1
M2 N N N N N P N P N N N N 2
M3 P N N P P P N N N N N N 4
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 66
M4 P N N P N P N P N N N N 4
M5 P N N P N P N P N N N N 4
M6 N N N N N N N N N N N N 0
Chú thích:
P1: mẫu dò của Salmonella P2: mẫu dò của Brucella
P3: mẫu dò của Escherichia O157:H7 P4: mẫu dò của Clostridium botulinum P5: mẫu dò của Bacillus cereus
P6: mẫu dò của Clostridium perfringens
P7: mẫu dò của Vibrio parahaemolyticus P8: mẫu dò của Shigella
P9: mẫu dò của Vibrio cholerae
P10: mẫu dò của Listeria monocytogens P11: mẫu dò của Staphylococcus aureus P12: mẫu dò của Yerssina enterocolitica P: Positive (kết quả dương tính)
N: Negative (kết quả âm tính)
Chúng tôi ghi nhận 5/6 mẫu (83,3%) mẫu thịt heo nhiễm vi khuẩn gây bệnh đường ruột, trong đó 3/6 mẫu (50%) nhiễm đồng thời 4 tác nhân vi khuẩn. Trong đó, mẫu M3 nhiễm vi khuẩn Salmonella spp., Clostridium botulinum, Bacillus cereus và Clostridium perfringens (3/6 vi khuẩn mục tiêu nghiên cứu); mẫu M4 và M5 nhiễm Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Salmonella spp., Shigella spp. (4/6 vi khuẩn mục tiêu). Bên cạnh đó, 1/6 mẫu (16,7%) nhiễm đồng thời 2 tác nhân (Clostridium perfringens, Shigella spp.) và 1/6 mẫu (16,7%) nhiễm duy nhất một tác nhân vi khuẩn đường ruột (Clostridium perfringens).
Đồng thời, chúng tôi ghi nhận tác nhân vi khuẩn Clostridium perfringens xuất hiện ở nhiều mẫu thịt heo (mẫu M1, M2, M3, M4 và M5). Nguyên nhân là do Clostridium perfringens thuộc nhóm trực khuẩn Gram dương (+), có khả năng sinh bào tử, có thể tồn tại trong ruột non của người và động vật, bùn đất, vết máu đông, dẫn đến nhiễm vào thực phẩm (thịt heo tươi) trong quá trình giết mổ, sơ chế.