III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
III.2. Kết quả khảo sát in silico
III.2.3. Khảo sát bộ mồi phổ quát
Trong phản ứng PCR, mồi là một thành phần quan trọng, cặp mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình tự lặp lại trên gen [1]. Đồng thời, trình tự nucleotide trong mỗi mồi sử dụng trong phản ứng PCR không cho phép có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược, không tạo cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi. Mồi được bắt cặp với mạch khuôn đã biến tính để tạo một vị trí khởi đầu cho quá trình tổng hợp một phân tử DNA mới. Mồi có thể đặc hiệu với một trình tự nucleotide riêng biệt hoặc chúng có thể là mồi phổ quát (universal primers). Cặp mồi phổ quát bắt cặp bổ sung với trình tự nucleotide chung trong một tập hợp nhiều phân tử DNA đặc biệt [36].
Chúng tôi sử dụng công cụ IDT analyzer để khảo sát các thông số vật lý và độ đặc hiệu hệ mồi, các thông số quan trọng như chiều dài mồi, thành phần %GC, nhiệt
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 39 độ nóng chảy (Tm), khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc, primer - dimer của hệ thống mồi [1,36]. Kết quả được ghi nhận trong bảng III.6.
Bảng III.6. Bảng thông số vật lí của bộ mồi 16S-F, 16S-R và 23S-F, 23S-R Ký
hiệu mồi
Trình tự (5’ → 3’) Kích
thước %GC Tm 1 2 3
Kích thước
sản phẩm
16S-F
5’ –
CTGGCGGCAGGC CTAACACAT – 3’
21 61,9 62,6 -1,5 -12,47
-6,69 500 bp 16S-R
5’ –
GGCTGCTGGCAC GGAGTTAG – 3’
20 65 60,9 -1,5 -5,09
23S-F
5’ –
ACCGATAGTGAA CCAGTACCGTGA
G – 3’
25 52 59,8 0,67 -3,65
-5,02 640 bp
23S-R
5’ –
TTAAATGATGGC TGCTTCTAAGCC
– 3’
24 41,7 55,6 -2,29 -7,81
Chú thích: (1): là mức năng lượng tự do (ΔG) hình thành cấu trúc hairpin loop - sự tự bắt cặp giữa các base trong cùng một oligonucleotide (kcal.mole-1).
(2): là mức năng lượng tự do (ΔG) hình thành cấu trúc homo - dimer - hai oligonucleotide giống nhau tự bắt cặp (kcal/mole).
(3): là mức năng lượng tự do (ΔG) hình thành cấu trúc hetero - dimer - các oligonucleotide khác nhau bắt cặp với nhau (kcal/mole).
Bảng III.6 cho thấy chiều dài của các mồi dao động trong khoảng 20 – 25 bp.
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 40 Hơn nữa, tất cả trình tự mồi có tỷ lệ GC phù hợp, khoảng 50% – 60%. Việc thiết kế mồi tránh lặp lại các base G hay C liên tiếp dài hơn 4 base để hạn chế sự tạo thành cấu trúc kẹp tóc, dẫn đến phản ứng PCR kém hiệu quả. Tại đầu 3’ của mồi, cần có base G hay C để tăng độ đặc hiệu cho bắt cặp.
Trong phản ứng PCR, nhiệt độ nóng chảy của các mồi (Tm) cũng là thông số rất quan trọng, dựa trên đó mà ta có thể quyết định nhiệt độ ủ (bắt cặp) trong chu trình PCR cho thích hợp, cần duy trì nhiệt độ nóng chảy Tm trong khoảng 50oC - 65oC. Theo thông tin trong bảng III.6 cho thấy, Tm của các mồi là phù hợp, nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không nên quá 5oC.
Hơn nữa, giá trị tuyệt đối của ΔG (sự biến đổi năng lượng tự do, Gibbs free energy, đơn vị kcal/mole) hình thành các cấu trúc thứ cấp nhỏ hơn 9 kcal/mole, điều này là phù hợp, hạn chế các mồi tự bắt cặp với nhau, tránh ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR. Trường hợp mồi 16S-F có giá trị ΔG là -12,47 kcal/mole, không đảm bảo điều kiện, do vậy chúng tôi lưu ý trong nội dung thực nghiệm nhằm đảm bảo phản ứng PCR đạt hiệu quả.
Thông qua các tiêu chí về chiều dài, thành phần %GC, nhiệt độ nóng chảy, giá trị ΔG, chúng tôi nhận thấy cặp mồi 16S-F, 16S-R và 23S-F, 23S-R phù hợp với mục tiêu khuếch đại trình tự vùng gen 16S rRNA, 23S rRNA của các loài vi khuẩn đường ruột và phù hợp với khuyến cáo của hãng IDT.
Kết quả phân tích cặp mồi 16S-F, 16S-R:
Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi 16S-F, 16S-R với các trình tự tham chiếu, thông qua các công cụ như Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) trên NCBI và phần mềm Bioedit. Kết quả được ghi nhận ở hình III.1, III.2, III.3, III.4.
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 41 Hình III.1. Kết quả BLAST trình tự mồi 16S-F
Hình III.2. Kết quả BLAST trình tự mồi 16S-R
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 42 Hình III.3. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 16S-F và trình tự
16S rDNA bằng công cụ Bioedit
Hình III.4. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 16S-R và trình tự
16S rDNA bằng công cụ Bioedit
Dựa vào kết quả khảo sát bằng công cụ BLAST và phần mềm Bioedit, chúng tôi ghi nhận trình mồi 16S-F và 16S-R có độ tương đồng cao so với trình tự gen 16S rRNA của nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột điển hình như các loài Vibrio parahaemolyticus, Salmonella enterica, Shigella spp., Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus,… Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng công cụ BLAST được tóm tắt trong bảng III.7.
Bảng III.7. Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng công cụ BLAST
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 43 Hình III.5. Kết quả phân tích trình tự cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng phần mềm
Annhyb
Vi khuẩn Mồi Các giá trị
Độ bao phủ % tương đồng
Shigella spp. 16S-F 100% 100%
16S-R 100% 100%
Vibrio parahaemolyticus
16S-F 100% 100%
16S-R 100% 100%
Salmonella spp.
16S-F 100% 100%
16S-R 100% 100%
Clostridium perfringens
16S-F 66% 100%
16S-R 100% 95%
Clostridium botulinum
16S-F 100% 90%
16S-R 100% 95%
Staphylococcus aureus
16S-F 76% 100%
16S-R 95% 95%
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 44 Kết quả phân tích trình tự cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng công cụ Annhyb cho thấy trình tự mồi 16S-F (mồi xuôi) bắt cặp tại vị trí 9 – 29 và mồi 16S-R (mồi ngược) bắt cặp tại vị trí 490 – 509 của trình tự gen 16S rRNA của chủng Vibrio parahaemolyticus (CP003972.1), cặp mồi này cũng bắt cặp đặc hiệu với các chủng vi khuẩn Salmonella spp. (JX888136.1), Staphylococcus aureus (CP007690.1), Shigella spp.
(GQ403792.1),... (Phụ lục 2).
Cặp mồi 16S-F, 16S-R khuếch đại sản phẩm có kích thước dự kiến trong khoảng 461 – 500 bp, phù hợp với kết quả công bố của công trình nghiên cứu cùng nhóm.
Kết quả phân tích cặp mồi 23S-F, 23S-R:
Hình III.6. Kết quả BLAST trình tự mồi 23S-F
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 45 Hình III.7. Kết quả BLAST trình tự mồi 23S-R
Kết quả khảo sát bằng công cụ BLAST ghi nhận trình mồi 23S-F, 23S-R có độ tương đồng cao với trình tự gen 23S rRNA của nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột điển hình như các loài Vibrio parahaemolyticus, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus,... (Phụ lục 3). Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng công cụ BLAST được tóm tắt trong bảng III.8.
Bảng III.8. Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng công cụ BLAST
Vi khuẩn Mồi Các giá trị
Độ bao phủ % tương đồng Staphylococcus
aureus
23S-F 100% 100%
23S-R 100% 100%
Vibrio parahaemolyticus
23S-F 100% 100%
23S-R 100% 100%
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 46 Clostridium
perfringens
23S-F 100% 100%
23S-R 70% 100%
Salmonella spp.
23S-F 100% 100%
23S-R 100% 100%
Clostridium botulinum
23S-F 100% 100%
23S-R 96% 96%
Shigella spp. 23S-F 100% 100%
23S-R
Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 23S-F, 23S-R và trình tự
23S rDNA bằng công cụ Bioedit được thể hiện trong hình III.8 và III.9.
Hình III.8. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 23S-F và trình tự
23S rDNA bằng công cụ Bioedit
Hình III.9. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 23S-R và trình tự
23S rDNA bằng công cụ Bioedit
SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH 47 Hình III.10. Kết quả phân tích trình tự cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng phần mềm
Annhyb
Chúng tôi tiến hành khảo sát vị trí bắt cặp của trình tự cặp mồi 23S-F, 23S-R, kích thước sản phẩm sau khuếch đại bằng phần mềm Annhyb 4.946. Kết quả khảo sát ghi nhận trình tự mồi 23S-F và mồi 23S-R bắt cặp với trình tự 23S rDNA của vi khuần Vibrio parahaemolyticus (CP003972.1), mồi 23S-F bắt cặp tại vị trí 432 – 456 và mồi 23S-R bắt cặp tại vị trí 1049 – 1072. Đồng thời, cặp mồi 23S-F, 23S-R bắt cặp đặc hiệu với các trình tự gen 23S rRNA của các chủng vi khuẩn Clostridium perfringens (47118322), Staphylococcus aureus (CP007690.1),... (Phụ lục 3).
Theo kết quả khảo sát, cặp mồi 23S-F, 23S-R khuếch đại sản phẩm có kích thước dự kiến trong khoảng 593 – 640 bp, phù hợp với kết quả công bố của công trình nghiên cứu cùng nhóm.