Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tạo cây cà chua chuyển gen
(Phương pháp chuẩn đang được sử dụng tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học)
Chuẩn bị nguyên liệu chuyển gen
Biến nạp
Đồng nuôi cấy
Diệt khuẩn
Chuẩn bị vi khuẩn A.
tumefaciens
Tái sinh chồi chuyển gen
Tạo cây hoàn chỉnh
Phân tích cây trồng chuyển gen
Ra cây trồng trong bầu đất
Đánh giá sinh lý cây trồng
chuyển gen
Bảng 2.1: Môi trường nuôi và chọn lọc cây cà chua chuyển gen STT Môi trường Ký hiệu Thành phần môi trường
1 Gieo hạt tạo mầm cây
SM MS + 15 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH=5,8 2 Đồng nuôi cấy CCM MS + 2 ml/l BAP + 2 ml/l NAA + 1 ml/l
AS + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH = 5,8 3 Tái sinh chồi chọn
lọc
SMT MS + 50 mg/l Kanamycin + 250 mg/l Cefotaxime + 1,8 mg/l Zeatin + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH = 5,8.
4 Chọn lọc cây chuyển gen (ra rễ)
RMT MS + 0,3 mg/l IBA + 50 mg/l Kanamycin + 400 mg/l Cefotaxime + 15 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH = 5,8.
a) Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens
- Khuẩn được lấy từ chủng gốc lưu giữ ở -80oC hoặc khuẩn có sẵn trong đĩa petri được nuôi mới trên môi trường LB đặc trong petri 2-3 ngày (Sử dụng khuẩn trong vòng 3 tuần trên môi trường LB đặc).
Bảng 2.2: Thành phần môi trường LB đặc
Thành phần Khối lƣợng
(trong 1 lit môi trường)
Yeast extract 5 g
NaCl 10 g
Trypton 10 g
Bactoagar 15 g
- Lấy 1 khuẩn lạc riêng biệt, phát triển tốt trên đĩa khuẩn cấy cho vào 10 ml môi trường LB (có thể thay bằng YEB lỏng) có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/l và kháng sinh rifamycin 50 mg/l, nuôi qua đêm ở điều kiện nhiệt độ 28oC trong tủ lắc (200 vòng/ phút). Lấy 5 ml dich khuẩn chuyển sang 70 ml LB lỏng mới
(không bổ sung kháng sinh) nuôi phục hồi khoảng 4h là sử dụng được (Thể tích khuẩn nuôi thay đổi tùy theo lượng mẫu nhiều hay ít).
- Ly tâm dịch khuẩn 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu lấy cặn tế bào vi khuẩn. Sau đó, hòa tan cặn khuẩn trong môi trường 1/2 MS lỏng (hoặc có thể thay bằng dung dịch 2% MSO), pH = 5,8, đến mật độ khuẩn đạt giá trị OD600 = 0,6, để biến nạp vào tế bào thực vật.
- Thành phần môi trường như sau:
MSO 2% (1 lít) 1/2 MS (1 lít)
MS Satls 4,3 g MS I: 10 ml, MS II → V: 5 ml
pH 5,8
Myo-inositol 100 mg
Thiamine HCl (1mg/ml) 0,4 ml
Sucrose 20 g
AS 100 àM
b) Tạo nguyên liệu chuyển gen
*Gieo hạt cà chua:
- Khử trùng hạt bằng ethanol 70% trong 1 phút, sau đó tráng qua bằng nước cất khử trùng 1 lần.
- Tiếp đó cho dung dịch Javen 30%, lắc đều (không cần liên tục) trong vòng 20 phút, sau đó chắt hết phần nước Javen, tráng qua bằng nước cất khử trùng nhiều lần (5 lần).
- Cho hạt ra khay cấy đặt sẵn giấy lọc khử trùng, thấm khô hạt, đặt hạt vào môi trường nảy mầm (SM) trong bình tam giác. Đặt bình chứa hạt vào tối 24 giờ, sau đó đặt ra giàn nuôi (250C, chu kỳ sáng 16 giờ).
- Sau 7 – 8 ngày, hạt tái sinh thành cây mầm được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu.
*Chuẩn bị mẫu lá mầm:
- Cắt hết những phần cây đã đủ điều kiện cho ra đĩa có chứa nước cất khử trựng (hoặc cắt trong ẵ MS) cú bổ sung 1 mg/lớt Zeatin. Sau đú dựng dao cắt hai
đầu của lá mầm gây tổn thương. Để mẫu vào bình tam giác chứa môi trường 1/2 MS lỏng có bổ sung 1 mg/lít Zeatin để mẫu tươi trước khi biến nạp.
c) Lây nhiễm và đồng nuôi cấy
- Chuẩn bị môi trường đồng nuôi cấy (môi trường CCM) và dung dịch hòa tan khuẩn luụn bổ sung 100 àM AS.
- Gạn hết môi trường 1/2 MS trong bình tam giác có đặt mẫu lá mầm.
- Lây nhiễm khuẩn:
+ Gắp riêng một đĩa lá mầm làm đối chứng (không nhiễm khuẩn)
+ Sau đó rót dịch khuẩn vào bình tam giác, lắc không liên tục trong 30 phút.
- Đồng nuôi cấy:
+ Sau 30 phút, chắt hết dịch khuẩn. Gắp hết các mẫu lá mầm đưa ra trên giấy lọc khử trùng, thấm khô, đặt mẫu trên môi trường đồng nuôi cấy ở đĩa petri (mẫu thấm khô cần được gắp chia đều vào các đĩa petri để tránh mẫu bị khô do quạt box cấy). Lưu ý khi gắp cần để 2 đầu lá mầm phải tiếp xúc mới môi trường. Đậy nắp petri lại, quấn bằng parafil.
+ Đặt các đĩa petri đồng nuôi cấy vào tủ tối 250C trong 48h.
d) Chọn lọc và tái sinh cây
- Chuẩn bị môi trường tái sinh SMT1-50 (thành phần như trong bảng 2.3) và môi trường SMT1-0 để làm đối chứng gồm: MS + 1,8 mg/l Zeatin + 30 g/l Sucrose + 7,5 g/l agar, pH = 5,8.
- Gắp ẵ đĩa đối chứng (khụng lẫy nhiễm khuẩn) của mẫu đồng nuụi cấy cho vào đĩa petri chứa môi trường SMT1-0.
- Gắp ẵ đĩa đối chứng (khụng lẫy nhiễm khuẩn) của mẫu đồng nuụi cấy cho vào đĩa petri chứa môi trường SMT1-50.
- Các mẫu đã đồng nuôi cấy được rửa khuẩn bằng nước cất khử trùng có bổ sung cefotaxime 500 mg/lít cho đến khi nước trong (6 – 7 lần). Sau đó các mẫu được thấm khô trên giấy thấm khử trùng và được cấy vào đĩa petri có chứa môi trường tái sinh (môi trường SMT1-50).
- Sau 2 tuần, các mẫu đã ra mầm hoặc còn xanh thì được chuyển sang môi trường tái sinh (SMT mới) có bổ sung 1 mg/lít zeatin và kháng sinh chọn lọc kanamycin nồng độ 50 mg/lít.
e) Ra rễ và ra đất trồng
- Khi chồi cây cao khoảng 2-3 cm thì được cắt sát gốc và cấy sang môi trường ra rễ có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l. Những chồi nào phát sinh rễ được chuyển sang môi trường nhân nhanh, một phần cây thì lưu giữ còn một phần thì tiếp tục cho ra rễ để trồng ra bầu đất.
- Những cây phát sinh rễ (chiều dài rễ khoảng 2-4 cm) thì được trồng ra bầu đất (chăm sóc trong điều kiện tối ưu trong 1 tuần trước khi đưa ra ngoài nhà lưới).